A imuno-histoquímica e Rotulagem múltipla com anticorpos da espécie hospedeira Mesmas para Estudar Adulto Hippocampal Neurogênese

Resumo

Este artigo em vídeo ilustra um protocolo abrangente para detectar e quantificar todos os estágios da neurogênese do hipocampo adulto dentro da mesma seção de tecido. Elaboramos um método para superar as limitações da imunofluorescência múltipla indireta que surgem quando anticorpos adequados de diferentes espécies hospedeiras não estão disponíveis.

Resumo

Neurogênese adulta é altamente regulado, processo multi-estágio em que novos neurônios são gerados a partir de uma célula-tronco neurais ativadas via cada vez mais comprometidos subtipos progenitoras intermediários. Cada um destes subtipos expressa um conjunto de marcadores moleculares específicos que, em conjunto com os critérios morfológicos específicos, podem ser usadas para a sua identificação. Tipicamente, técnicas de imunofluorescência, são aplicadas envolvendo anticorpos específicos de subtipo em combinação com marcadores de proliferação exo- ou endógenos. Descrevemos aqui immunolabeling métodos para a detecção e quantificação de todas as fases da neurogénese no hipocampo adulto. Estas incluem a aplicação de análogos da timidina, perfusão transcardial, processamento de tecidos, recuperação antigênica induzida por calor, ABC imunohistoquímica, múltiplos de imunofluorescência indireta, microscopia confocal e quantificação de células. Além disso, apresentamos um protocolo de imunofluorescência sequencial de múltiplas que contorna problemas usually decorrente da necessidade do uso de anticorpos primários levantados nas mesmas espécies hospedeiras. Ele permite a identificação precisa de todos os subtipos progenitoras do hipocampo, juntamente com um marcador de proliferação dentro de uma única seção. Estas técnicas são uma ferramenta poderosa para o estudo da regulação dos diferentes subtipos progenitoras em paralelo, o seu envolvimento em patologias cerebrais e o seu papel em funções específicas do cérebro.

Introdução

Duas regiões do cérebro constitutivamente gerar novos neurónios ao longo da vida, a zona subventricular dos ventrículos laterais e na zona subgranular (SGZ) do giro dentado do hipocampo (DG). Os neurônios recém-nascidos derivam de células progenitoras neurais e passam por diferentes estágios de desenvolvimento morfológico e fisiológico antes de atingirem a maturidade ^1,2. A partir de uma glia-like radial células estaminais lentamente dividindo (tipo 1) estágios consecutivos de trânsito amplificando surgem células progenitoras intermediários. Os subtipos mais indiferenciadas (tipo 2A e tipo 2b) tem uma forma irregular, processos com tangenciais curtas. Geram neuroblastos (Tipo 3) que, gradualmente, sair do ciclo celular para se tornar neurónios imaturos (com dendrites estendido para a camada molecular) e, finalmente, integrar na rede de células granulares do hipocampo como maduros. Devido às suas características fisiológicas específicas dessas células fornecer o circuito com maior plasticidade ³ suggesting um papel único na função do hipocampo. Na verdade, os estudos sobre a última década gerou provas substanciais de que a neurogênese adulta contribui para a memória espacial, a separação padrão e comportamento emocional ^4,5.

Neurogénese adulto pode ser estudada utilizando diferentes abordagens. Análogos da timidina incorporar em DNA durante a fase S do ciclo celular e permitir o nascimento de encontros, quantificação e análise de células de destino ^{6-8-nascidos.} Aplicação sequencial de diferentes análogos da timidina (eg, CldU Edu ou UDI) pode ser usado para estudar a renovação celular ou populações de células nascidas em diferentes momentos durante o curso de um experimento ^9. Uma alternativa, um marcador para a proliferação celular endógeno é Ki67. Ela é expressa em células em divisão, durante todas as fases do ciclo celular (G1, S, G2, H), excepto na fase de repouso (G0), e o início de G1 ^10,11. Para analisar o fenótipo de populações de células-nascidos no adulto dentate gyrus vários marcadores moleculares específicas de fase podem ser utilizados, tais como a GFAP, nestina, DCX e NeuN ^1,6. GFAP é um marcador de astrócitos maduros, mas também é expresso em células da glia, como radiais na parte frontal do cérebro adulto. Nestin é um filamento intermediário específico para células da glia-like radiais e as células progenitoras intermediários iniciais. DCX é uma proteína associada a microtúbulos expressa em progenitores intermediários, neuroblastos imaturos e neurónios. Com base na (co-) expressão destes três marcadores e as características morfológicas das células marcadas quatro subtipos de células progenitoras distintos podem ser identificados: o tipo 1 (GFAP ^+, nestin ^+, DCX ^-), tipo 2a (GFAP ^-, nestin ⁺ , DCX ^-), tipo 2b (GFAP ^-, nestin ^+, DCX ⁺⁾ e tipo 3 (GFAP ^-, nestin ^-, DCX ^{+) 1.} Co-rotulagem de DCX em conjunto com NeuN, que é expressa nos neurónios pós-mitóticos, permite a diferenciação de immature (DCX ^+, NeuN ⁺⁾ e maduro (DCX ^-, NeuN ⁺⁾ neurônios granulares.

