Artigo de método

Snapshot Genome-wide de Reguladores da cromatina e Estados em

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DOI:

10.3791/52535

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26 de fevereiro de 2015

 ,  , 
1Division of Systems Biology, MRC National Institute for Medical Research

Neste artigo

Resumo

A questão de como os reguladores e os estados de cromatina cromatina afetar o genoma in vivo é essencial para a nossa compreensão de como o diagnóstico precoce decisões destino celular são feitas no embrião em desenvolvimento. Abordagem mais popular para investigar características de cromatina em um nível-se global definida aqui para embriões de Xenopus o chip-Seq-.

Resumo

O recrutamento de reguladores da cromatina e a atribuição de estados de cromatina a loci genômicos específicos são fundamentais para as decisões de destino celular e formação de tecidos e órgãos durante o desenvolvimento. Determinar as localizações e níveis de tais características da cromatina in vivo fornecerá informações valiosas sobre a regulação espaço-temporal dos elementos genômicos e apoiará as aspirações de imitar o desenvolvimento do tecido embrionário in vitro. O método mais comumente usado para perfis de todo o genoma e de alta resolução é a imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento de próxima geração (ChIP-Seq). Este protocolo descreve como embriões ricos em gema, como os da rã Xenopus, podem ser processados para experimentos ChIP-Seq e oferece linhas de comando simples para análise pós-sequenciamento. Devido à alta eficiência com que o protocolo extrai núcleos do tecido fixado em formaldeído, o método permite fácil upscaling para obter material ChIP suficiente para o perfil de todo o genoma. Nosso protocolo tem sido usado com sucesso para mapear várias proteínas de ligação ao DNA, como fatores de transcrição, mediadores de sinalização, componentes da maquinaria de transcrição, modificadores de cromatina e modificações de histonas pós-traducionais, e para que isso seja feito em vários estágios da embriogênese. Por fim, este protocolo deve ser amplamente aplicável a outros organismos modelo e não modelo à medida que mais e mais montagens de genoma se tornam disponíveis.

Introdução

As primeiras tentativas de caracterizar as interações proteína-DNA in vivo foram relatadas há cerca de 30 anos em um esforço para entender a transcrição gênica mediada pela RNA polimerase em bactérias e na mosca da fruta1,2. Desde então, o uso de imunoprecipitação para enriquecer características distintas da cromatina (ChIP) tem sido amplamente adotado para capturar eventos de ligação e estados de cromatina com alta eficiência3. Posteriormente, com o surgimento de poderosas tecnologias de microarray, esse método levou à caracterização de paisagens de cromatina em todo o genoma4. Mais recentemente, o perfil da cromatina tornou-se ainda mais abrangente e de alta resolução, porque milhões de modelos de DNA co-imunoprecipitados agora podem ser sequenciados em paralelo e mapeados para o genoma (ChIP-Seq) 5. À medida que um número crescente de montagens de genoma está disponível, o ChIP-Seq é uma abordagem atraente para aprender mais sobre a regulação do genoma subjacente aos processos biológicos.

Aqui fornecemos um protocolo para realizar ChIP-Seq em embriões ricos em gema, como os da rã Xenopus. Rascunhos dos genomas de ambas as espécies de Xenopus amplamente utilizadas - X. tropicalis e X. laevis - foram divulgados pelo International Xenopus Genome Consortium6. Os embriões das espécies de Xenopus compartilham muitas características desejáveis que facilitam e permitem a interpretação de estudos de cromatina em todo o genoma, incluindo a produção de um grande número de embriões de alta qualidade, o grande tamanho dos próprios embriões e seu desenvolvimento externo. Além disso, os embriões são passíveis de manipulações clássicas e novas, como rastreamento de linhagem celular, hibridização in situ de montagem inteira, superexpressão de RNA e tecnologia de nocaute mediada por TALEN / CRISPR.

O protocolo a seguir baseia-se no trabalho de Lee et al., Blythe et al. e Gentsch et al. 7-9. Resumidamente, os embriões de Xenopus são fixados em formaldeído no estágio de desenvolvimento de interesse para ligar covalentemente (reticulação) proteínas ao seu DNA genômico associado. Após a extração nuclear, a cromatina reticulada é fragmentada para focar o sequenciamento subsequente em locais específicos de ligação ou modificação genômica e para minimizar as contribuições das sequências de DNA flanqueadoras. Posteriormente, os fragmentos de cromatina são imunoprecipitados com um anticorpo de grau ChIP para enriquecer aqueles que contêm a proteína de interesse. O DNA co-imunoprecipitado é retirado da proteína e purificado antes de criar uma biblioteca indexada (extremidade emparelhada) para sequenciamento de próxima geração (NGS). No final, linhas de comando simples são oferecidas para a análise pós-sequenciamento dos dados ChIP-Seq.

Protocolo

NOTA: Todos os trabalhos Xenopus cumpre integralmente com os animais do Reino Unido (Scientific Procedures) Act 1986, tal como aplicado pelo Instituto Nacional de Pesquisa Médica MRC.

