Um chip microfluídico para ICPMS Amostra Introdução

Summary

Nós apresentamos um sistema de introdução de amostras de gotículas discreto para espectrometria de massas com plasma (ICPMS). Baseia-se um chip de microfluidos barato e descartável, que gera gotículas altamente monodispersas numa gama de tamanhos de 40-60 mm a frequências de 90 a 7.000 Hz.

Abstract

Este protocolo discute a fabricação e uso de um baixo custo chip microfluídico descartável como o sistema de introdução de amostras para a espectrometria de massas com plasma (ICPMS). O chip produz gotículas monodispersas em amostras aquosas de perfluoro-hexano (PFH). Tamanho e frequência das gotículas aquosas pode ser variada no intervalo de 40 a 60 mm e de 90 a 7000 Hz, respectivamente. As gotículas são ejectadas a partir do chip com um segundo fluxo de PFH e permanecer intacta durante a ejecção. Um sistema de dessolvatação construído sob encomenda remove o PFH e transporta as gotas para os ICPMS. Aqui, os sinais muito estáveis ​​com uma estreita distribuição de intensidade pode ser medido, mostrando o monodispersity das gotículas. Mostra-se que o sistema de introdução podem ser utilizados para a determinação quantitativa de ferro nas células vermelhas do sangue de bovinos individuais. No futuro, as capacidades do dispositivo de introdução pode ser facilmente estendido pela integração de módulos microfluídicos adicionais.

Introduction

Análise elementar de amostras líquidas por espectrometria de massas com plasma (ICPMS) é comumente realizada utilizando nebulizadores em combinação com câmaras de pulverização como o sistema de introdução ^1. Neste sistema de introdução da amostra, a amostra é pulverizada através de um nebulizador para gerar um aerossol polidispersa. A câmara de pulverização downstream é usado para filtrar grandes gotas. Este método está associado a um elevado consumo de amostra (> 0,3 ml min ^{-1) 2} e um meio de transporte da amostra incompleta. Assim, torna-se impraticável para aplicações onde os volumes de amostra apenas microlitro estão disponíveis, como em estudos biológicos, forenses, toxicológicos e clínicos ^3. Para reduzir o consumo de amostra, os nebulizadores com dimensões de bicos menores foram desenvolvidos ^3. No entanto, o tamanho do bico reduzida aumenta o risco de entupimento quando amostras de fluidos biológicos não digeridas ou soluções salinas concentradas têm de ser analisados ^​​3.

Uma abordagem diferente para a introdução da amostra foi proposto por Olesik et al. ^4. Os autores injectado um líquido em ICPMS sob a forma de microgotículas monodispersas discretas, que foram produzidos por uma microbomba conduzido piezo-electricamente. Mesmo que esse mesmo sistema não encontrou a aplicação larga, iniciou o desenvolvimento do conceito de introdução gota discreta em ICPMS. Hoje, piezo-electricamente impulsionada sistemas, o que pode gerar gotículas de tamanho de 30, 50, 70 e 100 ^ m e a frequências de 100-2,000 Hz distribuição, podem ser adquiridos. As gotas podem ser transportadas para ICPMS com perto de 100% de eficiência ^5. Estes distribuidores microgotícula foram aplicadas para medir quantitativamente nanopartículas individuais ^5,6, bem como caracterizar as células biológicas individuais ^7. Um sistema semelhante com base na tecnologia de jacto de tinta térmico ⁸ foi testado para análise de amostras biológicas ^9. Embora o available sistemas individuais de introdução das gotículas são muito eficientes, podem ser utilizados para pequenos volumes de amostra e são promissores para a análise de células e nanopartículas, eles têm várias limitações. Para um tamanho fixo do bocal, o tamanho das gotas pode ser variada apenas ligeiramente (a menos que ajustes personalizados são utilizados ^10). As alterações das propriedades físicas do líquido (pH, teor de sal) podem alterar as características de gotículas (tamanho, velocidade de injecção). Além disso, estes dispositivos são bastante caros, propensos a entupimento e são difíceis de limpar.