Os marcadores acima mencionados são freqüentemente usados ​​para co-rotulagem de imunofluorescência e microscopia confocal subseqüente ao analisar o número ea identidade das células-nascidos. Isto requer tipicamente anticorpos de diferentes espécies hospedeiras para evitar anticorpo reactividade cruzada indesejada. No entanto, a maioria dos anticorpos primários adequados para investigação neurogénese são levantados, quer em coelhos ou ratinhos (por exemplo, rato α-BrdU, rato α-NeuN, α-Ki67 de coelho, α-GFAP de coelho). Isto leva a sérias limitações no número e combinação de antígenos que possam ser avaliados em uma única fatia. Este, por sua vez, não só aumenta o esforço de coloração, como múltiplas colorações devem ser realizados, mas pode também comprometer a fiabilidade dos resultados. Além disso, alguns antigénios são susceptíveis de formalina induzida por mascaramento epitopo de fixação (por exemplo, Ki67, Nestina). Descrevemos aqui modificações dos protocolos immunolabeling simples e múltipla clássicos (por exemplo, recuperação antigênica, múltiplos immunostaining seqüencial, uso de nestin-GFP camundongos transgênicos ¹²⁾ que superar muitas destas questões. Em particular, o protocolo de imunofluorescência múltipla sequencial permite coloração contra até quatro antigénios diferentes mesmo se parte dos anticorpos é derivado a partir do mesmo hospedeiro. Isto permite a detecção simultânea de tipo 1, tipo 2a, 2b e tipo de células progenitoras do tipo 3, bem como a sua actividade proliferativa dentro de uma única secção.

Protocolo

NOTA: Todos os procedimentos que envolvem animais vivos foram realizadas em conformidade com a directiva EC 86/609 / CEE orientações sobre cuidados e uso de animais de laboratório e aprovado pelo comitê de ética local (Thüringer Landesamt für Lebensmittelsicherheit und Verbraucherschutz).

1. injeção intraperitoneal de timidina Analogs

1. Pesar animais o dia antes da injeção. Calcule a quantidade de timidina analógica necessária para todas as injecções planejadas no dia seguinte, bem como o volume de injecção individuais ajustados ao peso de uma solução estoque de 10 mg / ml.
2. Prepare / ml solução estoque timidina 10 mg. (CUIDADO! Análogos da timidina são tóxicos. Siga as Fichas de Dados de Segurança específicas (MSDS) prestados pelos fornecedores, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um exaustor química).
   1. Tome timidina analógico a partir do congelador e trazê-lo até à temperatura ambiente, aproximadamente. 21 ° C. Pesar 10 mg e adicionarsolução salina estéril (para BrdU e CldU) ou NaOH 0,04 N (em solução salina estéril, por IdU), vortex. Colocar por pelo menos 10 - 15 minutos num banho a 50 ° C e água cada vórtice de 2 - 3 minutos para dissolver o pó.
      NOTA: Utilizar soluções para até 24 horas quando armazenada à temperatura ambiente e durante várias semanas a -20 ° C. Proteger as soluções da luz (cubra com papel alumínio). Sempre verifique se há precipitados e re-dissolver, se necessário.
3. Contenha o mouse pela nuca e intraperitoneal injetar um volume apropriado, ajustada ao peso da solução de (pelo RT) utilizando uma seringa de dosagem bem com uma agulha G 30.
   NOTA: No caso de CldU e IdU têm de ser administrados sequencialmente dentro de um mesmo animal, considerar a injectar concentrações equimolares (por exemplo, de 42,5 mg / kg de CldU e 57,5 mg / kg IdU, que correspondem a 50 mg / kg de BrdU). Portanto, ajustar os volumes de injecção das soluções de 10 mg / ml em conformidade.