1. Preparações

  1. Estimar o número de embriões necessários para o experimento chip (veja a discussão).
  2. Preparar as soluções seguintes que são armazenados à temperatura ambiente: 500 ml de 10x de Marc modificação de Ringer (MMR), sem EDTA, pH ajustado para 7,5 e esterilizado por autoclave (1 M de NaCl, KCl 20 mM, 20 mM de CaCl2, 10 mM de MgSO4, 50 mM de HEPES pH 7,5) a 10, 1 ml de tampão de eluição de SDS (50 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 1 mM, SDS a 1%) e 1 ml de tampão de carregamento de DNA 5x (0,2% Orange G, 30% de glicerol, 60 mM de EDTA pH 8,0).
  3. Preparar as soluções seguintes que são armazenados a 4 ° C: 50 ml de tampão de HEG (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0, glicerol a 20%), 500 ml de tampão de extracção de E1 (50 mM de HEPES-KOH pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1 mM de EDTA. 10% de glicerol, 0,5% de Igepal CA-630, 0,25% de Triton X-100), E2 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0,5 mM), e E3 (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de Igepal CA-630, 0,25% de Na-desoxicolato a 0,1% SDS), 500 ml de tampão RIPA (50 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, LiCl 500 mM, EDTA 1 mM , 1% de Igepal CA-630, 0,7% desoxicolato de Na) e 50 ml de tampão TEN (10 mM Tris-HCl pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 150 mM).
  4. Pontuação e clipe de 15 ml tubo de poliestireno cônico na marca de 7 ml. Use este tubo para conter extractos nucleares submetidos a ultra-sons.
  5. Para a análise pós-sequenciamento, usar um computador operacional multicore Unix-style com pelo menos 8 GB de RAM e espaço livre em disco de 500 GB. Instale o seguinte software localmente a maioria dos quais são usados ​​na linha de comando: FastQC, Illumina casava-1.8 filtro de qualidade, Bowtie 11, SAMtools 12, Homer 13, MACS2 14, IGV 15,16, Cluster3 17, Java TreeView, BLAST + 18, e b2g4pipe 19. Verifique as instruções de instalação e requisitos para compiladores e software de terceiros.
  6. Construir um índice Bowtie para alinhar curto NGS lê ao genoma Xenopus. Um exemplo é mostrado aqui para o X. tropicalis v7.1 genoma (Novembro de 2011), que pode ser baixado como um arquivo FASTA (genome.fa) do servidor ftp Xenbase (/ pub / Genomics / JGI). Mover o arquivo FASTA para o subdiretório índice de Bowtie.
    1. Use a seguinte linha de comando (aqui depois que o personagem prompt>) para gerar arquivos de índice xenTro7:
      > Bowtie-build /path/to/bowtie/index/genome.fa xenTro7
      > Export BOWTIE_INDEXES = / path / to / bowtie / index /
  7. Baixe o arquivo de anotação gene (GTF) a partir do browser UCSC Genome ou o site espelho no servidor NIMR para versões mais recentes do genoma (genomes.nimr.mrc.ac.uk) através de ferramentas / Table Browser. Use o arquivo genoma FASTA eo arquivo GTF personalizar HOMER para Xenopus (por exemplo, X. tropicalis genoma v7.1, - nome xenTro7).
    1. Como alternativa, use pacotes HOMER pré-construídos em algumas versões antigas do genoma Xenopus.
      > LoadGenome.pl -nome xenTro7 -org nulo -fasta /path/to/genome.fa -gtf path / to / genes.gtf
  8. Crie uma trilha genoma (.genome arquivo) para o navegador do genoma IGV fazendo o upload de um arquivo FASTA indexada (genome.fa com arquivo genome.fa.fai na mesma pasta) eo arquivo de anotação (genes.gtf). Criar um índice genoma andaime (genome.fa.fai) para o genoma de Xenopus, como se segue:
    > Samtools faidx /path/to/genome.fa
  9. Use BLAST + para passar Gene Ontology (GO) termos de várias espécies de modelo (humano, rato, peixe-zebra, mosca da fruta e leveduras) sobre genes de Xenopus da seguinte forma:
    1. Baixe todas as sequências codificadoras (CDS) como um único arquivo FASTA (cds.fa) a partir do browser UCSC Genome via Tools/ Browser Mesa e atualização BLAST + com o banco de dados BLAST pré-formatado de proteínas não redundantes (NR):
      > Update_blastdb.pl nr
    2. Pesquisar humana (txid9606), rato (txid10090), peixe-zebra (txid7955), mosca da fruta (txid7227) e leveduras (txid4932) proteínas do site do NCBI via sua função de pesquisa avançada (http: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=journals. gov / proteína / avançado) e enviar a lista GI resultante (identificador de sequência) (sequence.gi.txt) para o computador.
    3. Atribuir genes de Xenopus para as proteínas mais semelhantes a partir da lista GI executando BLASTx com uma certa esperar (E) cutoff valor (aqui 10 -20). Certifique-se o formato de saída é xml (-outfmt 5 out blastx_results.xml). Faça uso de economia de tempo threads (-num_threads) que se correlacionam com o número de núcleos de computadores disponíveis.
      > Blastx -db / path / to / nr -gilist /path/to/sequence.gi.txt -consulta / path / to / cds.fa -evalue 1e-20
      -outfmt 5 out /path/to/blastx_results.xml -num_threads [# tópicos]
    4. Abra o arquivo b2gPipe.properties da pasta b2g4pipe com um editor de texto e atualizar as propriedades de banco de dados para Dbacces.dbname = b2go_sep13 e Dbacces.dbhost = publicdb.blast2go.com. B2g4pipe executado a partir da pasta de instalação.
      > Java Xmx1000m cp *: ext / *: es.blast2go.prog.B2GAnnotPipe -em /path/to/blastx_results.xml
      resultados Check-out / xenTro7 prop b2gPipe.properties -v -annot
      NOTA: extratos Este programa GO termos para cada BLAST bater e atribui-los a correspondentes genes de Xenopus (xenTro7.annot). As configurações de banco de dados mais atualizados podem ser encontrados em Ferramentas / Configurações Gerais / Configurações DataAccess da aplicação Blast2GO Java Web Start (ver 9.11.1).

2. Chromatin Cross-linking

  1. Fertilizar ovos de Xenopus, de-geleia e cultura embryos de acordo com protocolos padrão 20.
  2. Transferir os embriões dejellied (máximo de 2.500 X. laevis ou 10.000 X. tropicalis) no estágio de desenvolvimento de interesse para um 8 ml frasco da amostra de vidro com tampa e lave-as brevemente uma vez com 0.01x MMR.
  3. Fixar os embriões com 1% de formaldeído em 0.01x MMR (por exemplo, adicionar 225 ul de 36,5-38% de formaldeído a 8 ml 0.01x MMR) para 15 a 40 min à temperatura ambiente (ver discussão para o tempo de fixação e o número de embriões necessária por experiência CHIP).
    NOTA: O formaldeído é corrosivo e altamente tóxico. É perigoso em caso de olho e contato com a pele, indigestão, e inalação. Use a coifa ao adicionar formaldeído para o frasco.
  4. Pare a fixação por lavagem brevemente os embriões três vezes com MMR 0.01x frio. Não deixe OS Embry fazer contato com a superfície do líquido porque a tensão superficial faz com que eles se rompem.
  5. Alíquota os embriões em 2 ml microtubos no gelocom um máximo de 250 embriões por tubo, que ocupam um volume de aproximadamente 250 ul (X. tropicalis) ou 600 ul (X. laevis) antes de incubação.
  6. Pipeta afastado tanto MMR 0.01x possível. Passe para o próximo passo, se você continuar imediatamente com a secção 3.
  7. Equilibrar embriões em 250 ul de tampão de HEG frio. Uma vez que os embriões terem assentado no fundo do tubo de remover tanto líquido quanto possível e encaixe por congelação em azoto líquido. Armazenar a -80 ° C.

3. Chromatin Extração

NOTA: A seguir à extracção da cromatina reticulado a partir de embriões de Xenopus funciona mais eficientemente com os tempos de fixação indicados no passo 2.3 e de 50 a 80 X. tropicalis ou 25 a 40 X. laevis embriões por ml de tampão de extracção de E1, E2 e E3. Cada passo de extracção é repetida, de modo que é necessário o dobro do volume calculado de tampão. Para aumento de escala, usar vários microcentri 2 mltubos Fuge ou 50 ml tubos de centrífuga. Manter as amostras em gelo e tampões durante a extracção da cromatina.

  1. Suplemento de quantidades adequadas de tampões E1, E2 e E3, com DTT 1 mM e comprimidos inibidores de protease. Se realizar chip com um anticorpo específico para phospho, mais buffers suplemento com NaF mM 5 e 2 mM Na 3 VO 4.
  2. Homogeneizar embriões fixos com E1 por pipetagem cima e para baixo. Homogenatos de centrifugação numa centrífuga refrigerada (4 ° C) a 1000 xg durante 2 min (5 min ou no caso da utilização de tubos de 50 ml). Aspirar o sobrenadante e quaisquer lípidos ligados à parede.
  3. Ressuspender pelotas em E1. Manter as amostras em gelo durante 10 min. Sobrenadantes de centrífuga e descartar como no passo 3.2.
  4. Ressuspender em pelotas E2. Sobrenadantes de centrífuga e descartar como no passo 3.2.
  5. Repita o passo 3.4, mas manter as amostras em gelo durante 10 min antes da centrifugação.
  6. Ressuspender pelotas na E3. Manter as amostras em gelo durante pelo menos 10 min. Centrífuga e descartar supernatants como no passo 3.2.
    NOTA: Nesta fase, os resuspensions deve tornar-se bastante transparente. Os detergentes aniónicos em E3 extrair núcleos reticulados, tornando mais das plaquetas da gema restantes solúveis.
  7. Ressuspender piscina e pelotas de núcleos reticulados (normalmente de cor castanha a partir dos grânulos de pigmento insolubilizado) em um volume total de 1 ml de E3. Diluir a amostra com E3 para 2 ou 3 ml, se afigura-se muito viscosa e difícil de pipeta. Manter em gelo ou a 4 ° C para prosseguir com o passo 4 ou no mesmo dia seguinte. Encaixe por congelação em azoto líquido e armazenar a -80 ° C para uso posterior.

