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Artigo de método

Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

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DOI:

10.3791/52528

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18 de junho de 2015

 ,  , 
1Department of Natural Sciences, Marymount Manhattan College

Neste artigo

Resumo

Um módulo de laboratório viável para alunos de graduação em biologia que explora conceitos celulares e moleculares avançados usando cultura de células animais é descrito. Os alunos crescem, caracterizam e manipulam um modelo de célula de câncer de mama por exposição a agentes quimioterápicos. A viabilidade celular é testada por meio da contagem de células usando um método padrão e novo.

Resumo

Os alunos de graduação em biologia são obrigados a aprender, compreender e aplicar uma variedade de conceitos e técnicas de biologia celular e molecular em preparação para programas biomédicos, de pós-graduação e profissionais ou carreiras em ciências. Para resolver isso, um módulo de laboratório simples foi desenvolvido para ensinar os conceitos de divisão celular, comunicação celular e câncer por meio da aplicação de técnicas de cultura de células animais. Aqui, a linha celular de tumor mamário de camundongo (MMT) é usada para modelar o câncer de mama. Os alunos aprendem a cultivar e caracterizar essas células animais em cultura e testar os efeitos de agentes quimioterápicos tradicionais e não tradicionais na proliferação celular. Especificamente, os alunos determinam a concentração celular ideal para células de plaqueamento e crescimento, aprendem como preparar e diluir soluções medicamentosas, identificar a melhor dosagem e o curso do tempo de tratamento dos agentes antiproliferativos e determinar a taxa de morte celular em resposta a vários tratamentos. O módulo emprega uma técnica padrão de contagem de células usando um hemocitômetro e um novo método de contagem de células usando software de microscopia. O procedimento experimental se presta a uma investigação aberta, pois os alunos podem modificar etapas críticas do protocolo, incluindo testes de agentes homeopáticos e medicamentos de venda livre. Em suma, este módulo de laboratório exige que os alunos usem o processo científico para aplicar seus conhecimentos sobre o ciclo celular, vias de sinalização celular, câncer e modos de tratamento, ao mesmo tempo em que desenvolvem uma série de habilidades de laboratório, incluindo cultura de células e análise de dados experimentais não ensinados rotineiramente na sala de aula de graduação.

Introdução

Muitas vezes, nos cursos de graduação de biologia geral, os temas da regulação do ciclo celular e câncer são aflorados, mas não explorados em detalhe porque a amplitude do conteúdo nestes cursos deixa pouco tempo para a profundidade. Além disso, alunos de graduação de biologia não são normalmente expostos a técnicas avançadas associadas com a cultura de células animais. Para ajudar os alunos a desenvolver uma compreensão mais profunda destes conceitos, ao aplicar e analisar o que aprenderam, uma atividade de laboratório foi desenvolvido como uma modificação do Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) estendeu atividade laboratorial 1. O módulo de laboratório utiliza, uma estratégia experimental passo a passo que inclui a crescer e caracterizar um modelo celular de cancro, desenvolvimento e execução de métodos de contagem de células, é claro, que estabelece o tempo óptimo e dosagens para o tratamento de células com agentes anti-proliferativos, e identificação de vias de sinalização celular aberrante . O experimento também permite aberta-ended inquérito.

A maioria das técnicas necessárias para esta actividade pode ser realizado num laboratório-ensinando biologia típico. A actividade inicia-se com os alunos que caracterizam a taxa de crescimento e morfologia da linha celular de tumor mamário de ratinho (MMT), um modelo de cancro da mama humano 2. O câncer de mama foi escolhido como o câncer de modelo por causa de sua prevalência na população, sua familiaridade aos estudantes em idade universitária, e os dados difundidos disponíveis. A linha de células MMT foi especificamente seleccionada porque é facilmente obtido, bem caracterizado, tem um curto tempo de duplicação e é fácil de cultivar. Além disso, as células MMT são o que é consistente com a maioria dos cancros da mama dependente de estrogénio do sexo feminino. Depois, os estudantes identificar vias de sinalização celular aberrante nas células MMT por tratamento das células com drogas de quimioterapia cujo mecanismo de acção é bem established.The concentração dos fármacos e duração dos tratamentos são variados permitindo que os alunospara avaliar o efeito destas variáveis ​​na taxa de divisão celular. O ensaio de chave para esta actividade é a determinação da viabilidade das células, o que requer simplesmente a contagem das células, utilizando um dos dois métodos. Cada método depende das habilidades de microscopia fortes. Estudantes determinar a viabilidade celular, utilizando um padrão, método hemocit�etro e um método microfotografia romance e propor. Baseado em seus resultados, eles podem propor e testar modificações para a atividade. Os alunos, então, representar seus dados e interpretar os resultados para refinar a sua hipótese e elaborar novas estratégias experimentais.