2. Preparação de tecidos

1. Prepare formaldeído a 4% em 0,1 M de tampão de fosfato pH 7,4 no dia antes da perfusão. Armazenar a 4 ° C.
2. Transcardialmente perfundir os ratinhos anestesiados profundamente (3,5% de isoflurano) através do ventrículo esquerdo com 10 ml de PBS gelado, em seguida, com 40 ml de gelo-frio formaldeído (taxa de fluxo de 5 ml / min). Dissecar o cérebro e pós-fix no mesmo fixador durante 24 horas a 4 ° C.
3. Transferir os cérebros consecutivamente em 10% (24 h a 4 ° C) e 30% de sacarose (até as pias cerebrais, aprox. 48 h). Para o congelamento, lentamente submergir os cérebros crioprotegidos em -25 ° C isopentano até sem bolhas surgem a partir do tecido. Armazenar a -80 ° C.
4. Corte cortes coronais de 40 m de espessura em um micrótomo de congelação (temperatura do bloco a -25 a -16 ° C). Secções de transferência sequencialmente em solução anticongelante contendo poços de uma placa de 24 poços de cultura de células (ver Figura 1). Armazenar a -20 ° C.

Figura 1. Ilustração esquemática de transferência de fatias do micrótomo em uma placa de 24 poços. Comece na A1 e coloque fatias subsequentes na fileira A, após A6 ir para a próxima linha B e assim por diante. Ao atingir D6, volte para A1 e continuar. Este arranjo de fatias permite a quantificação de cada ^enésima secção de um cérebro inteiro. Para a quantificação de células recém-nascidas tomar todos os 6 ^th secção cérebro (equivalente ao conteúdo de uma coluna), para imunofluorescência fenotipagem tomar cada 12 ^th secção (equivalente ao conteúdo de duas fileiras alternadas de uma coluna).

3. Immunostaining

NOTA: As seções são processadas livre flutuação, normalmente em placas de 6 poços equipados com uma placa de suporte e inserções de malha. Como exceção, o bloqueio, incubações de anticorpos e reação ABC são feitos em 12 ou 24 poços placas sem inserções de malha (0,5 a 1 ml por well é suficiente, dependendo do número de fatias que têm de ser marcadas). Durante estas etapas, transferir seções com a ajuda de um pincel fino (enxaguar com cada nova solução). Todas as incubações são realizadas com agitação contínua (máx 150 rpm).