4. Chromatin Fragmentação

NOTA: A sonicação é usado tanto para solubilizar e ao cisalhamento da cromatina reticulado. Aqui estão os parâmetros para executar o Misonix Sonicator 3000 equipado com um microtip cônico 1/16 polegadas e sistema de som. Se estiver usando outros sonicators, siga as recomendações dos fabricantes para tosquiarreticulado cromatina ou usar 6 a 12 W durante 4 a 8 minutos no total.

  1. Transferir a amostra nuclear a partir do passo 3.7 em um tubo de custom-built para ultra-sons (passo 1.4). Manter a amostra refrigerada durante a sonicação, tendo o tubo ligado a um copo de plástico de 800 ml cheio com água gelada através de uma curta braçadeira termómetro.
  2. Colocar o recipiente sobre uma tomada de laboratório. Ajustar o macaco de modo que a micro-pipeta sonicador é submerso na amostra de cerca de dois terços do volume e profundidade centrado sem tocar na parede do tubo.
  3. Sonicar a amostra durante 7 minutos, no total, interrompido a cada 30 segundos com um mínimo de pausas. Definir poder de 1.0. Iniciar a sonicação e aumentar imediatamente o ajuste de potência (normalmente 2 a 4) para atingir uma leitura de 9 a 12 W. Pausa imediatamente se a amostra começa a espumar. Reposicionar tubo e reinicia quando a espuma desapareceu completamente.
  4. Transfira a cromatina cortado em pré-refrigerados 1,5 ml microtubos e rotação à velocidade máxima (> 15,000 xg) durante 5 min a 4 ° C.
  5. Transferir o sobrenadante para pré-arrefecida de 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Recolha 50 ul de sobrenadante (contendo idealmente a cromatina de cerca de 400.000 ou mais núcleos) para visualizar o grau de fragmentação de cromatina (ponto 5). Use o restante do sobrenadante para Chip (secção 6).
  6. Armazenar as amostras a 4 ° C durante até um dia. Amostras Snap-congelantes como alíquotas (um por cada experimento ChIP) em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo a -80 ° C.

5. Imagem Chromatin Fragmentação

  1. Adicionar 50 ul de tampão de eluição de SDS, 4 ul de NaCl 5 M e 1 ml de proteinase K (20 ug / ul) e 50 ul do sobrenadante a partir do passo 4.6.
  2. Incubar durante 6 a 15 horas (O / N) num forno de hibridação ajustado para 65 ° C.
  3. Purifica-se o ADN utilizando um kit de purificação de PCR comercial. Se necessário, usar 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) para ajustar o pH, tal como recomendado pelo fabricante. Eluir aADN duas vezes com 11 ul de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl pH 8,5).
  4. Adicionar 0,4 uL de RNase A (20 ug / uL) e 5 uL de tampão de carregamento de DNA 5x antes de executar a totalidade da amostra ao lado de uma de 100 bp e uma escada de DNA de 1 kb de um gel de agarose a 1,4% por electroforese. Para melhores resultados, gel mancha com uma solução segura coloração ácido nucleico após eletroforese.

6. Chromatin Immunoprecipitation

NOTA: Nesta secção, usam baixa retenção de tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e, pelo menos, 1 ml de solução tampão indicada por tubo para lavar as esferas magnéticas durante 5 min a 4 ° C. Antes de remover o tampão a partir das esferas, deixam os tubos no suporte magnético por 20 a 30 segundos de cada vez ou até que a solução se torne clara.

  1. Transferência de 10 a 30 ul de sobrenadante (cromatina cortado) a partir do passo 4.6 para um novo tubo para ser usado mais tarde como a amostra de entrada, o que corresponde a aproximadamente 1% da cromatina total utilizado para a apara. Armazenar a 4° C até amostras de chips estão prontos para reverter ligações cruzadas.
  2. Transferir a cromatina restante para um novo tubo. Para experiências ChIP-qPCR que requerem um controle anticorpo, distribuir volumes iguais de cromatina para dois tubos.
  3. Adicione o anticorpo ChIP-grade (ou o controle anticorpo correspondente) a cromatina. Como um guia, use cerca de 1 mg de anticorpo por um milhão de células que expressam o epitopo de interesse.
    1. Para estimar com mais precisão a quantidade de anticorpos necessária por experimento Chip, executar o mesmo chip com diversas quantidades de anticorpos (por exemplo, 0,25 mg, 1 mg e 2,5 mg) e comparar o rendimento em loci controle negativo e positivo por Chip-qPCR (veja seção 10). Como um controlo de anticorpo, utilizar soro normal de isotipo e as mesmas espécies como em animal hospedeiro ao anticorpo.
  4. Incubar num rotor (10 rpm) O / N a 4 ° C.
  5. Lavar uma quantidade adequada de pérolas magnéticas de anticorpo-compatível uma vez com E3 durante 5 min umat 4 ° C. Verificar as especificações do fabricante para a capacidade de ligação do anticorpo dos grânulos (normalmente 5 a 20 ul de pérolas de se ligar 1 ug de anticorpo de IgG).
  6. Adicionar pérolas lavadas para o anticorpo cromatina pré-incubadas. Além disso incubar num agitador rotativo (10 rpm) durante 4 horas.
  7. Wash miçangas quatro vezes dez vezes (CHIP-Seq) com tampão RIPA pré-refrigerados (CHIP-qPCR) ou, em seguida, uma vez com tampão pré-refrigerados TEN.
  8. Apenas realizar esta etapa se realizando um experimento ChIP-Seq.
    1. Ressuspender lavado beads em 50 ul de tampão TEN por tubo. Piscina todos os cordões de uma única experiência do chip ao transferi-los para um novo tubo. Utilizar a cremalheira magnética e refrigerado (4 ° C) centrifugação a 1.000 xg, para recolher os grânulos no fundo do tubo. Descartar tanto líquido quanto possível, sem perturbar o pelete de contas.
  9. Material de tira sai aos seus grânulos pela ressuspensão as contas em 50 a 100 mL de tampão de eluição SDS e vortexing-los continuamente com um termomisturador (1.000 rpm) durante 15 min a 65 ° C. Depois disso centrífuga à velocidade máxima (> 15.000 x g) durante 30 seg. Transferir o sobrenadante (ChIP eluato) para um novo tubo.
  10. Repita o passo anterior e combinar os eluatos de chip.

7. Chromatin reverso Cross-linking e purificação de DNA

  1. Adicionar tampão SDS a eluição suficiente da amostra de entrada (passo 6.1) para atingir o volume da amostra de chip, que é de 100 a 200 ul (6,10 passo). Suplemento ambas as amostras de chip e de entrada com 1/20 volume de 5 M NaCl. Incubar as amostras durante 6 a 15 horas (O / N) a 65 ° C num forno de hibridação.
  2. Adicionar 1 volume de tampão TE e ARNase A a 200 ng / ml. Incubar durante 1 hora a 37 ° C.
  3. Adicionar proteinase K a 200 jig / ml. Incubar durante 2 a 4 horas a 55 ° C.
  4. Purifica-se o ADN por extracção com fenol: clorofórmio: álcool isoamílico a extracção seguida por precipitação com etanol como descrito anteriormente 9. Para Chip-Seq, adicione 32ul de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl, pH 8,5) para dissolver o sedimento de DNA. Deixar as amostras em gelo durante 30 minutos para assegurar que o DNA é completamente dissolvido.
    NOTA: kits de purificação de PCR comercial tem menor recuperação de ADN mas são mais convenientes, e pode ser utilizada para amostras ChIP-qPCR.
  5. Para Chip-Seq, determinar a concentração de 1 ml de chip e entrada de DNA usando métodos baseados em fluorometria. Seguir as instruções do fabricante e certificar-se de que a concentração de ADN cai dentro da gama de detecção fiável do fluorómetro.