Outro método para gerar gotículas é conhecido no campo da gota de ¹¹ microfluidos. Nos últimos anos gota microfluidics ganhou interesse para (bio) reações químicas ^12-15 e para estudos de células únicas ^16,17. Além disso, esta técnica foi aplicada para a introdução de amostras em espectrometria de massa por ionização por electropulverização ^18,19 e para a preparação de amostras de laser assistida por matriz dessorção / ionizatioespectrometria de massa n ^20,21.

Recentemente, nós introduzimos um sistema baseado microfluídicos para a introdução da amostra em ICPMS ^22. O principal componente do nosso sistema de introdução é a ejecção de gotículas (LADE) chip de líquido assistida. Este chip consiste totalmente de poli (dimetilsiloxano) (PDMS). Na primeira junção do canal de fluxo a focagem é usado para gerar gotículas monodispersas de uma solução aquosa a amostra (Figura 1). Para este efeito, a altamente volátil (ponto de 58-60 ° C de ebulição ²³⁾ e o transportador de fase imiscível perfluoro (PFH) é utilizado (Figura 1). Estas propriedades de PFH permitir uma geração de gotículas estável e rápida remoção da fase da portadora. As alterações nas propriedades do líquido de amostra influência este método de geração menos, em comparação com outros geradores de gotas. O tamanho das gotículas é ajustável ao longo de uma vasta gama, alterando as taxas de fluxo da fase aquosa e a PSF. Numa secondar jusantey junção, mais PFH é adicionado para aumentar a velocidade do fluxo de, pelo menos, 1 m seg ^-1. A esta velocidade, o líquido pode ser ejetado do chip no jet estável e reto (Figura 1), sem destruição das gotículas (Figura 1 caixa). Este projeto de junção dupla permite controlar a estabilidade jet independente de geração de gotículas. As gotículas são transportados para os ICPMS com um sistema de transporte personalizado. Este sistema compreende um tubo de queda e uma desolvator membrana para remover o PFH. Os resíduos secos das gotículas aquosas são subsequentemente ionizado no plasma do ICPMS e um detector mede os iões de massa. A parte da frente do chip é garantir uma conexão firme com o sistema de transporte de gotícula em forma de barril. A ejecção da amostra aquosa como gotículas de PFH é benéfica, porque o contacto com o bocal é evitada. Isto reduz consideravelmente o risco de entupimento do bico, o qual pode ser um problema quando se trabalha com suspensões de células ou de cosoluções salinas ncentrated. Os chips LADE, fabricados por PDMS litografia macia, são baratas (custo do material de aproximadamente US $ 2 por chip), descartáveis ​​e fácil de modificar. Em combinação com a fabricação, que requer apenas uma pequena quantidade de trabalho manual cada experiência pode ser realizada com um novo chip. Portanto, uma limpeza laboriosa não é necessário e é minimizada a contaminação cruzada.

Aqui, a fabricação do chip CARREGAR por litografia macia e sua aplicação para ICPMS são descritos. Exemplos de medições com uma solução aquosa e uma suspensão de células são apresentados.

Protocol

1. SU-8 fabricação principal (Figura 2)

Nota: Execute a fabricação dos SU-8 moldes de mestre em uma sala limpa para evitar defeitos causados ​​por partículas de poeira. Duas bolachas são necessários para a fabricação, uma bolacha com características de microfluidos e um sem.

