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Artigo de método

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

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DOI:

10.3791/52523

⸱

25 de março de 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, Kansas State University, 2Department of Medical and Molecular Genetics, Indiana University School of Medicine, 3Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, 4Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 5Department of Entomology, Kansas State University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

Resumo

Mosquitos vetores infligir sofrimento mais humano do que qualquer outro organismo - e matar mais de um milhão de pessoas a cada ano. Os projetos mosquito genoma facilitou a pesquisa em novas facetas da biologia do mosquito, incluindo estudos genéticos funcionais no principal vetor Africano malária Anopheles gambiae eo dengue e amarelo vetor da febre Aedes aegypti. ARN de interferência (RNAi-) silenciamento de genes mediado foi usado para genes alvo de interesse em ambas as espécies de mosquito vector doença. Aqui, descrevemos um procedimento para a preparação de quitosana / interferindo nanopartículas de RNA que são combinados com alimentos e ingeridos pelas larvas. Este, de alto rendimento tecnicamente simples, relativamente barato e metodologia, que é compatível com o RNA de cadeia dupla de comprimento (dsRNA) ou pequenos ARN interferentes (siRNA) moléculas, tem sido utilizado para o knockdown bem sucedida de um número de diferentes genes em A. gambiae e A. aegyptilarvas. Após as mamadas larvais, knockdown, o que é verificado através de qRT-PCR ou hibridação in situ, podem persistir pelo menos até a fase de pupa tarde. Esta metodologia pode ser aplicada a uma grande variedade de espécies de mosquitos e outros insectos, incluindo pragas agrícolas, bem como outros organismos não-modelo. Para além da sua utilidade no laboratório de investigação, no futuro, o quitosano, um polímero barato, não-tóxicos e biodegradáveis, podem ser potencialmente utilizados no campo.

Introdução

Mosquitos sanguíneos que alimentam vetor dos gêneros de anofelinos e aedine transmitir agentes causadores de doenças responsáveis ​​por vários dos piores flagelos da humanidade. Estima-se que 3,4 bilhões de pessoas estão em risco de contrair a malária, que é responsável por mais de meio milhão de mortes por ano em todo o mundo. Resultados da malária de infecção por Plasmodium sp., Que parasita, que são transmitidos às pessoas através da picada de mosquitos infectados do gênero Anopheles, incluindo o principal vector Africano Anopheles gambiae ( http://www.who.int/topics/malaria/en/ , 2014) 1. Aedes aegypti é o mosquito vector primário para o vírus da dengue, o que provoca a febre de dengue, uma doença febril não específica que é a doença mais comum e arbovírus significativa no mundo. O vírus da dengue é, actualmente, uma ameaça para a> 2,5 bilhões de pessoas nos trópicos, com uma inciden anualce de cerca de 50 milhões de casos, resultando em ~ 24 mil mortes por ano ( http://www.cdc.gov/dengue/ , 2014) 2. Apesar do impacto mundial devastador de doenças transmitidas por mosquitos na saúde humana, meio eficaz de prevenir e tratar essas doenças estão faltando. Controle do mosquito é atualmente o melhor método de prevenção da doença.

O potencial para o controle de doenças transmitidas por artrópodes pela manipulação genética de insetos vetores tem sido reconhecida por mais de quatro décadas 3. Estirpes transgénicas de A. aegypti projetado para ter um específico feminino repressible flightless fenótipo fizeram recentemente o potencial para o uso de estratégias de controle de vetores transgênicos uma realidade 4-6. Estes avanços têm desafiado os pesquisadores a identificar alvos genéticos novos para controle do vetor e meios adicionais de manipular a função do gene em mosquitos vetores. A alteração da expressão gênica durante desenvolvimento, como foi o caso em mosquitos fêmeas flightless-4, pode promover a elucidação de novas estratégias de controle do vetor. No entanto, em grande parte devido a dificuldades técnicas, as funções de muito poucos genes foram caracterizadas durante o desenvolvimento de A. gambiae, A. aegypti, ou outras espécies de mosquitos.