8. ChIP-Seq Biblioteca Construção e Validação

NOTA: Os métodos atuais para preparação biblioteca DNA permitir a construção de bibliotecas de alta complexidade para NGS 1-2 ng. À custa de alguma complexidade, as bibliotecas podem ser feitas a partir de tão pouco como 50 pg de ADN (ver Tabela específico de Materiais / Equipamento). Use a mesma quantidade de DNA tanto para chip e biblioteca de entrada. Resumidamente, a MAKe indexado (emparelhado-end) bibliotecas chip-Seq, chip e DNA de entrada precisa ser reparado-end, ligado a adaptadores especiais (ver Tabela de materiais específicos / equipamentos) e PCR amplificado selecionado-size.

  1. Siga as orientações do fabricante para fazer bibliotecas chip-Seq. Veja a discussão para outras recomendações.
  2. Eluir cada biblioteca em 12 mL de tampão de eluição e determinar a concentração de 1 ml de cada biblioteca chip e entrada usando um fluorímetro. Esperar concentrações de 5 a 25 ng / ul. Considere reduzir o número de ciclos de PCR (menos do que 18 ciclos) se as concentrações são mais elevadas do que 25 ng / ul.
    NOTA: quantificação exata é fundamental para alcançar os melhores resultados NGS. Bibliotecas com concentrações tão baixas como 1 ng / mL após 18 ciclos de PCR pode ser sequenciado, mas freqüentemente são de baixa complexidade.
  3. Use 1 ml de biblioteca para determinar a distribuição de tamanho de fragmento e para verificar se há contaminação adaptador dímero (faixa em torno de 120 pb) por cà base de quadril electroforese capilar. Repetir a fase sólida purificação imobilização reversível com uma taxa de grânulos-a-amostra de 1: 1 (em vez de 1,6: 1), se a biblioteca contém dimeros de adaptador.
  4. Execute qPCR em validado loci controlo positivo e negativo (ver secção 10) para verificar se as tendências de enriquecimento DNA semelhantes são observados antes e após a preparação da biblioteca. Enviar de controle de qualidade bibliotecas aprovados para sequenciamento.

9. Análise Pós-sequenciação e Visualização de Dados

NOTA: Hoje em dia, NGS é muitas vezes realizado por in-house ou instalações de sequenciamento comerciais (ver discussão para algumas orientações NGS). A saída padrão são únicos ou múltiplos arquivos gzip comprimidos FASTQ (*) .fastq.gz armazenar milhões de sequenciamento lê. Normalmente, multiplexado lê já estão separados de acordo com seu índice e cada leitura contém um identificador de seqüência e uma pontuação de controle de qualidade (Phred + 33 para Illumina 1.8+) para cada base chamada. Esta abordagem aqui é apenas um dos muitos aspectos como analisar dados NGS. O leitor é convidado a verificar se qualquer uma das seguintes linhas de comando exigir mudanças como este campo está avançando rapidamente e as atualizações estão ocorrendo regularmente.