1. A imuno-histoquímica (método ABC)
   1. Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente anti-congelante.
   2. Incubar durante 30 min em 1,5% de H ₂ O ₂ em TBS-T, para extinguir a actividade da peroxidase endógena. Preste atenção ao borbulhar e re-submergir seções se necessário. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
   3. Opcional: Entretanto pré-aquecer uma câmara de aquecimento e HCl 2 N a 37 ° C. Incubar secções durante 30 min a 37 ° C em HCl 2 N para desnaturar o ADN. Delicadamente seções separadas com a ajuda de um pincel.
   4. Opcional: Neutralizar secções durante 10 minutos em 0,1 M de borato de pH8,5, RT. Durante a transferência, pincelar brevemente as inserções de malha contendo as seções sobre uma toalha de papel para remover restos de HCl. Lavar duas vezes em TBS durante 15 minutos cada.
   5. Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e para bloquear os locais de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA.
   6. Incubar em anticorpo primário diluído em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
   7. Incubar em anticorpo secundário biotinilado diluído em TBSplus, 3 horas à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada. Enquanto isso ...
   8. Prepare complexo ABC de acordo com o protocolo do fabricante (1% A + B 1% em TBS-T). Deixa-se repousar durante 30 min à temperatura ambiente antes da sua utilização. Incubar em secções reagente AB durante 1 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
   9. Preparar 50 ml de 0,5 mg / ml de DAB em TBS-T, por 6 ou 12 poços, dividida em duas metades e pipetas 4 ml ou 2 ml por poço, respectivamente. Seções transferência para solução de DAB (CUIDADO! DAB é tóxico. Siga o específic MSDS fornecidas pelo fornecedor, ou seja, usar casaco e luvas de laboratório, use um fume hood química).
   10. Adicionar 0,5 ml de 1% _de H ₂ O ₂ para a solução DAB 25 ml restantes, misturar e pipeta volumes equivalentes, tal como acima, para cada poço para iniciar a reacção de peroxidase. Incubar por 12 min. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
   11. Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem permanente.
   12. Opcional: contracorante antes de colocar a lamela (ver secção 3.5).
       NOTA: Se a relação de sinal-para-ruído é baixo por causa da elevada interferência de fundo, repetir H ₂ O ₂ de tratamento após a incubação com o reagente de AB (passo 3.1.8).
2. Múltiplo-imunofluorescência
   1. Imunofluorescência múltipla de solteiro ou simultânea
      1. Transferir seções de anticongelante em TBS e enxaguar bem (uma vez O / N a 4 ° C, 5 vezes a TA durante 10 min cada) para remover completamente umtifreeze.
      2. Opcional: como as etapas 3.1.3 - 3.1.4.
      3. Incubar em TBSplus para permeabilizar o tecido e bloquear os sítios de ligação de anticorpos não específicos, 1 h à TA.
      4. Incubar em cocktail de anticorpo primário (por exemplo, α-BrdU de rato, cobaia α-DCX, α-GFP) de cabra diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
      5. Incubar em coquetel de anticorpos secundários fluorochrome conjugado (por exemplo, Rhodamine Red α-rat, Alexa-647 α-cobaia, Alexa-488 α-cabra; todos derivados de burro) diluído em TBSplus, 3 horas à temperatura ambiente ou O / N a 4 ° C. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada.
      6. Seções de montagem para as lâminas em gelatina, o ar seco O / N. Lamela com meio de montagem aquoso.
   2. Imunofluorescência múltipla seqüencial com anticorpos primários de espécies hospedeiras mesmos
      1. Como as etapas 3.2.1.1 - 3.2.1.3.
      2. Incubar em fiprimeiro anticorpo primário (por exemplo, α-antigénio de coelho A), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      3. Incubar em primeiro anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, vermelho de rodamina-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. A partir de agora proteger as seções da luz. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      4. Incubar em 10% de soro normal a partir do mesmo host que os anticorpos primários (por exemplo, soro de coelho) por 3 hr RT para saturar paratopos abertas no primeiro anticorpo secundário. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      5. Incubar em TBSplus com 50 ug / fragmentos Fab monovalentes unconjugated ml contra o exército dos anticorpos primários (por exemplo, IgG α-coelho (H + L)) para cobrir epítopos que poderiam ser reconhecidos pelo segundo anticorpo secundário, O / N no 4 ° C.
      6. Lavar pelo menos 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada. Durante a transferência, swa brevementeb as inserções de malha contendo os cortes em uma toalha de papel para remover quaisquer restos Fab.
      7. Incubar em segundo anticorpo primário (por exemplo, de coelho α antigénio-B), O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      8. Incubar em segundo anticorpo conjugado com fluorocromo secundário (por exemplo, Alexa-488-conj. Α-coelho de burro), 3 h RT. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
         NOTA: Para identificar antígenos com anticorpos de diferentes espécies hospedeiras adicioná-los para a etapa 3.2.2.2 e os respectivos anticorpos secundários para a etapa 3.2.2.3.
   3. Um dos anticorpos secundários provenientes mesma espécie como um dos anticorpos primários
      NOTA: Este protocolo é adequado para quadruple-coloração contra BrdU ou Ki67 juntamente com GFAP, nestin-GFP e DCX.
      1. Siga rigorosamente o protocolo passos 3.2.1.1 - 3.2.1.5. Até este ponto utilizar apenas soro de burro em TBSplus.
      2. Incubar em TBSplus contendo 3% de soro de cabra durante 1 h à TA. Isto cobre paratopos abertas no anticorpo secundário de cabra-α. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      3. Incubar em AMCA conj. α-cabra de coelho diluído em TBSplus, TA 3 horas ou O / N a 4 ° C. Lavar três vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
   4. Co-coloração CldU, IdU
      1. Lavar, desnaturar e neutralizar seções como descrito no ponto 3.2.1 (passos 3.2.1.1 - 3.2.1.2).
      2. Incubar com 20 ug / ml de fragmentos Fab não conjugados α-IgG de ratinho (H + L) em TBSplus, 1 h à TA. Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      3. Incubar em cocktail de anticorpo primário contendo α-BrdU de rato (1: 400; purificado IgG2), e rato α-BrdU (1: 350) diluídos em TBSplus, O / N a 4 ° C. Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      4. Incubar em cocktail de anticorpo secundário contendo de burro biotinilados α-rato (1: 500) e FITC-conj. burro α-Rato fragmentos Fab (1: 100). Lavar 3 vezes em TBS e uma vez em TBS-T durante 10 min cada.
      5. Incubar em vermelho-Rodamina conj. Estreptavidina, 2 h à TA. Lavar 3 vezes em TBS durante 15 minutos cada, montagem e lamela como acima.
   5. A amplificação do sinal de fluorescência em ratinhos nestina-GFP
      1. Adicionar cabra α-GFP para o cocktail de anticorpo primário.
      2. Adicionar um anticorpo secundário conjugado com fluorocromo propriedades espectrais semelhantes a GFP (tais como Alexa 488 conj. Α-cabra de burro) para o cocktail de anticorpo secundário.
3. Recuperação Epitope
   1. Realizar recuperação antigênica após enxaguar anticongelante. Pré-aqueça o vapor com 6 ou 12 poços contendo placas de tampão citrato 0,1 M pH 6,0-95 - 99 ° C (aproximadamente 25 minutos).
   2. Transfira as seções para o tampão citrato quente e vapor durante 30 minutos (cobrir as placas com folha de alumínio como plástico lids não são resistentes ao calor).
   3. Colocar imediatamente as placas num banho de gelo para arrefecer. Isso ajuda a proteger a morfologia do tecido, o que é de particular importância quando se trabalha com secções de cérebro de animais após o nascimento.
   4. Lavar 3 vezes em TBS durante 10 minutos cada para lavar e neutralizar o citrato e continuar a coloração.
4. Anticorpos de rato sobre o tecido do mouse
   1. Adicionar / ml de fragmentos de 20 ug monovalentes Fab α-IgG de ratinho (H + L; mesmas espécies hospedeiras-anticorpo secundário) do que para o primeiro passo de bloqueio (por exemplo, o passo 3.1.5 ou 3.2.1.3).
   2. Lavar 4 vezes em TBS e uma vez em TBS-T por 10 min cada, e prosseguir com respectivo protocolo.
5. Cresyl counterstaining violeta
   1. Pré-aqueça solução violeta de cresilo a 60 ° C (em frasco de vidro). Incubar as lâminas na solução quente por 3 min.
   2. Enxágüe em aq. dest. e desidratar 2 vezes durante 1 minuto cada em 70%, 96% e 100% de isopropanol.
   Limpar por 5-6 min em xileno ou um substituto xileno e lamela com um meio de montagem permanente compatível.