1. Prepare os moldes de mestre para o chip microfluídico. Primeiro, aplicar uma camada de adesão para a bolacha de silício.
   1. Desidratar uma bolacha de silício de 10 min a 200 ° C. Arrefecer o wafer até RT e carregá-lo em um coater rotação e rotação revesti-la com SU-8 2002, com o seguinte protocolo.
   2. Dispensar cerca de 3 ml para resistir a bolacha.
   3. Girar a bolacha a 500 rpm durante 10 segundos para espalhar a resistir ao longo de toda a bolacha.
   4. Girar a bolacha a 2.000 rpm durante 30 segundos para atingir uma altura de resistir aproximadamente 2 mm.
2. Remover o excesso de resistir a partir da borda da pastilha com um algodão embebido em acetona embebido, para evitardegola da bolacha para a placa quente no passo seguinte. Cozer a bolacha durante 60 segundos a 95 ° C sobre uma placa quente.
3. Expor toda a bolacha com luz ultravioleta (80 mJ / ^cm2 a 365 nm). Pós-coza a bolacha, durante 120 segundos a 95 ° C.
4. Arrefecer a bolacha para baixo e imediatamente revestimento girar a bolacha novamente utilizando o seguinte protocolo para SU-8 2050:
   1. Girar a bolacha a 100 rpm durante 20 seg (cerca de 3 ml dispensar SU-8 resistir durante este passo).
   2. Girar a bolacha a 500 rpm durante 10 segundos para espalhar a resistir ao longo de toda a bolacha.
   3. Girar a bolacha em 3250 rpm durante 30 segundos, resultando em uma espessura de resistir a cerca de 40 mm.
5. Novamente, remover o excesso de resistir a partir da borda da pastilha com um algodão embebido em acetona e embebido coza a bolacha mole em uma placa quente para 180 segundos a 65 ° C e durante 360 ​​segundos a 95 ° C.
6. Prepare o photomask por sticking-lo a um vidro de soda-lime. Veja a Figura 3 para o projecto de máscara. Usar um alinhador de máscara para expor a resistir com luz ultravioleta (160 mJ / ^cm2, medido a 365 nm) através da máscara preparado. Cozer a bolacha novamente exposta sobre uma placa quente durante 60 segundos a 65 ° C e durante 360 ​​segundos a 95 ° C.
7. Depois de arrefecer o wafer de RT, mergulhá-lo em uma placa de Petri de vidro cheio de desenvolvedor para 5 min para desenvolver a resistir. Agite suavemente a placa de Petri para remover não impressionados SU-8. Lavar o wafer com isopropanol e explodi-lo seco, com uma arma de nitrogênio.
8. Examinar a bolacha sob um microscópio. No caso pouco desenvolvida resistir restos sobre as características, desenvolver a bolacha de novo durante alguns minutos, tal como descrito na etapa 1.7.
9. Remover qualquer solvente residual cozendo as bolachas durante 2 horas a 200 ° C. Verifique a altura das características com um perfilador passo. No caso da altura medida difere da altura desejada começar com este protocol novamente e se adaptar a velocidade de centrifugação na etapa 1.1.4.
10. Para prevenir a aderência do PDMS para a bolacha silanizar-lo, colocando-o em exsicador em conjunto com 50 ul de 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane em um pequeno prato de porcelana. Reduzir a pressão no exsicador para 100 mbar e incubar a bolacha durante 12 h.
    1. Para as peças em branco de PDMS silanizar outra pastilha de silício utilizando o método do passo 1.10. Para poupar tempo, ambos os silanizar bolachas, ao mesmo tempo num único exsicador.

2. LADE Chip Fabrication

NOTA: O chip CARREGAR é feita de dois PDMS peças que são ligadas uma à outra por ligação adesiva ^24. A primeira parte contém as características microfluídicos. A outra parte é plana e utilizado para selar os canais. Bonded juntos, eles formam a forma redonda necessário para fazer a interface do chip com o sistema de transporte da gota. Aqui, a fabricação deas duas peças e a sua ligação é descrito. Todos os passos do processo são mostrados na Figura 4.