Esta atividade de laboratório é adequado para caloiro ou nível de estudante de segundo ano estudantes que se formam nas ciências biológicas. Ele é condensado em um módulo de laboratório de uma semana, que pode ser completada em um primeiro ano, biologia geral ou no segundo ano, curso de biologia celular / molecular. Habilidades necessárias para a boa execução da atividade incluem aritmética básica e álgebra, a familiaridade com uma variedade de chabilidades laboratoriais de minério (por exemplo, pipetagem, a tomada de solução, uma técnica estéril), análise de dados, microscopia de luz e tempo de gestão de base, juntamente com o conhecimento instrutor de cultura de células e software de planilha. Reagentes requeridos incluem um modelo de linha de células de animais para o cancro (por exemplo, células de mamário de ratinho de tumor, MMT 2), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, tamoxifeno, a curcumina, a metformina, e aspirina), tripano meios de cultura azul e células (por exemplo, Meio Essencial Mínimo de Eagle ; EMEM) com suplementos apropriados (por exemplo, cavalos doador e soro fetal bovino). Instrumentos necessários incluem um microscópio invertido luz com apego câmera digital, computador, 100 mm e 24 placas de cultura de tecidos, incubadora de CO2 (ou equivalente), cabine de segurança biológica (BSC; Classe II), hemocitômetro, e software de microscopia digital.

Existem bons exemplos de atividades de laboratório específicos que dependem de cultura de células animais para TEACestudantes de graduação h sobre conceitos em biologia celular 3. No entanto, muitos requerem fontes ou técnicas que não são facilmente acessíveis (por exemplo, isótopos radioativos, tecido animal vivo, equipamentos avançados de imagem 1,4,5), descrever os protocolos que são bastante avançada (por exemplo, adequado para um curso de nível 6 400), ou exigem multi-semana ou semestrais longas projetos 6,7. A atividade de laboratório descrito aqui é simples e pode ser realizado em uma única semana com equipamento de laboratório comum.

Em resumo, este módulo de laboratório efetivamente introduz ou reforça os conceitos de ciclo celular, vias de sinalização celular e câncer, enquanto o ensino de habilidades básicas e avançadas de laboratório, análise de dados experimentais, o método de cultura de células animais e do processo científico. O módulo de laboratório é simples e economicamente acessível e fornece a flexibilidade ea oportunidade para o inquérito aberto. A atividade incentiva a criatividade dos estudantesfornecendo uma estratégia modelo experimental que actua como uma guia, mas não uma receita. Mais importante ainda, os satisfaz todos os domínios de actividade de aprendizagem de flores Taxonomia 8, pois requer lembrando, compreensão, aplicação, análise, avaliação e criação de envolver os alunos em um processo que os puxa para fora do livro didático e para o mundo da pesquisa científica.

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Protocolo

Notas: Conduta todo o trabalho com células e reagentes de cultura de células em uma cabine de segurança biológica Classe II (BSC) 9. Células MMT são classificados como Nível de Biossegurança eu, como eles representam baixo risco biológico a moderada. Aplicar os procedimentos de limpeza e descontaminação adequados para o BSC entre os usos (por exemplo, luz ultravioleta, 70% de etanol limpar).