Desde a sua descoberta em C. elegans 7, a interferência de RNA (RNAi), que é conservado em animais, plantas e microrganismos, tem sido amplamente utilizada para estudos genéticos funcionais em uma ampla variedade de organismos, incluindo insectos 8,9. A via de RNAi é iniciada por Dicer, que cliva o ARNcd longos em curtos siRNAs de 20-25 nucleótidos de comprimento, que funcionam como ARN de interferência específica da sequência. silenciar genes siRNAs que são complementares em sequência através da promoção de mudança de transcritos, segmentação, e rompimento de tradução 9. Longas moléculas de dsRNA (tipicamente 300-600 pb) ou siRNAs segmentação personalizada uma particulasequência r pode ser utilizado no laboratório de pesquisa para silenciar qualquer gene de interesse. Ao gerir quando interferência RNA é entregue, os pesquisadores podem controlar o tempo no qual gene silenciar iniciados. Esta vantagem é útil como ele pode ser usado para superar desafios como a letalidade de desenvolvimento ou esterilidade, que pode dificultar a produção e manutenção de cepas de rolamento mutações hereditárias, um processo caro e trabalhoso, que ainda não está disponível em todas as espécies de insetos. Embora o grau de silenciamento de genes por RNAi pode variar de gene para gene, tecido para tecido e animal para animal, RNAi é amplamente utilizado para a análise funcional de genes em mosquitos e outros insectos 8,9.

Três estratégias que interferem entrega ARN têm sido usados ​​em mosquitos: microinjecção, aplicação de imersão / tópica, e ingestão. Para uma história detalhada e comparação da utilização destas três técnicas de insectos, por favor, referir-se a Yu et al 8. We foram utilizados com sucesso microinjecção 10 como um meio de entrega de siRNAs para alvejar genes de desenvolvimento em A. embriões aegypti, larvas, pupas e 11-14. No entanto, esta estratégia de entrega de trabalho intensivo requer tanto uma configuração de microinjeção e uma mão hábil. Além disso, a microinjeção é estressante para o organismo, um fator de confusão, especialmente quando fenótipos comportamentais serão avaliados. Por fim, a entrega microinjeção não pode ser estendida para o campo para o controle de vetores. Como alternativa, a imersão do organismo em interferir solução RNA também tornou-se um meio popular de induzir o silenciamento de genes, como é conveniente e requer pouco equipamento ou de trabalho. De imersão tem sido principalmente aplicado na linha celular de insecto estuda 8, mas num estudo recente, foi conseguida em knockdown A. aegypti imerso numa solução de ARNcd de 15, o que os animais pareceram ser ingestão. No entanto, para os estudos que envolvem a análise de múltiplos experimentagrupos l ou fenótipos, imersão é bastante dispendioso. Lopez-Martinez et al., 16 descrito reidratação impulsionada RNAi, uma nova abordagem para entrega de RNA interferente que envolve a desidratação em solução salina e de re-hidratação com uma única gota de água contendo ARN interferente. Esta abordagem não reduzir os custos associados com a imersão dos animais todo, mas é mais caro do que a microinjecção e pode ser limitado na sua aplicação a espécies que podem tolerar elevadas pressões osmóticas. Além disso, é difícil imaginar como a imersão ou desidratação / reidratação metodologia de imersão poderia ser adaptado para o controle do vetor no campo. Por estas razões, para estudos de pós-embrionárias, a entrega de RNA de interferência com os alimentos ingeridos é uma estratégia alternativa viável.