  1. Concatenar arquivos FASTQ gzip comprimidos e verificar a qualidade dos dados de sequenciamento utilizando o script FastQC. Executar isso e mais um dos seguintes comandos, tanto para chip e seqüenciamento de entrada de dados (Exemplos mostrados para ChIP) a partir do terminal:
    > Cat /path/to/*.fastq.gz> ChIP.fastq.gz
    > Fastqc ChIP.fastq.gz
    NOTA: Os dados brutos do sequenciamento de sucesso de uma biblioteca ChIP-Seq de alta complexidade deve passar a maioria dos testes. Falhas são originários principalmente de pobres corridas de sequenciação e artefatos experimentais, tais como a amplificação PCR tendenciosa ou contaminação adaptador. Um certo grau de duplicação (redundância) é esperado como redundante lê pode representar bona fide enriquecimento DNA 21. No entanto, pode-se restringir as etiquetas de leitura mais tarde - a extremidade 5 'ou lê - a um por par de base para eliminar qualquer redundante lê sem afectar a sensibilidade de detecção de picos (passo 9.4) 21.
  2. Dados pré-processo de sequenciamento para eliminar a contaminação do adaptador (homerTools guarnição -3 ) permitindo que um descasamento (-mis 1). Use as primeiras 20 bases do (indexados) adaptador (5 'para 3') proximal ao fragmento de ADN de interesse quando da ligação (mostrada por adaptador listados na Tabela de Materiais específicos / Equipamentos).
    > Gzip -CD ChIP.fastq.gz | fastq_illumina_filter -vn> ChIP.fastq
    > homerTools guarnição -3 GATCGGAAGAGCACACGTCT -mis um -min 36 ChIP.fastq
    NOTA: A remoção de filtrado lê (N) só é necessária por padrão em arquivos FASTQ gerados pela Illumina 1.8. Omita o comando fastq_illumina_filter (ie,. '| Fastq_illumina_filter -vn')Se uma versão mais antiga do que 1,8 gerou o identificador de seqüência.
  3. Alinhe pré-processado lê para o genoma de referência (xenTro7) usando gravata borboleta. Apenas manter mapeados exclusivamente lê (-m 1) usando as configurações padrão, ou seja, duas máximas descasamentos nos primeiros 28 bases e um Phred + 33 pontuação total qualidade de todos os desencontros por leitura de máxima 70. Relatório de alinhamento em formato SAM (-S) . Aumentar o número de megabytes por thread (--chunkmbs) se a memória pedaço está esgotado:
    > Bowtie -m 1 -S -p [# tópicos] --chunkmbs [eg 200] xenTro7 ChIP.fastq.trimmed> ChIP.sam
    NOTA: Bowtie espera Phred + 33 índices de qualidade, por padrão. Inclua a opção - phred64-quals se o arquivo FASTQ foi gerado com Phred + 64 índices de qualidade por Illumina com mais de 1.8.
  4. Use dois comandos Homer para transformar o alinhamento (SAM) arquivo em um arquivo figurão (.bw):
    > MakeTagDirectory Chip / -single -tbp 1 ChIP.sam
    > MakeUCSCfile Chip /    -bigWig / path / to / genome.fa.fai -fsize 1e20 -norm 1E7 -o ChIP.bw
    NOTA: A transformação requer o índice de andaime (genome.fa.fai) do genoma de referência (passo 1.8). Aqui, o perfil está limitada a uma marcação por par de bases (-tbp 1) e normalizados para 10 milhões lê (1E7 -norm). figurão é um do formato preferido para visualizar dinamicamente os perfis de cromatina com um navegador genoma, tais como IGV (passo 9.12).
  5. Determinar a distribuição de tags (CHIP -d /) em marcos genômicos (por exemplo, +/- 10 kb com 25 caixas de pb, -Si ze 20000 -hist 25), como o início da transcrição (tss, exemplo mostrado aqui) e terminação ( tts) locais. Execute o script perl annotatePeaks.pl HOMER com anotações de Xenopus xenTro7 (passo 1.7):
    > AnnotatePeaks.pl tss xenTro7 -Tamanho 20000 -hist 25 -d Chip /> ChIP_tagDensity.tss
  6. Encontrar picos significativos de enriquecimento de ADN entre ChIP(-t ChIP.sam) e de entrada (Input.sam -c) na X. tropicalis genoma usando MACS2 com um 1% FDR cutoff (q 0,01) e fragmentos de DNA (após sonicação) de 200 pb (--bw = 200) para a construção de modelos. Adicione o --broad bandeira para esta linha de comando se espera de uma ampla distribuição do recurso de cromatina de interesse, tais como marcas de histonas ou RNA polimerase.
    > Macs2 callpeak -t ChIP.sam -c Input.sam -f SAM -n ChIP -g 1.4376e9 q 0,01 --bw = 200
    NOTA: O tamanho efetivo do X. tropicalis montagem do genoma v7.1 é de cerca de 1.437.600 mil bp (1.4376e9 -g). MACS2 gera um arquivo de BED (ChIP_peaks.bed) alistar picos com suas localizações genômicas.
  7. Compare vários perfis de cromatina em forma de um mapa de calor em cluster:
    1. Criar uma matriz de distribuição de tag de diretórios densidade tag de interesse (-d Chip / other_ChIP /) em picos MACS2 (por exemplo, +/- 1 kb com 25 caixas pb, -Tamanho 2000 -hist 25 -ghist):
      > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -Tamanho 2000 -hist 25 -ghist -d Chip / other_ChIP /> ChIP.matrix
    2. Use a interface gráfica do usuário de Cluster3 para fazer o upload de arquivos ChIP.matrix e hierarquicamente agrupar as densidades de tag com base na distância euclidiana mínima para o centróide mais próximo. Abra o arquivo CTD gerada em Java TreeView para visualizar o clustering.
  8. Encontre romance e motivos de ligação previamente conhecidas, que são enriquecidas em cimeiras de pico +/- 100 bp (-size 200). Use annotatePeaks.pl para mapear ocorrências motivo e para traçar densidades motivo:
    > FindMotifsGenome.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 ChIP_motifs / -Tamanho 200 -p [# tópicos]
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif> ChIP_peaks.motif1
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -m motif1.motif -Tamanho 800 -hist 25> motif1.density
    NOTA: O infe roteiro findMotifsGenome.plrs o enriquecimento a partir da comparação de selecionados aleatoriamente sequências fundo gene-centric. A novela motivo mais enriquecido é guardado sob motif1.motif no formato de uma matriz de pesos posição. O leitor é convidado a justificar estes resultados com outros métodos de novo descoberta motivo, como cisFinder 22 e 23 MEME.
  9. Anotar picos calculando sua distância para o gene mais próximo e por determinação da sua normalizado contagem de leitura dentro de 400 janelas pb (-size 400):
    > AnnotatePeaks.pl ChIP_peaks.bed xenTro7 -size 400 -d Chip / input /> ChIP_peaks.genes
  10. Resumir a saída usando o seguinte comando awk para listar o número (N), a localização ea contagem de leitura normalizada individual (R) e todos (LR) picos por (alvo) gene mais próximo.
    > Awk 'BEGIN {FS =' t '} $ 7> = -5000 && $ 7 <= 1000
    {N [$ 8] + = 1; R [$ 8] + = $ 9; LR [$ 8] = LR [$ 8] ', &    # 39; 7 $ '(' $ 9 ')'} END {for (i em N)
    {Print i ' t' N [i] ' t' R [i] ' t' substr (LR [i], 2)}} 'ChIP_peaks.genes> ChIP_peaks.summary
    NOTA: O número após $ refere-se ao número da coluna, que podem precisar de modificar o ficheiro para caber ChIP_peaks.genes criado na etapa anterior. Este exemplar roteiro filtra os picos para além de 5 kb a montante e jusante 1 kb do TSS. 7 dólares, US $ 8 e US $ 9 referem-se a distância para o TSS, o identificador do gene ea contagem normalizado leitura per pico, respectivamente.
  11. Realizar a análise de termos GO enriquecidas entre genes-alvo da seguinte forma:
    1. Inicie a interface gráfica do usuário de Blast2GO a partir da linha de comando via Java Web Start (javaws) 19.
      > Javaws http://blast2go.com/webstart/blast2go1000.jnlp
    2. Siga as instruções dos desenvolvedores para carregar a anotaçãoarquivar para genes de Xenopus (xenTro7.annot) como gerados no 1.9.4 e um arquivo simples de genes-alvo identificados. Certifique-se de que os mesmos identificadores de genes são usados ​​em ambos os arquivos.
  12. Visualize os perfis de cromatina, acrescentando figurão (ChIP.bw, Input.bw) e arquivos de cama (ChIP_peaks.bed) em IGV como faixas. Dados do complemento com RNA-Seq rastreia se disponível para a mesma fase de desenvolvimento. Exceto resultados como uma sessão.
  13. Use a programação plataformas R (www.r-project.org) ou MATLAB para manipular mais e visualizar dados como gerado acima. Alternativamente, traçar pequenos conjuntos de dados com Excel.

10. ChIP-qPCR para Testing chip e Confirmando ChIP-Seq

  1. Utilizar a plataforma on-line Primer3 para conceber iniciadores vizinhas aproximadamente 100 pb de DNA a 60 ° C (T m) para ambos os loci de controlo positivo (pico-específicos) e negativos. Confirmar a especificidade do iniciador utilizando o in silico busca PCR implementado para o Browser UCSC Genome.
  2. Criar uma curva padrão de 8 pontos de diluições de três vezes a partir de entrada de cerca de 1% ou utilizar o 2 - Método ΔΔC (t), 8,24 para a quantificação do ADN de enriquecimento.
  3. Execute-PCR em tempo real em triplicatas técnicas para todas as amostras, ou seja, chip de controle e, se necessário, as amostras da curva padrão.
  4. Lote enriquecimento de ADN como a percentagem de ADN de entrada ou como uma proporção de ChIP contra amostra de controlo em ambos os loci de controlo positivas e negativas.

Resultados

Resultados equivalentes aos resultados aqui apresentados são esperados se o protocolo é bem executado e o anticorpo em uso é de qualidade ChIP-grade (ver discussão). Este protocolo permite a extracção de núcleos a partir de embriões de Xenopus fixado em formol e o corte eficiente de cromatina por ultra-sons (Figura 1A-C). Cromatina cortados mostra uma distribuição assimétrica dos fragmentos de DNA que variam normalmente de 100 a 1000 pb e com um pico entre 300 e 500 pb (Figura 1C). A 50 pg mínima de DNA imunoprecipitado é necessário para fazer com sucesso uma biblioteca ChIP-Seq emparelhado-end indexado com inserções de DNA de tamanho similar (Figura 2A). A biblioteca deve ser desprovido de dímeros do adaptador, que pode ser visto no electroferograma em aproximadamente 120 pb.

Após a sequenciação por síntese, pré-processado lê são mapeados para o genoma (Figura 2B, C). Em uma experiência bem-sucedida com X. embriões tropicalis, normalmente 50 a 70% de um único final lê de 40 pb podem ser mapeados exclusivamente para a montagem do genoma de v7.1 maximamente com dois desemparelhamentos. Enquanto entrada lê alinhar bastante uniforme em todo o genoma, o alinhamento dos ChIP lê resultados em enriquecimentos específico de cadeia que ladeiam o recurso de cromatina de interesse. Isto porque todos os fragmentos são sequenciados a partir da extremidade 5 '(Figura 2C) 25. Estendendo o alinhamento na direcção de leitura para um tamanho médio de fragmento produz perfis precisos para os dispositivos individuais de cromatina, tais como os eventos de ligação de factor de transcrição. Estas ocupações de ADN aparecem como picos quando visualizados em IGV ou qualquer outro navegador genoma compatível. Chamadores de pico como MACS são usados ​​para determinar a localização destes picos (Figura 3A). Desta forma, dezenas de milhares de locais de ligação foram determinadas no X. tropicalis genoma para T-box fatores de transcrição como Vegt 26. ChIP-qPCR experimentos deve confirmar o enriquecimento local encontrou por Chip-Seq (Figura 3B).