1. Cultivar células MMT

  1. Cultivar células em placas de 10 cm de cultura de tecidos contendo 10 ml de meio nutriente rico que consiste em Eagles Minimum Essential Médium (EMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), glutamina 2 mM e 1% antimicótica / antibiótica (10 unidades de penicilina , 100 ug de estreptomicina, 0,25 mg de anfotericina B). Cultivar as células numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2 da câmara, a 37 ° C. As células em placas a uma densidade de 3,6 x 10 6 células / cm2 (ver contagem de células no passo 2).
  2. Substituir metade do meio de cultura celular por meio fresco a cada 48 horas UNLess indicado de outra forma. Verificar a viabilidade celular e morfologia, através de exame com uma fase invertida luz contraste microscópio.
    1. Nota e caracterizar células para o tamanho, estrutura, forma, organização e número estimado sob a 100 - aumento de 200x. Neste densidade, as células devem aparecer em um plano, não aglutinadas em cima uns dos outros e em estreita proximidade. Cada célula é composta por um núcleo de espessura, esférica, com, extensões ramo-like longas e finas em expansão a partir dele que chegar a um ponto (veja a Figura 1).
  3. Subdivide células quando atingem uma densidade celular de 7,2 x 10 6 células / cm2. As células exibem uma taxa de duplicação de 1,8 x 10 6 células / cm 2 por 24 horas. Designar células Passage X (Px) a identificar o número de vezes que eles foram divididas.
    1. Na geração de 3 (isto é, depois de três passagens, P3), colheita, contagem, e a placa para as células de uma placa de cultura de tecido de 24 poços a uma densidade de 3,6 x 10 6 células / cm 2.
  4. Veja as células a cada dia e fotomicrografias digitais recordes. Nota e descrever a morfologia das células (isto é, tamanho, forma, luz propriedades reflexivas). Determinar tempo de duplicação celular por contagem de células regularmente e relacionando o tempo decorrido para o número de células.

2. Contagem de Células MMT

Nota: Contagem de células para determinar se as células precisam ser repicadas, para configurar para um experimento ou para determinar a viabilidade celular. Existem dois métodos aqui apresentados.

  1. A utilização de um hemocitómetro, uma técnica padrão de contagem de células.
    1. Obter um hemocitômetro brilhante-line, uma solução 0,2% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um contador de células manual.
    2. Sob o BSC, utilizar uma pipeta de 10 mL para remover as células a partir de uma cultura de tecidos de 10 centímetros prato. Se as células são cultivadas numa placa de 24 poços utilizar uma pipeta de 1 ml ou 1000 micropipeta ul para remover os meios de comunicação.
    3. Desenhar meio celular para a pipeta, colocar a ponta da pipeta contra o fundo do prato e expelir os meios de deslizamento, enquanto a ponta da pipeta ao longo da placa. Repita 4-5 vezes para ajudar a desalojar as células, dissociar aglomerados e conduzir a uma contagem de células mais precisa.
    4. Coloque a suspensão de células, resultando em um tubo de 15 ml estéril (ou 1 ml de centrífuga de micro ou outro tubo pequeno volume). Caso contrário, deixa as células em placa de cultura de tecido original / poço.
    5. Sob o BSC, combinar 10 ul da suspensão celular com 10 ul da solução de azul de tripano (proporção 1: 1) numa micro centrífuga não-estéril ou outro tubo de pequeno volume.
      Nota: azul de tripano é um corante vital que não é absorvida por células viáveis ​​saudáveis. Quando as células são danificadas ou, azul tripano mortos podem entrar na célula permitindo que as células mortas, para ser contado (aka tingir método de exclusão). Por isso sob um microscópio, células mortas aparecem roxo escuro, enquanto as células viáveis ​​são um brilhante e de cor clara.