Embora estratégias baseadas ingestão não funcionam em todas as espécies de insetos, talvez mais notavelmente Drosophila melanogaster, a administração oral de RNA de interferência misturado com alimentos promoveu si genelencing em uma variedade de insectos 8,17, incluindo A. adultos aegypti 18. Descrevemos quitosano mediada por ARNi de nanopartículas em A. larvas gambiae 19 e têm aplicado com sucesso esta abordagem para a redução da expressão do gene em A. aegypti 20,21. Aqui, a metodologia para este processo de RNAi, que envolve o aprisionamento de ARN interferente por o polímero de quitosano, é detalhado. Quitosano / ARN interferentes nanopartículas são formadas por auto-montagem de policatiões com ARN interferente através das forças electrostáticas entre cargas positivas dos grupos amino na quitosana e as cargas negativas transportadas por os grupos fosfato na espinha dorsal de ARN de interferência 19. O procedimento descrito é compatível com ambas as moléculas de dsRNA longos (a seguir denominados dsRNA) ou dupla siRNA (doravante referida como siRNA). Após a síntese, o quitosano / interferentes nanopartículas de ARN são misturados com comida de larvas e entregue aolarvas através da ingestão oral. Esta metodologia é relativamente barato, requer pouco equipamento e mão de obra 19, e facilita a análise de alto rendimento de vários fenótipos, incluindo a análise de comportamentos 20,21. Esta metodologia, que pode ser adaptado para estudos de silenciamento de genes em outros insectos, incluindo outros vectores de doenças e pragas de insectos agrícolas, poderia potencialmente ser usada para o silenciamento do gene numa variedade de outras espécies animais. Além disso, o quitosano, um polímero barato, não-tóxica e biodegradável 22, poderia potencialmente ser utilizada no campo de controlo de mosquitos específica da espécie.

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Protocolo

1. Mosquito Espécies e Empinar

  1. Manter A. gambiae G3 e A. estirpes aegypti Liverpool IB12 (utilizadas nos estudos representativos abaixo) ou outras estirpes de interesse de acordo com a prática padrão do laboratório ou como descrito anteriormente 23,24.

2. dsRNA e siRNA Design e Produção

  1. Iniciadores de design para a construção de modelos de ARNcd longos específicos para o gene de interesse. Use a ferramenta E-RNAi 25. Produzir ARNcd de acordo com o método de escolha ou como previamente descrito 19.
    1. Para um controlo negativo, sintetizar dsRNA 19 que corresponde à sequência de proteína fluorescente verde (GFP), β-galactosidase (β-gal), ou algum outro gene não expresso em mosquitos. Se assim for desejado, o dsRNA 19 utilizados para gerar os resultados representativos resumidos abaixo pode ser utilizada como um controlo positivo. Loja dsRNA dissolvido em água livre de RNAse a -80 °; C até ser necessário.
  2. Alternativamente, siRNA específico do gene de criação de acordo com a prática padrão do laboratório ou como previamente descrito 10. Codificar a sequência de um siRNA knockdown para conceber siRNA controlo negativo que não corresponde a qualquer gene de mosquito. Compre os siRNAs personalizados, que estão disponíveis através de um número de fornecedores de confiança.
    1. Se assim for desejado, os siRNAs 20,21 utilizado para obter os resultados representativos resumidos abaixo podem ser utilizados como controlos positivos. Loja siRNA dissolvido em água isenta de RNase à temperatura de -80 ° C até ser necessário.

3. Preparação de quitosano / ARN interferente Nanopartículas

  1. Reunir RT sulfato de sódio pré-fabricados 100 mM (100 mM de Na 2 SO 4 em H2O desionizada) e acetato de sódio 0,1 M (0,1 M de NaC 2 H 3 O 2 -0,1 M de ácido acético, pH 4,5 em água desionizada H2O) tampões.
  2. Dissolver quitosana (≥75%desacetilada) em tampão de acetato de sódio 0,1 M para tornar a 0,02% (w / v) de solução de trabalho e manter a solução à temperatura ambiente antes da sua utilização.
  3. Dissolve-se ou siRNA dsRNA em 50 ul de H2O desionizada e adicioná-lo ao tampão de sulfato de sódio 100 mM a fazer uma solução de 100 ul de 32 mg de dsRNA / siRNA por 100 ul de sulfato de sódio 50 mM.
  4. Adicionar 100 ul de solução de quitosano à solução de dsRNA / siRNA e, em seguida, aquecer a mistura num banho de água a 55 ° C durante 1 min. Defina-se um controlo por adição de 100 ul de sulfato de sódio 50 mM a 100 ul de solução de quitosano e seguem o mesmo procedimento.
  5. Misturar as soluções imediatamente durante 30 seg por vórtice de alta velocidade à TA para facilitar a formação de nanopartículas.
  6. Centrifuga-se a mistura a 13.000 xg durante 10 min à temperatura ambiente, tempo após o qual uma pastilha deve ser visível. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Secar o pellet para ≈10 min à temperatura ambiente antes de usá-lo para preparar a comida mosquito.
  7. Medir a concentração de ARNcd / siARN no sobrenadante, utilizando o sobrenadante de controlo (ver 3.5), um espaço em branco para calcular a quantidade total de dsRNA / siRNA que permaneceu no sobrenadante. Use a diferença entre os valores de partida de dsRNA / siRNA e valores remanescentes nos sobrenadantes para calcular a porcentagem de dsRNA / siRNA aprisionado nas nanopartículas. Esta eficiência de carga é normalmente superior a 90%.
  8. Repita o mesmo procedimento se são necessários mais nanopartículas. Use as nanopartículas secas imediatamente. O impacto do armazenamento a frio de partículas antes do uso não foi avaliado.