Experimentos chip-Seq permitem explorar as características do genoma de recursos de cromatina. Por exemplo, o cálculo da distribuição de leitura sobre os elementos genômicos, como início da transcrição e locais de terminação pode destacar as preferências de ligação espaciais ao redor de genes (Figura 3C). Da mesma forma, um mapa de calor de distribuições de leitura em locais de pico é utilizado para comparar diferentes características de cromatina numa escala de todo o genoma (Figura 3D). Certos fatores de transcrição ligam DNA sequence-especificamente. De novo motivo análise do DNA genômico picos subjacentes pode recuperar esse tipo de informação, incluindo motivos co-enriquecido de potenciais co-fatores (Figura 3E). A grande maioria dos genes-alvo mostram ocupação DNA em um menor, em vez de nível superior (Figura 3F). Este recurso livre de escala parece ser bastante comum entre os trfatores anscription e sugere que apenas uma pequena fração dos genes-alvo são diretamente regulados com relevância biológica 27,28. A análise dos termos GO enriquecidos ou outros atributos, tais como a expressão diferencial de genes alvo pode revelar mais insights sobre a função biológica da característica da cromatina no embrião de Xenopus (Figura 3G).

figure-results-1
Figura 1. Chromatin procedimento immunoprecipitation para embriões de Xenopus. (A) Os embriões estão no estágio de desenvolvimento de interesse para ligar covalentemente (cross-link) quaisquer proteínas associadas com DNA genômico fixo-formaldeído. Após a extração nuclear (B), a cromatina reticulada é fragmentada para diminuir DNA genômico de ligação ou locais de modificação da cromatina, minimizando o DN flanqueandoUma sequência (C). Subsequentemente, os fragmentos de cromatina são imunoprecipitadas com um anticorpo ChIP grau de enriquecimento daqueles contendo o epitopo de interesse (D). O DNA co-imunoprecipitou é retirada da proteína e purificado (E) antes de criar a biblioteca de fragmentos de chip para NGS (Figura 2). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2. ChIP-Seq preparação biblioteca, sequenciamento-by-síntese, mapeamento e pico de chamada. (A) O electroferograma exibe uma biblioteca boa ChIP Seq com moldes de DNA de 250 a 450 pb. Estes modelos implica a inserção de ADN de interesse ladeado pelo universal (58 pb) e o (63 pb) do adaptador indexado. (B) Milhões de grupos, com cada grupo contendo modelos idênticos, são base seqüenciado por base, na presença de todos os quatro nucleotídeos que possuem reversível, fluorophore distinta e propriedades de terminação idênticos. As imagens fluorescentes são processados ​​em tempo real, para ligar as bases correspondentes, os quais, em última análise são reunidos em lê. (C) Apenas lê que o mapa de forma única para o genoma de Xenopus são mantidos. Como todos os fragmentos são sequenciados a partir da extremidade 5 ', o mapeamento de ChIP lê resulta em picos específica de cadeia simples que flanqueiam o recurso de cromatina de interesse. Desse modo, os chamadores de pico detectar o enriquecimento que se origina de imunoprecipitação e estender a lê para um comprimento médio fragmento de localizar com precisão características de cromatina. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3. Um exemplo de análise pós-sequenciamento e visualização de dados por meio do fator T-box zygotic transcrição Vegt (zVegT). Todas as lidas contagens mostradas aqui são normalizados para 10 milhões exclusivamente mapeados e não redundante lê. (A) Trecho do perfil de todo o genoma de zVegT obrigatório em X. tropicalis gastrula embriões (estágio 11-12,5 após Nieuwkoop e Faber 29). Cada pico, um engavetamento de prorrogado lê, representa um local de ligação. Estes picos são denominadas por MACS2 com uma taxa de detecção de falsas (FDR) de menos do que 1%. Cada gene MESP mostra zVegT muito proximal ea montante obrigatório, mas apenas Mespa e mespb são expressos por esse estágio (dados de RNA-Seq 30). (B) os níveis de ocupação DNA de zVegT conforme determinado pelo chip-qPCR em vários loci (incluindo um não -bound região 0,5 kb a montante do β -actina) confirm o enriquecimento específico encontrado por Chip-Seq. Comparar resultados para Mespa com pico chamado (barra vermelha) em (A). O nível de ocupação de ADN é visualizado como uma percentagem de entrada para ambos, o chip com o anticorpo Vegt (policlonal de coelho do isotipo IgG) e o chip com o anticorpo de controlo (IgG de coelho normal). As barras de erro reflectem o desvio padrão de duas réplicas biológicas. (C) METAGENE análise mostra ligação preferencial zVegT (tags binned mais de 25 pb) do promotor em relação a qualquer outra região genómica em torno e dentro dos corpos de genes. (D) mostra Heatmap k-significativo agrupadas níveis (k = 5) de ocupação DNA (tags finalmente resolvido mais de 25 pb) de zVegT e Smad2 / Smad3 (dados do chip-Seq 31) em relação a todas as regiões zVegT-bound em fase de gástrula. O heatmap é log 2 base e centrado em 5 tags por bp. (E) De novo a análise descobre o motivo canônica fator de transcrição T-box motivo de ligação em 38% dos zVegT-regiões com destino se a pontuação motivo subjacente é normalizado para uma taxa de detecção de 5% em sequências de fundo. O mapa de densidade mostra maior enriquecimento para o motivo T-box no centro de locais de ligação zVegT, ao passo que o motivo de ligação de Smad2 / Smad3 canónica é dificilmente enriquecido. (F) histograma mostra os níveis de ocupação de ADN zVegT, que são calculados para cada gene alvo de todos os picos (+/- 200 pb) entre 5 kb a montante [-]. e 1 kb a jusante [+] de sítios de início da transcrição correspondente (G) Top 300 genes com os maiores níveis de ocupação DNA dentro -5 kb e um kb são enriquecido para os processos biológicos de desenvolvimento embrionário precoce. Estes vão termos estão em linha com a função putativa de zVegT. A FDR é baseado em um teste exato de duas caudas de Fisher e corrigida para testes múltiplos. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Nosso protocolo descreve como fazer e analisar os perfis de cromatina do genoma a partir de embriões de Xenopus. Ele abrange todas as etapas a partir de proteínas de ligação cruzada para loci endógena in vivo para o processamento de milhões de lê representando locais genômicas enriquecidas em silico. Desde um número crescente de projectos de genoma estão disponíveis, este protocolo deve ser aplicável a outros modelos e não-modelo organismos. A seção experimental mais importante, o que diferencia este protocolo para além de trabalhos anteriores 8,31,33,34, é o procedimento pós-fixação para extrair núcleos cruzada. Ele facilita a solubilização cromatina eficiente e de corte e fácil upscaling. Juntamente com as eficiências melhoradas de preparação da biblioteca este protocolo permite a construção de bibliotecas de ChIP-SEQ de alta complexidade da metade a dois milhões de células que expressam o epítopo associado cromatina de interesse. Para as experiências de ChIP-qPCR, alguns dez mil destas células são normalmente suficientepara verificar se há enriquecimento DNA em talvez seis loci genômicos distintas. Estes números são estimativas conservadoras, mas podem variar dependendo do nível de expressão da proteína, a qualidade do anticorpo, eficiência, e acessibilidade epitopo de ligação cruzada. Como um guia, um único embrião de Xenopus contém cerca de 4000 células na fase mid-blástula (8.5, depois de Nieuwkoop e Faber 29), 40.000 células na fase de gástrula tardia (12) e 100.000 células na fase tailbud precoce (20).