    6. Incubarà TA durante 5 min.
    7. Coloque a tampa de deslizamento no hemocitômetro. Aplicar 10 ul da mistura de tripano azul suspensão de células para dentro da ranhura. Ver o hemocit�etro a 100 - 200X ampliação. Uma grade dos quatro cantos é aparente (ver Figura 2).
    8. Contar o número de células viáveis ​​(não coradas) versus o número total de células em cada superfície reticulada. Calcular a média dos quatro grelhas e multiplicar por 1 x 10 4 para obter células / ml.
      1. Extrapolar o número total de células por placa (ou células / cm2). Use este número para determinar tanto o volume correcto da suspensão de células a ser usada para semear uma nova placa de cultura de tecidos a uma densidade desejada de 3,6 x 10 6 células / cm 2 ou a determinar o número total de células viáveis ​​na placa ou no poço.
        Nota: Para informações adicionais sobre o uso de um hemocitômetro, consulte 10.
  2. Use software e uma câmera digital para contar células viáveis.
    1. Obter um digital de câmara, que acompanha o seu software, uma solução de 0,4% de corante azul de tripano, um composto microscópio de luz, tubos de ensaio estéreis, pipetas e um computador.
      Nota: Uma câmera digital Moticam 2000 com acompanhamento Motic Software é empregado aqui. Qualquer câmera e software comparável deve ser suficiente. Certifique-se de que o software da câmera digital foi calibrado com antecedência (de acordo com o protocolo do fabricante).
    2. Sob o BSC, use uma pipeta de 1 ml ou 1.000 ul micropipeta para remover a mídia a partir das células MMT que crescem em um 24 bem prato de cultura de tecidos. Lave as células aderentes, aplicando suavemente uma pequena quantidade (aproximadamente 500 ul) de suplementado-un (isto é, sem quaisquer suplementos de EMEM) meio fresco para a placa, em seguida, removê-lo. Aplicar 10 ul de 0,2% de azul de tripano (preparada por diluição 1: 1, com un-EMEM suplementado) directamente para o poço.
    3. Incubar a placa a temperatura ambiente durante 5 min.
    4. Veja a placa sob o microscópio em 100 - 200X ampliação wom uma câmera digital ligada. Placa pode ser lavado com mídia não suplementadas se coloração com 2% de azul de tripano está muito escura.
    5. Abra o software no computador de um nd verificar se o software está calibrado para o objectivo usado através do separador de definições. Uma imagem do FOV deve aparecer.
    6. Selecione a grade da guia Medida. Uma grade de quadrados com cerca de 0,005 centímetros de largura aparece. Selecione Grade Informações para confirmar a área de cada quadrado.
    7. Escolha uma área específica da grelha para contar as células (ou seja, 5 quadrados x 9 quadrados). Selecione Retângulo na guia Medida. Clique no canto de um quadrado e arrastar o cursor para abranger as praças de escolha.
      Nota: Um tom de verde vai cobrir as praças de escolha e uma caixa branca aparece no canto que fornece a largura, altura, área e perímetro da seção do grid escolhido (veja a Figura 3).
    8. Contar o número de VIABle células dentro da área determinada. Faça o mesmo para dois outros locais no mesmo poço ou placa, movendo a placa sob o microscópio.
    9. Certifique-se de que a área de medição é a mesma e a ampliação não mudou. Calcula-se a média do número de células viáveis ​​no âmbito da área. Utilizando a área do poço (para uma placa de 24 poços, um poço tem uma área de 2 cm 2, para um prato de 100 mm, a área é 78,6 centímetros 2), extrapolar o número de células viáveis ​​a partir da zona delimitada na grade para o número total de células no interior do poço (células / cm2).