4. Preparando Mosquito Alimentos que contém quitosana / interferência RNA Nanopartículas

  1. Preparar 1 mL de uma solução de agarose a 2% (w / v) em água desionizada, derreter a agarose, e manter a solução de agarose fundida em um banho de água 55 C antes da utilização.
  2. Misture os flocos de comida de peixe (proteína bruta de 47%, min. Gordura bruta de 10%, no máximo. Fibra bruta 3%) e levedura seca em umproporção de 2: 1 (w / w). Moer a mistura de pequenas partículas com um almofariz e pilão (passável através No. 50 EUA peneiro standard). Use a comida solo, que deve ser de cor acastanhada, imediatamente ou armazená-lo em um recipiente fechado a 4 ° C durante várias semanas.
  3. Em um tubo de 1,5 mL, 6 mg de misturar alimentos chão com as nanopartículas secas a partir da Secção 3.7 com um palito.
  4. Adicionar 30 ul de solução de gel de agarose a 2% pré-fundido para a mistura de alimentos-nanopartícula; agitar imediata e cuidadosamente usando um palito ou pipeta de ponta.
  5. Use o gel contendo alimentos e nanopartículas para alimentar as larvas do mosquito imediatamente. Alternativamente, uma vez que o gel é solidificado completamente à TA, armazenar o gel a 4 ° C e usar no dia seguinte, ou a -80 ° C para uso posterior.

5. Alimentação larvas do mosquito com alimentos que contenham Quitosana / interferência RNA Nanopartículas

  1. Alimentação A. gambiae larvas de mosquito:
    1. Retirar a sipellet gel ngle do tubo de 1,5 ml usando um palito e corte-o em 6 fatias iguais, usando uma lâmina de barbear limpa ou palito de dentes.
    2. Transferência de 20 larvas de terceiro instar de um prato Petri de 500 ml contendo 100 ml de água desionizada.
    3. Alimentar as larvas do mosquito, adicionando uma fatia do pellet gel (finamente picado em pedaços menores) por placa de Petri, uma vez por dia durante quatro dias. Certifique-se de observar a alimentação das larvas no sedimento, que deve ser significativamente reduzida ou completamente ausente no dia seguinte. Depois de um tempo, os mosquitos irá desenvolver em larvas de quarto instar tarde.
    4. Registre quaisquer alterações fenotípicas visíveis durante o experimento. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na secção 6, no final do período de quatro dias.
  2. Alimentação A. aegypti larvas de mosquito:
    1. Corte o pellet gel em 6 fatias iguais usando uma lâmina de barbear limpa ou palito.
    2. Coloque 50 sincronizado-idade de 24 horas após a eclosão do ovo filarvas primeiro numa placa de petri em ≈40 mL de água desionizada.
    3. As larvas alimentam uma fatia por placa de Petri, durante 4 h / dia, em seguida, transferir as larvas de volta para a dieta larval regular de 2: 1 Terra peixes flocos de alimentos e de fermento seco para o resto do dia. Repita o procedimento diariamente ao longo dos quatro estágios larvais.
    4. Examinar os níveis de transcrição e outras alterações fenotípicas como discutido na seção 6 aos desejados pontos de tempo de desenvolvimento.