O tempo de fixação exata para immunoprecipitation eficiente precisa ser determinada empiricamente por Chip-qPCR (seção 10). Em geral, os tempos de fixação mais longos são necessários se o experimento envolve X. laevis embriões, primeiros estágios de desenvolvimento, e fracos (ou indiretas) propriedades de ligação de DNA. No entanto, não é recomendável que fixa embriões Xenopus mais de 40 min, ou o processamento de mais embriões do que o indicado (seção 3), com cromatina de corte torna-se menos eficiente. É importante nãopara usar qualquer glicina após a fixação como essa etapa comum para matar formaldeído pode fazer extração nuclear a partir de embriões de gema-rico muito difíceis. Actualmente, a razão para isto não é conhecido. É concebível que o aducto de formaldeído-glicina reage ainda com N-terminal de amino ou grupos de resíduos de arginina 35.

O anticorpo é a chave para qualquer experimento chip e controles suficientes precisam ser realizados para mostrar sua especificidade para o epitopo de interesse (ver orientações por Landt et al. 36). Se nenhum anticorpo ChIP grau está disponível, a introdução das proteínas de fusão marcadas com epítopo correspondente pode ser uma alternativa legítima como estas proteínas endógenas podem ocupar locais de ligação 37. Neste caso, os embriões não injectados são melhores para utilizar como controlo negativo, em vez de um chip com soro não-específico. Esta estratégia pode também ser aplicado se a proteína de interesse é expressa em níveis baixos, resultando em fraca recuperação de enriDNA Ched.

Como para fazer bibliotecas ChIP-Seq, devido à baixa quantidade de ADN a ser utilizado, é recomendável optar por procedimentos que reduzam o número de etapas de limpeza e de combinar reacções de manter qualquer perda de ADN a um mínimo. Os adaptadores e os iniciadores têm de ser compatíveis com a sequenciação múltipla e a plataforma NGS (ver Tabela específico de Materiais / Equipamento). Se utilizando Y-adaptadores (contendo braços longos de cadeia simples), é crítico para pré-amplificar a biblioteca de três a cinco rondas de PCR antes das inserções de ADN-seleccionando tamanho (ex., De 100 a 300 pb) por electroforese em gel. Extremidades de cadeia simples causar fragmentos de DNA para migrar de forma heterogênea. Ensaio executado com diversas quantidades de ADN de entrada (por exemplo, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 e 20 ng) são recomendados para determinar o número total de ciclos de PCR (inferior ou igual a 18 ciclos) necessária para fazer um tamanho -Selecionadas biblioteca de 100 a 200 ng. A redução do número de ciclos de PCR torna a sequenciação de redundant lê menos provável. Fase sólida contas de imobilização reversíveis são bons limpeza reagentes para se recuperar de forma eficiente o DNA de interesse e de forma confiável remova todas as placas livres e dímeros de ligação e reações de PCR.

Em termos de número, tipo e comprimento de leituras, em torno 20-30000000 single-end lê de 36 bp é suficiente para a maioria dos experimentos chip-Seq para cobrir todo o genoma Xenopus com profundidade suficiente. As máquinas NGS mais prevalentes são rotineiramente capaz de atender a esses critérios. No entanto, ela pode ser benéfica para aumentar o número de leituras, se uma ampla distribuição de leituras é esperado, conforme observado com modificações de histonas, em vez de picos agudos. Para muitas experiências ChIP-Seq, 4-5 bibliotecas diferente indexados podem ser combinadas e sequenciadas, um fluxo de pista de células utilizando uma máquina de NGS de alto desempenho. Algumas vezes também é conveniente para aumentar o comprimento e a sequência de leitura ambas as extremidades do molde de ADN (emparelhado-final) para aumentar mappability when análise cromatina dentro de regiões genômicas repetitivas.