1. Preparar 44 g de PDMS por mistura de 40 g de pré-polímero com 4 g do PDMS agente de cura (isto irá resultar em até 6 batatas fritas). Desgasificar os PDMS em um dessecador até que esteja livre de bolhas (isso vai levar cerca de 20 min).
2. Replica moldagem das metades estruturadas.
   1. Coloque a forma de fundição em cima do wafer e encaixá-la utilizando as estruturas de orientação em torno do projeto (ver Figura 5). Ir a rotura no lugar para o halve PDMS plana.
   2. Pour cerca de 3 a 4 g do PDMS desgaseificados sob a forma de fundição e coloque-o durante 6 minutos num prato quente a 150 ° C. Arrefecer o PDMS curados sob a forma de fundição e levante cuidadosamente o wafer forma de fundição com uma espátula.
   3. A fim de evitar qualquer contaminação dos canais de microfluidos cobrir o lado do chip que foi previamente em contacto with da bolacha com fita. Corte cuidadosamente a fita ao longo da borda da parte PDMS para remover o excesso de PDMS.
3. Para fabricar as metades PDMS planas repetir o 2.2.1 passos acima mencionados para 2.2.3 com a bolacha silanizada branco.
4. Peel da fita e furos de conexão fluido para as metades estruturadas com um perfurador de biópsia. Proteger as estruturas com fita durante o armazenamento.
5. Unir as partes PDMS juntos por colagem utilizando as PDMS agente ²⁴ de cura.
   1. Tome uma pastilha de silício não tratada e girar revesti-la com PDMS agente de cura para 30 segundos a 6.000 rpm. Pegue o wafer fora do coater rodada.
   2. Remover a fita a partir das metades estruturadas e colocá-los com as estruturas voltadas para baixo sobre a bolacha. Empurrar suavemente no topo dos PDMS para remover bolhas de ar.
   3. Retire a fita dos PDMS em branco metades. Dê uma halve estruturado a partir do wafer e alinhá-lo manualmente em cima do halve PDMS plana. Aperte delicadamente oseparar em conjunto para remover as bolhas de ar e deixar a cura de chip montado durante 24 horas à temperatura ambiente. Não empurre as partes em conjunto com força, pois isso pode fazer com que os canais a entrar em colapso.
6. Cortar o bico do chip ao longo da linha indicadora ortogonal para o canal do bocal com uma faca para abrir o bocal de saída. Use um dispositivo de alinhamento para garantir um corte em linha reta, o que é necessário para uma ejeção de líquido em linha reta. Inspecione o circuito sob um microscópio para defeitos nos canais microfluídicos e partículas de poeira. Coloque uma fita adesiva sobre os orifícios de entrada para proteger os chips durante o armazenamento.
7. Ligue uma garrafa Woulff com tubulação a uma fonte de nitrogênio seco e para todas as entradas do chip LADE. Depósito de 50 ul de 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane na parte inferior da garrafa Woulff e fechar.
8. Silanizadas os canais de microfluidos por lavagem todos os canais de 20 min com a corrente de azoto que contém 1 H, 1 H , 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane a uma taxa de fluxo de aproximadamente 1 ml / s. Os chips são pronto para experimentos e pode ser armazenado durante pelo menos várias semanas à temperatura ambiente.

3. Preparação para o Sistema de Medição / Gota Transportes

NOTA: construir todo o sistema de transporte de gotícula em cima de uma mesa óptica, uma vez que é necessário para construir uma estrutura de suporte estável para a configuração. Um esquema de todo o sistema de transporte de gotas é representado na Figura 6.

1. Instale um poli ciclônica personalizado (metacrilato de metila) adaptador (PMMA) com mais 50 cm acoplada tubo de aço inoxidável na vertical. Ligue o adaptador a uma fonte de hélio com um controlador de fluxo de massa. Anexar uma câmera (alta velocidade) e uma lâmpada para o adaptador nos locais opostos para visualização gota.
2. Coloque um aquecedor de cartucho no meio do tubo de aço e usar poli (cloreto de vinilo) (PVC) e tubagem um tubo Legrisconector para ligar a extremidade do tubo de aço com a entrada do desolvator membrana.
3. Ligue a saída do desolvator com outro tubo de PVC de um adaptador de fluxo laminar, que está directamente ligada à entrada ICPMS. Conecte o adaptador de fluxo laminar a uma fonte de argônio com um controlador de fluxo de massa e, mais tarde, usá-lo para misturar Argon para alcançar uma condição de operação estável.
4. Alinhar o adaptador, bem como o tubo de aço vertical, com um nível de bolha. Se o alinhamento não é preciso, pois pode levar a perdas significativas de gotículas. Colocar um tampão no adaptador para evitar gases vazando durante o tempo de aquecimento do sistema.
5. Comece fluxos de gás todos acima mencionados e dispositivos usando as configurações a partir da Tabela 1. Permitir que o sistema aquecer por 15 min. O aquecedor de cartucho tem 2 horas para estabilizar a temperatura, ligue-o com antecedência.
6. Coloque as bombas de seringa em uma cremalheira na altura do adaptador de hélio ciclônica. Manter a distância entre obombas de seringa e o adaptador tão curto quanto possível.