6. Confirmação de Gene Knockdown

  1. Relativa quantificação transcrição por qRT-PCR em A. aegypti e A. larvas gambiae.
    1. Executar e analisar os ensaios de qRT-PCR com três repetições biológicos em, pelo menos, 10 vs. controlo pool larvas experimental tal como descrito 11,19,20, ou de acordo com procedimento padrão do laboratório. Os resultados representativos estão incluídas a seguir.
    2. Para a análise de uma determinada parte do tipo de tecido / body (ie., Cérebro ou antena), perform qRT-PCR como descrito em 6.1.1 seguinte dissecção para recuperar o tecido de interesse (por exemplo, ver Mysore et ai. 21).
  2. Confirmação de knockdown por hibridação in situ
    1. Sintetizar antisense marcado com digoxigenina e sentir riboprobes de controle de acordo com a prática do laboratório padrão ou como descrito 26.
    2. Executar a hibridação in situ por o protocolo Haugen et al. 27, para confirmação de knockdown como descrito anteriormente e 11,20 discutido na secção de resultados representativos abaixo.
  3. Confirmação de knockdown por imuno-histoquímica
    1. Se os anticorpos contra o produto de proteína do gene alvo estão disponíveis, realizar imunohistoquímica tal como anteriormente descrito 28, o que facilita a identificação de indivíduos com os níveis mais elevados de knockdown para análise de fenótipo 20, como exemplificado no representative seção de resultados abaixo.

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Resultados

A. gambiae:

Nanopartículas de quitosano / dsRNA são formados devido à interacção electrostática entre os grupos amino de quitosano e os grupos fosfato de ARNdc. A eficiência de incorporação em nanopartículas ARNcd é geralmente superior a 90% tal como medido pela depleção de ARNcd a partir da solução. Atomic imagens de microscopia de força mostra que as médias de tamanhos de partículas de quitosano-dsRNA de 140 nm de diâmetro, que varia 100-200 nm (Figu...

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Discussão

O quitosano / interferindo metodologia de nanopartículas ARN aqui descrita tem sido usada para identificar eficazmente genes durante o desenvolvimento das larvas em A. gambiae (Figuras 2, 3) e A. aegypti (Figuras 4, 5, 6, Tabelas 1, 2). Nanopartículas de quitosano podem ser preparadas com ou longo siRNA dsRNA ou, ambos os quais têm sido utilizados com sucesso em mosquitos como evidenciado pelos resultados representativos aqui descritos. Síntese de dsRNA é menos caro do...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