3. tratar células MMT com agentes anti-proliferativa

  1. Prepare soluções dos agentes seleccionados anti-proliferativas terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e droga opcional, aspirina sob o BSC.
    1. Dissolver curcumina e tamoxifeno em 100% de etanol para gerar uma concentração estoque de 27 mM. Dissolver metformina e aspirina em unsupplemented EMEM para gerar uma concentração de estoque de 500 mM e 15 mM, respectivamente.
  2. Estabelecer uma resposta à dose.
    1. Tratar as células MMT com os três agentes anti-proliferativos terapêuticos (tamoxifeno, curcumina e metformina) e opcional droga (aspirina) em várias concentrações durante 96 horas para gerar uma curva de resposta à dose. Inicialmente, todos os fármacos em administrar uma gama de concentrações com base em relatórios publicados 1,11-16 e, em seguida, em concentrações maiores ou menores do que os publicados.
      Nota: Uma resposta à dose determina a concentração mínima de uma droga necessária para produzir os resultados desejados. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo.
      1. Para tamoxifeno e curcumina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,054 mm (1 ul), 0,108 mM (2 mL), 0,162 mM de (3 mL) e 0,216 mm (4 ul).
      2. Para metformina, usar concentrações (e correspondentes volumes de 2 mM) (2 ul), 4 mM (4 ul), 6 mM (6 ul), 8 mM (8 uL) e 10 mM (10 ul).
      3. Para a aspirina, usar concentrações (e correspondentes volumes) de 0,030 mm (1 ul), 0,060 mM (2 mL), 0,099 mM (3,3 mL), 0,150 mM (5 mL), e 0,216 mM (6,7 mL).
    2. Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células "Dia Dividir".
    3. 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações descritas no Passo 3.2.1. Referem a isso como "Dia 0".
      1. Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, use micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar cross contaminação. Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente).
    4. Cultivar células e re-administrar drogas nas concentrações descritas quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4) nos dias 1 -. 4 de tratamento, observação das células ao microscópio e contagem usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4).
    5. Repita a experiência pelo menos três vezes.
    6. Determinar a concentração óptima de cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e a dosagem da droga ao longo do comprimento da experiência (ver Figura 5).
  3. Estabelecer um curso de tempo.
    1. Tratar as células MMT com os três agentes terapêuticos anti-proliferativos (tamoxifeno, curcumina e metformina) a uma concentração fixa de diferentes intervalos de tempo. Utilizar a identif concentração óptimaIED através das experiências de resposta à dose (ver Passo 3.2).
      1. Use as seguintes concentrações: tamoxifeno mM 0,216, 0,216 curcumina mM e 10 mM de metformina.
        Nota: Um curso de tempo determina a quantidade de tempo necessária para um medicamento para produzir o seu melhor resultado desejado. Aqui, o resultado desejado é uma diminuição na proliferação celular em comparação com o controlo.
    2. Dividir células MMT da placa de 10 cm para uma placa de 24 poços a uma concentração de 3,6 x 10 6 células / cm2. Determine a concentração celular inicial por ambos os métodos de contagem de células-(etapa 2). Chame esta nova placa de 24 poços de células "Dia Dividir".
    3. 24 horas após o plaqueamento de células, as células MMT tratar com cada um dos agentes terapêuticos anti-proliferativos, o tamoxifeno, a curcumina, a metformina e a aspirina, nas concentrações óptimas identificadas na etapa 3.2. Referem a isso como "Dia 0".
      1. Como cada poço pode conter um máximo de 500 mL de mídia, nóse micropipetas com pontas de micropipeta estéril e uma nova dica cada vez que um novo poço é tratado para evitar a contaminação cruzada.
      2. Usar dois poços como controlos: células cultivadas na ausência de qualquer tratamento medicamentoso (controlo negativo) e células cultivadas na presença de etanol a 100% (controlo de solvente).
  4. Cultivar células e re-administrar medicamentos, na concentração escolhida quando as células são alimentadas a cada dois dias (ver Passo 1.2), durante 96 horas (até o dia 4). Nos Dias 1-4 do tratamento, observação das células ao microscópio e contar usando o método descrito no Passo 2.2 (ver Figura 4).
  5. Repita a experiência pelo menos três vezes.
  6. Determine o tempo de exposição óptimo das células MMT para cada droga representando graficamente a relação entre a viabilidade celular e duração (tempo) de tratamento de droga na concentração seleccionada (ver Figura 6).

4. O módulo de laboratório

Nota: A seguinte é uma 5-diacronograma laboratório para laboratório módulo. A Figura 7 é um diagrama de fluxo do que o calendário implicaria dentro dos 5 dias. Para esta actividade deve ser completado em cinco dias ou um curso de tempo, ou uma curva de resposta à dose é gerado. Não há tempo suficiente para gerar ambas as curvas. A experiência de resposta à dose é descrito abaixo. A experiência ao longo do tempo pode ser facilmente intercambiáveis