4. Medições

NOTA: O protocolo seguinte é escrita em termos gerais, devido à variedade de soluções e suspensões, que podem ser utilizados. No entanto, as suspensões de células devem ser diluídas a uma concentração de <1 x 10 ⁷ células / ml, quando a análise de célula única é realizado, para assegurar que a maior parte das gotículas de transportar apenas uma célula. Para medições com células colocar as bombas de seringa com um ângulo de modo a que a saída das seringas apontar para baixo e instalar o tubo de tal maneira que eles apontam para baixo.

1. Anexar a tubulação para as seringas. Carga duas seringas de 5 ml com perf luoro-hexano e uma seringa de 1 ml com uma solução ou suspensão de amostra. Remova todas as bolhas de ar nas seringas e tubos.
2. Instale as seringas em uma bomba de seringa e conectá-los às entradas do chip. Comece as bombas de seringa usando as configurações iniciais deTabela 1 (ou as taxas de fluxo mais elevadas). Dê os fluxos de 3 a 5 min para estabilizar.
   1. Remover o excesso de líquido a partir da ponta do chip com um tecido. Os líquidos devem agora ejetar do chip em um jato direto. Se uma ejecção não linear pode ser alcançada, limpando com um tecido substituir o chip e começar de novo com este passo.
3. Remova o plugue do adaptador e insira cuidadosamente o chip no adaptador. Lubrifique o chip com FC-40, se necessário. Um chip pode ser utilizado para, pelo menos, 2 horas de experiências.
4. Alterar a velocidade de fluxo para estar dentro das configurações de medição recomendadas da Tabela 1. Taxa mais baixa de fluxo do PFH não só economiza PFH, mas também reduz o fundo do sinal, causado por interferências isobáricas.
5. Submeter o sistema de 2-5 min para estabilizar (dependendo dos caudais escolhidos). Otimizar os ICPMS para a maior intensidade do sinal dos analitos de interesse.
   1. Ajustar sucessivamente os fluxos de todos os gases nos controladores de fluxo de massa (ver as gamas recomendadas na Tabela 1) até que a intensidade máxima do sinal dos analitos de interesse é conseguida. Sintonizar a energia do plasma e as tensões de lentes de focagem (de acordo com gamas recomendadas pelo fabricante) sobre os ICPMS da mesma maneira.
6. Definir as ICPMS para um tempo de pausa de 10 ms (aplicada para obter as ICPMS usados ​​mas pode ser ajustada com outros instrumentos para assegurar uma aquisição resolvida no tempo). Iniciar a gravação do sinal de um m / z particular, utilizando o protocolo do fabricante.
7. Após a medição, transferir os dados em bruto para o programa de análise de dados para a avaliação. Bin os dados, dados em contagens por 10 ms, com um built-in-função, e gráfico resultante valores centro bin contra contagens. Encaixe cada pico no histograma de distribuição de freqüência plotados com uma função de Gauss. A média e o ajuste de sigma representam a intensidade de sinal média e o seu desvio padrão, respectivamente.

5. A calibração Concept

1. Medir uma solução única ou padrão multi-elemento que contém o elemento ou os elementos de interesse nas mesmas taxas de fluxo como a amostra.
2. Coloque um chip CARREGAR numa placa de Petri sobre um microscópio. Para uma melhor qualidade de imagem usar um chip não-round. Fabricar este chip conforme descrito na etapa 2, mas usando uma forma de fundição retangular simples em vez de um parcialmente em forma redonda.
3. Siga os passos 4.1 a 4.2.1 para iniciar a geração de gotículas. Defina as taxas de fluxo para as taxas de fluxo utilizadas na etapa 5.1.
4. Grava imagens das gotículas aquosas com uma câmera de alta velocidade acoplada a um microscópio (objetiva 20X). Use um software de análise de imagem como a morfometria gota e software velocimetria por Basu ²⁵ para obter o diâmetro médio de gota a partir das gravações.
5. Utilizar o diâmetro médio das gotículas de calcular o volume de gotícula, assumindo que a gotícula é um objecto esférico.
   1. Deste volume e o knprópria concentração de um analito na gotícula calcular o número de átomos correspondentes. Dividir o número de iões medidos por gota ao número de átomos de obter a eficiência de detecção. Utilizar esta eficiência de detecção para calcular o número de átomos presentes numa amostra desconhecida.
      NOTA: Uma vez que as variações entre os chips individuais são pequenos ^22, não é necessário repetir a medição do tamanho das gotas para cada chip ou solução se as taxas de fluxo permanecer o mesmo. A lista dos tamanhos de gotas e frequências de acordo com as taxas de fluxo específicos é publicado pela Verboket et al. ^22.