O financiamento da Estação Experimental Agrícola do Kansas e do Centro de Genômica de Artrópodes do Estado K para KYZ apoiou o desenvolvimento original do silenciamento de genes mediado por quitosana / dsRNA em A. gambiae19. O trabalho de A. gambiae descrito aqui foi apoiado em parte pelo R01-AI095842 do NIH / NIAID para KM. O desenvolvimento do silenciamento de genes mediado por quitosana / siRNA em A. aegypti20,21 foi apoiado pelo Prêmio NIH / NIAID R01-AI081795 para MDS. O conteúdo deste estudo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do NIH.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipetador de 0,02 mlRaininPR20para ressuspensão de RNA interferente
Pipetador de 0,2 ml RaininPR200para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas
Tubo graduado de 0,5 ml Fischer Scientific05-408-120para aliquotação de RNA interferente ressuspenso
1 ml pipeteiroRaininPR1000para ressuspensão de RNA interferente e preparação de RNA interferente/nanopartículas
graduado de 1,5 ml Fischer Scientific05-408-046para preparação de RNA interferente / nanopartículas
1M Acetato de Sódio, pH 4,5TEKnovaS0299para preparar tampão de acetato de sódio
Ácido Acético, AIRSTAR. ACS, USP, FCC GrauBDHVWR BDH3092-500MLPpara preparar tampão de acetato de sódio
Agarose Genetic Technology GradeMP Biomedicals LLC.800668para revestir RNA/nanopartículas interferentes preparadas
CentrífugaEppendorf AG5415Dpara granular RNA/nanopartículas interferentes
Quitosana, de cascas de camarãoSigma-AldrichC3646-25Gpara combinar com RNA interferente para preparação de RNA/nanopartículas
interferentes Levedura SecaUniversal Food CorpNApara preparar alimentos larvais de mosquitos com RNA/ nanopartículas
E-RNAi ferramentaCentro Alemão de Pesquisa do CâncerNApara design de dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//
ração para peixinho douradoWardleyGoldfish FLAKE FOODpara preparar comida larval de mosquito com RNA/nanopartículas interferentes
Banho-maria aquecidoThermo Scientific51221048para aquecer o RNA/nanopartículas interferentes a 55oC
Gelonão aplicávelnão aplicávelpara descongelamento de RNA interferente e preparação de RNA/nanopartículas
[header]
Balde de geloFisher Scientific02-591-44para armazenamento de gelo usado durante o procedimento
pó de fígadoMP Biomedicals LLC.900396alimentar larvas de mosquito após o tratamento de RNA/nanopartículas interferentes
Forno de microondasUma variedade de fornecedoresnão aplicávelpara preparar solução de agarose a 2%
de petride (100 x 15 mm)Fischer Scientific875713câmara de alimentação de RNA/nanopartículas interferentes para larvas
Medidor de pHMettler ToledoS220para preparação de tampões
Lâmina de barbearFischer Scientific12-640para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação de
siRNAThermo Scientific/Dharmaconcustompara preparação de siRNA/nanopartículas
Sulfato de sódio, anidro (Na2SO4)BDH/distribuído pela VWRVWR BDH0302-500Gpara preparar solução de sulfato de sódio de 50 mM na qual o RNA interferente será
TermómetroVWR61066-046para medir a temperatura do banho-maria
Palitos de denteVWR470146-908para mexer durante a preparação de alimentos de RNA/nanopartículas interferentes e cortar pellets de gel
Congelador ultrabaixoUma variedade de fornecedoresnão aplicávelpara armazenamento de alíquotas de RNA interferentes e RNA/nanopartículas interferentes a -80oC
Misturador de vórticeFischer Scientific02-216-108para preparação de quitosana/RNA interferente
Papel de pesoFischer ScientificNC9798735para dividir o pellet de RNA/nanopartícula interferente para alimentação
tubo interferentes

Referências

  1. Malaria. , World Health Organization. http://www.who.int/topics/malaria/en (2014).
  2. Dengue. , Malaria Centers for Disease Control and Prevention. http://www.cdc.gov/dengue/ (2014).
  3. Knipling, E. F., et al. Genetic control of insects of public health importance. Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).
  4. Fu, G., et al. Female-specific flightless phenotype for mosquito control. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).
  5. Wise de Valdez, M. R., et al. Genetic elimination of dengue vector mosquitoes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).
  6. Harris, A. F., et al. Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).
  7. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions. Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control. Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).
  10. Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  11. Clemons, A., et al. siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development. PLoS One. 6 (1), e16730(2011).
  12. Haugen, M., et al. Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development. PLoS One. 6 (6), e21694(2011).
  13. Nguyen, C., et al. Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti. EvoDevo. 4 (1), 9(2013).
  14. Sarro, J., et al. Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).
  15. Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control. J Insect Sci. 13, 69(2013).
  16. Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae. Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).
  17. Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).
  18. Coy, M. R., et al. Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA. J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).
  19. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).
  20. Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a. PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215(2013).
  21. Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti. BMC developmental biology. 14 (1), 9(2014).
  22. Dass, C. R., Choong, P. F. Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy. Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).
  23. An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).
  24. Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).
  25. Horn, T., Boutros, M. E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update. Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).
  26. Patel, N. H. Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos. A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. PA, K. rieg , Wiley-Liss. (1996).
  27. Haugen, M., et al. Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), Cold Spring Harb Protoc. (2010).
  28. Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).
  29. Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).
  30. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  31. Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs. Methods. 69 (1), 38-45 (2014).
  32. Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus. Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).
  33. He, B., et al. Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests). Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).
  34. Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates. Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).
  35. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).
  36. Molinaro, R., et al. Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors. Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).
  37. Singha, K., et al. Polymers in small-interfering RNA delivery. Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).

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