  1. Dividir a classe em grupos: um grupo ter estabelecer uma resposta à dose e o outro um campo de tempo escolhendo uma concentração no meio de as concentrações de resposta à dose propostos.
    1. Manter culturas suficientes e estoques de drogas em concentrações adequadas. Salvo disposição em contrário, realizar todo o trabalho sob o BSC.
  2. Dia 1
    1. Os estudantes devem fazer mídia e cultivar células (como no passo 1).
    2. Como estudantes obter um stock de células MMT em uma placa de 10 cm dirigir os estudantes para preparar meios de cultura de células e dar um tutorial no uso do hemocytomeTer, microscopia digital e software de microscopia câmara digital (como no passo 2).
    3. Calibrar o software para os objectivos utilizados no microscópio (por exemplo, 4X, 10X, 20X) agora usando o protocolo do fabricante.
  3. Dia 2
    1. Já estudantes confirmar o número total de células e a viabilidade das células (tal como no passo 2).
    2. Já estudantes contar as células na placa de 100 mm, utilizando tanto o software de microscopia e os métodos hemocitómetro, para confirmar se obtêm resultados semelhantes.
    3. Alunos para obter uma placa 24 e de divisão de células assim a placa de 100 mm, para as placas de 24 poços à densidade de revestimento a partir de células desejado (como na etapa 1). Este é considerado o Dia Split. Coloque a placa de 24 poços numa incubadora de cultura de células durante 24 horas.
  4. Dia 3
    1. Cultivar células MMT durante 24 horas sobre uma placa de 24 poços. Peça aos alunos observar células ao microscópio e contagem usando software microscopia (como no passo 2).
    2. Dê o aluno / tesou amostras de stocks de medicamentos de tratamento do câncer. Peça-lhes para preparar e diluir a solução estoque inicial (como no passo 3). Adicionar as diversas concentrações das drogas às suas células para estabelecer uma curva de resposta à dose. Isto é chamado Dia 0.
    3. Incubar as células (passo 1.2), com os medicamentos para o máximo de 48 horas.
  5. Dia 4
    1. Peça aos alunos observar células tratadas após 24 horas. Este é o Dia 1.
    2. Conte cada software microscopia bem usando. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2).
    3. Incubar as células (passo 1.2), com as drogas durante mais 24 horas.
      Nota: Instrutor fornece tutoriais e comentários de análise de dados e apresentação gráfica adicionais. Os alunos aprendem a criar figuras, gráficos e análise estatística para o dia seguinte de coleta de dados.
  6. Dia 5
    1. Peça aos alunos que trataram células após 48 horas, do dia 2.
    2. Conte cadabem usando microscopia de software. Fotografias da ficha de modo a que cada poço de contagem pode ser realizada fora do laboratório (como no passo 2).
    3. Colheita e recolher células para contagem de hemocitómetro pelo método tradicional como um meio de verificar a capacidade do estudante para utilizar eficazmente o método de software microscopia (como no passo 2).
      Nota: Recolha de dados e tirar conclusões ou revisar hipóteses, em conformidade.

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Resultados

Crescer células MMT e comparando métodos de contagem.

Células de tumor mamário foram cultivadas com sucesso e caracterizado (Figura 1) e um método de contagem de células novo desenvolvido usando Motic Software, um programa digital de software associado a câmara por um microscópio. Este novo método de contagem de células foi comparada com um método de contagem tradicional utilizando um hemocitómetro (Figura 2) e mostrou-se igualmente eficaz na determ...

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Discussão

Um módulo de laboratório é apresentado que tem como objetivo ensinar uma variedade de tópicos em biologia celular através das avançadas técnicas de cultura de células animais. O módulo realiza esta análise dos efeitos de uma série de produtos químicos anti-proliferativos sobre a replicação de células que modelo de cancro da mama humano. O ensaio primário se baseia na técnica fundamental da contagem de células e introduz uma nova maneira de contar as células utilizando software de microscopia. As actividades que compreen...

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Divulgações

Os autores não receberam qualquer apoio financeiro ou comparável de Motic.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado pela Fundação Joseph Alexander, o Prêmio de Pesquisa de Graduação ASBMB, 2013-2014, e uma Bolsa de Prêmios de Ciências, Marymount Manhattan College, 2012-2013.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Capuz de Cultura de TecidosESCO Labculture ReliantClasse II Tipo A2 Gabinete de Segurança Biológica
Waterjactor CO2 IncubadoraCEDCOModelo 1510
Hemocitômetro de linha brilhanteAmerican Opticalcom duas grades separadas
Motic Images PlusMac OSX Verison 2.0 ou superior
Gilson PipetmanRainin instrument co. incP-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 MicroscópioCultura Microscópio de luz invertida objetivaOlympus
200 μ l Pontas de pipetaMidSci40200C
1.000 μ l Pontas de pipetaMidSciAVR4
10 ml Pipetas SeriológicasTPPTP94010 placas de
24 poçosCoStar- Cluster de Cultura de Tecidos352424 poços, 16 mm de diâmetro do poço, esterilizado
por radiação Solução de Azul de Tripano 0,4%SigmaT8154100 ml, amostra de retalho de
hemacitômetro de linha brilhanteSigma
células de tumor mamário de camundongo (MMT)ATCCCCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)ATCC30-2003500 ml
de soro fetal bovinoSigmaF0926500 ml
de cloridrato de metforminaSigmaPHR1084500 mg
TamoxifenoSigmaT5648pó branco ou branco-amarelo
CurmuminSigmaC1386pó amarelo-laranja
AspirinaSigmaA2093atende às especificações de teste da USP
de 4 com câmera testada não-haz, não-haz Z375357

Referências

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