Results

O sistema apresentado pode ser empregue para medir pequenos volumes de soluções ou suspensões que contêm células ou nanopartículas. Exemplos de uma medição de uma solução padrão e caracterização de células individuais são mostradas aqui. Mais exemplos podem ser encontrados em Verboket et ai. ^22.

Tipicamente, o sinal de uma única gota de uma solução é um evento muito curto. Ele geralmente dura alguns 100 ms ^26. Com os ICPMS utilizados aqui (tempo de 10 mseg) sin...

Discussion

Embora a fabricação dos chips é muito confiável há alguns pontos críticos durante a fabricação que requerem atenção especial. Em primeiro lugar, a limpeza durante a montagem é muito importante para evitar a contaminação do chip pela poeira. A poeira pode bloquear os canais e prevenir uma geração de gotículas estável. Em segundo lugar, é especialmente importante que a ponta é cortada ortogonal para o canal do bocal. O ângulo de corte influencia fortemente o ângulo de ejecção. Se o líquido é ejectado a um ângulo que pode ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wafer de silício 100 mm	Si-Mat (Kaufering, Alemanha)
SU-8 2002	Microchem Corp. (Massachusetts, EUA)
SU-8 2050	Microchem Corp. (Massachusetts, EUA)
Acetona	Merk VWR (Darmstadt, Alemanha)	100014
MR-developer 600	Microresist Technology GmbH (Berlim, Alemanha)
Isopropanol	Merk VWR (Darmstadt, Alemanha)	109634
1H,1H,2H,2H-perfluorodeciltriclorosilano	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Alemanha	)AB111155
Kit de elastômero de silicone Sylgard 184 (PDMS)	Dow Corning (Michigan, EUA)	39100000
Perfluorohexano 99%	Sigma-Aldrich (Missouri, EUA)
FC-40	ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Alemanha)	AB103511
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies (Paisley, Reino Unido)	10010-015
Glóbulos vermelhos em solução salina tamponada com fosfato	Rockland Immunochemicals Inc. (Pensilvânia, EUA)	R400-0100
Soluções padrão de elemento único Na, Fe	Inorganic Ventures (Virgínia, EUA)
Solução padrão multielemento	Merck Millipore (Massachusetts, EUA)	IV
Ácido nítrico	Água subfervida
de pureza ultra-alta	Merck Millipore (Massachusetts, EUA)
Placa quente HP 160 III BM	Sawatec (Sax, Suíça)		utilizada para a preparação de wafers
Módulos de rotação SM 180 BM	Sawatec (Sax, Suíça)		utilizados para a preparação de wafers
Fotomáscara de filme de alta resolução	Microlitho (Essex, Reino Unido)
Perfilador de etapas Dektak XT advanced	Bruker  (Massachusetts, EUA)
Placa quente MR 3002	Heidolph (Schwabach, Alemanha)		usada para moldagem de réplicas
perfurador de biópsia de 1,5 mm	Miltex (Pensilvânia, EUA)	33-31AA/33-31A
WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell (Pensilvânia, EUA)		usado para colagem adesiva
Bomba de seringa neMESYS	Cetoni (Korbussen, Alemanha)
Seringa de 1 ml	Codan (Lensahn, Alemanha)	62.1002
Seringa de 5 ml	B. Braun (Melsungen, Alemanha)	Tubulação PTFE 4606051V
	PKM SA (Lyss, Suíça)	PTFE-AWG-TFT20. N
ICPMS baseado em quadrupolo ELAN6000	PerkinElmer (Massachusetts, EUA)
Desolvator de membrana CETAC6000AT+	CETAC Technologies (Nebraska, EUA)		apenas a unidade do desolvator é usada
Câmera de alta velocidade Miro M110	Vision Research (New Jersey, EUA)
Programa de análise de dados Origin pro	OriginLab Corp. (Massachusetts, EUA)	versão 8.6
Microscópio	Olympus (Tóquio, Japão)	IX71