Este protocolo foi aplicado com sucesso a uma grande variedade de características de cromatina, tais como factores de transcrição, mediadores de sinalização e histonas modificações pós-traducionais. No entanto, os embriões adquirir um crescente grau de heterogeneidade celular como elas se desenvolvem e perfis de cromatina se tornam mais difíceis de interpretar. Passos promissores têm sido feitos em Arabidopsis e Drosophila a paisagens cromatina tecidos especificamente perfil por meio da extração de tipo específico de células de núcleos 38,39. Nosso protocolo inclui uma etapa de extração nuclear, o que poderia abrir caminho para tecido-específicas ChIP-Seq em outros embriões.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Agradecemos a Chris Benner por implementar o genoma de X. tropicalis (xenTro2, xenTro2r) no HOMER e ao laboratório Gilchrist por discussões sobre análise pós-sequenciamento. I.P. auxiliou a análise de termos GO. G.E.G. e J.C.S. foram apoiados pelo Wellcome Trust e agora são apoiados pelo Conselho de Pesquisa Médica (programa número U117597140).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Microtip cônico de 1/16 de polegadaQsonica4417Este microtip é compatível com Sonicator 3000 da Misonix e Q500/700 da Qsonica.
Frasco de amostra de vidro de 8 ml com tampaWheaton224884frascos de amostra de vidro transparente de 8 ml para amostras aquosas com tampas de rosca revestidas de borracha fenólica de tamanho 15-425.
Adaptador, por exemplo, adaptador universal IDT ou SigmaNATruSeq, AATGATACGGCGACCACCGAG
ATCTACACTCTTTCCCTACAC
GACGCTCTTCCGATC*T. Adaptador indexado TruSeq, P-GATCGGAAGAGCACACGTC
TGAACTCCAGTCAC ‐ NNNNNN‐
ATCTCGTATGCCGTCT
TCTGCTT*G. *, grupo fosforotioato de fosforfato em 5' fim. NNNNNN, índice (consulte o Guia de preparação de amostras TruSeq ChIP para sequência de DNA). Encomende adaptadores HPLC purificados. Os adaptadores podem ser preparados combinando quantidades equimolares (cada 100 µ M) do adaptador universal e indexado e resfriá-los lentamente de 95 ° C à temperatura ambiente. Use 1,5 pmol por ng de DNA de entrada. Armazene a -20 °C.
b2g4pipe (software)Blast2GOnão comercialhttp://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip
BLAST+ (software)Camacho et al.http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs& não comercial;
DOC_TYPE=Download
Bowtie (software)Langmead et al.não comercialhttp://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml
cisFinder (software)Sharov et al.chip http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/ não comercial
para eletroforese capilarAgilent Technologies5067-1504Carregue este chip com 1 µ l DNA para controle de qualidade da biblioteca. Armazene a 4 ° C.
Sistema de eletroforese capilar baseado em chipAgilent TechnologiesG2940CAO Agilent 2100 BioAnalyzer é usado para verificar a qualidade das bibliotecas ChIP-Seq. Manter os reagentes a 4 °C.
Kit de preparação da biblioteca ChIP-Seq (KAPA Hyper Prep Kit)KK8504Kapa Biosystemscontém reparo final KAPA e mistura de enzimas de cauda A, reparo final e tampão de cauda A, DNA ligase, tampão de ligação, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) e mistura de primer de amplificação de biblioteca KAPA (10X) (ver também primers de PCR). Adaptadores não estão incluídos. Armazene a -20 ° C.
Kit de preparação de biblioteca ChIP-Seq (alternativa, ThruPLEX-FD Prep Kit)R40048Rubicon Genomicsusa seus próprios adaptadores e primers de alça de haste. Este kit elimina etapas intermediárias de purificação e é tão sensível quanto o KAPA Hyper Prep Kit. Armazene a -20 ° C.
Cluster3 (software)de Hoon et al.http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster não comercial
FastQC (software)Simon Andrewshttp://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc não comercial
Fluorometerlife technologiesQ32866Qubit 2.0
Fluorômetro reagenteslife technologiesQ32851O kit fornece reagente de ensaio concentrado, tampão de diluição e padrões de DNA pré-diluídos para o fluorômetro Qubit. Armazene os padrões de DNA em 4 ° C, tampão e corante à temperatura ambiente.
FormaldeídoSigmaF8775-4X25MLSolução de formaldeído, para biologia molecular, 36,5-38% em H2O, estabilizada com 10-15% de metanol. Armazene em temperatura ambiente. CUIDADO: O formaldeído é corrosivo e altamente tóxico.
Gel (E-Gel EX agarose, 2%)life technologiesG4010Gel pré-moldado com 11 poços, formato que pode ser aberto. Deixe uma faixa entre a escada e a biblioteca vazia para evitar contaminação cruzada. Armazene os géis em temperatura ambiente.
Tecnologias de vida útildo sistema de eletroforese em gelG6465E-Gel iBase e E-Gel Safe Imager kit combinado para bibliotecas ChIP-Seq de seleção de tamanho.
Kit de extração de gelQiagen28706Armazene todos os reagentes em temperatura ambiente. Use 500 µ l de tampão QG por 100 mg de fatia de gel de agarose a 2% para extrair DNA. Use colunas MinElute (do kit de purificação MinElute PCR) para eluir o DNA duas vezes.
HOMER (software)Chris Bennernão comercialhttp://homer.salk.edu/homer/index.html
Forno de hibridizaçãoTechneFHB1DHybridizer HB-1D
IGV (software)Robinson et al.http://www.broadinstitute.org/igv/home não comercial
Illumina CASAVA-1.8 filtro de qualidade (software)Assaf Gordonhttp://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filtercomercial
Java TreeView (software)Alok Saldanhanão comercialhttp://jtreeview.sourceforge.net
Laboratory jackEdu-LabCH0642Este conector é usado para elevar a amostra no gabinete de som para sonicação.
Escada, 100 pbNew England BioLabsN3231Mantenha 1x solução à temperatura ambiente. Armazene o estoque a -20 °C.
Escada, 1 kbNew England BioLabsN3232Mantenha 1x solução em temperatura ambiente. Armazene o estoque a -20 °C.
Tubos de microcentrífuga de baixa retenção de 1,5 mllife technologiesAM12450tubos de microcentrífugas antiaderentes e livres de RNase, 1,5 ml
MACS2 (software)Tao Liunão comercialhttps://github.com/taoliu/MACS
Magnetic beadslife technologies11201DEstes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com IgG anti-rato de ovelha policlonal purificada por afinidade ligada covalentemente à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.
Tecnologias de vida de contas magnéticas11203DEstas Dynabeads são contas superparamagnéticas com IgG anti-coelho de ovelha policlonal purificada por afinidade covalentemente ligadas à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.
Magnetic beadslife technologies10001DEstes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com proteína recombinante A covalentemente ligada à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.
Magnetic beadslife technologies10003DEstes Dynabeads são grânulos superparamagnéticos com proteína G recombinante ligada covalentemente à superfície do grânulo. Armazene a 4 ° C.
Tecnologias de vida útil do rack magnético12321DDynaMag-2 ímã
MEMEBailey et al.não comercialhttp://meme.nbcr.net/meme/
Na3VO4New England BioLabsP0758O ortovanadato de sódio (100 mM) é um inibidor geral comumente usado para proteínas fosfotirosil fosfatases. Armazene a -20 ° C.
NaFNew England BioLabsP0759O fluoreto de sódio (500 mM) é comumente usado como inibidor geral de fosfosseril e fosfotreonil fosfatases. Armazene a -20 ° C.
Máquina NGSIlluminaSY-301-1301Analisador de Genoma IIx
Máquina NGS (alto desempenho)IlluminaSY-401-2501HiSeq
Soro normal (controle de anticorpos)Santa Cruz Biotechnologysc-2028Use como controle para anticorpos IgG policlonais de cabra em experimentos ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.
Soro normal (controle de anticorpos)Santa Cruz Biotechnologysc-2025Use como controle para anticorpos IgG policlonais de camundongo em experimentos de ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.
Soro normal (controle de anticorpos)Santa Cruz Biotechnologysc-2027Uso como controle para anticorpos IgG policlonais de coelho em experimentos de ChIP-qPCR. Armazene a 4 ° C.
Solução de coloração de ácido nucleicoiNtRON21141Use a solução de coloração de ácido nucleico RedSafe a 1:50.000. Armazene em temperatura ambiente.
Laranja GSigmaO3756-25G1-fenilazo-2-naftol-6,8-ácido dissulfônico sal dissódico. Armazene a 4 ° C.
Primers de PCR, por exemplo, IDT ou SigmaPrimers para enriquecer fragmentos de DNA ligados a adaptadores por PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G e CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, ligação fosforotioato. Primers desenhados por Ethan Ford. Combine primers em 5 µ M cada. Use 5 µ l em um 50 µ l reação de PCR. Armazene a -20 ° C.
Kit de purificação de PCR MinElute Qiagen28006para purificação de amostras de teste de ChIP-qPCR e cisalhamento. Armazene as colunas de rotação MinElute a 4 graus; C, todos os outros tampões e tubos de coleta à temperatura ambiente.
Fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1, pH 7,9)tecnologias de vidaAM9730Fenol: Clorofórmio: IAA (25: 24: 1) é pré-misturado e fornecido em pH 6,6. Use o tampão alcalino Tris fornecido para aumentar o pH para 7,9. Armazene a 4 graus C. CUIDADO: fenol: clorofórmio: álcool isoamílico é corrosivo, altamente tóxico e combustível.
Primer3 (software)Steve Rozen & Helen Skaletskycomprimidos inibidores deprotease de http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
Roche11836170001completos, Mini, sem EDTA. Use 1 comprimido por 10 ml. Armazene a 4 ° C.
Os comprimidos inibidores de proteaseRoche11873580001completos, sem EDTA. Use 1 comprimido por 50 ml. Armazene a 4 ° C.
Proteinase Klife technologiesAM2548solução de proteinase K (20 µ g/µ l). Armazene a -20 ° C.
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SAMtools (software)Li et al.http://samtools.sourceforge.neta não comercial
Esferas de imobilização reversíveis em fase sólidaBeckman CoulterA63882As contas Agencourt AMPure XP são usadas para minimizar a contaminação do dímero do adaptador nas bibliotecas ChIP-Seq. Armazene a 4 ° C.
Sonicator 3000Misonix/QsonicaModelos mais recentes já estão disponíveis. Q125, Q500 ou Q700 são todos adequados para cisalhamento de cromatina reticulada.
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Thermomixereppendorf22670000Thermomixer para 24 tubos de 1,5 mL. Controle preciso de temperatura de 4 > C acima da temperatura ambiente a 99 °C.
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Referências

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