Análise 4. Dados

1. Contagem de células coradas em recém-nascidos com peroxidase a cada ^po 6 corte ao longo de toda a extensão rostro-caudal do giro dentado. Use um microscópio de luz em aumento de 400X.
2. Multiplicar o número de células resultantes com o intervalo de intersecção para obter uma estimativa do número total de células recém-nascidas.
3. A imagem de fluorescência marcado secções com um microscópio confocal de laser equipado com lasers adequados e sistemas de filtragem. Leve pilhas de imagens em posições aleatórias ao longo de toda a extensão do giro denteado no aumento de 400X e analisar pelo menos 50 células selecionadas aleatoriamente de interesse por hemisfério para co-rotulagem com outros marcadores.
4. Multiplicar as percentagens calculadas de células co-rotulado (% / 100) com os números totais de células recém-nascidos para calcular absolutonúmero de populações de células específicas de recém-nascidos.

Resultados

Foram aplicados os métodos descritos acima para quantificar e caracterizar células-nascidos nas pós-natais e adultos hipocampo. Portanto, nós utilizamos wildtype e neurogênese deficiente ciclina D2 vazar (Ccnd2 KO) alojados em condições conhecidos por afetar a taxa de neurogênese (ou seja, o ambiente enriquecido, EE) ^13,14. A coloração imuno-histoquímica contra DAB ou Ki67, BrdU, CldU ou IdU revelou consistentemente diferenças no número de células entre os recém-nascidos de tipo selvagem e K...

Discussão

A quantificação e identificação de subpopulações de células-nascidos é uma questão central na pesquisa neurogênese adulta. Combinando marcadores de proliferação e de anticorpos contra as proteínas expressas durante fases específicas da neurogênese adulta permite a detecção imuno-histoquímica destas subpopulações. Alguns dos anticorpos ou combinações de anticorpos específicos requerem condições de coloração.

Rotulagem de divisão de células com análogos da timidina sintéticos ainda é o padrão ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Administração análoga de timidina
5-Bromo-2′-desoxiuridina, BrdU	Sigma-Aldrich	B9285	tóxico (mutagênico, teratogênico)
5-Cloro-2′-desoxiuridina, CldU	Sigma-Aldrich	C6891	tóxico (mutagênico, teratogênico)
5-Cloro-2′-desoxiuridina, CldU	MP Biomedicals	2105478	tóxico (mutagênico, teratogênico)
5-Iodo-2′-desoxiuridina, IdU	MP Biomedicals	2100357	tóxico (mutagênico, teratogênico)
Preparação de tecidos
Isoflurano-Actavis	Piramal Healthcare	700211
Paraformaldeído em pó (PFA)	Riedel-De Hä pt	16005	bomba de
perfusão tóxica e inflamável PD5206	Heidolph Instruments	523-52060-00
Tubulação de laboratório Masterflex Tygon, Ø 0,8 mm	Thermo Fischer Scientific	06409-13
Agulha de alimentação, reta, 21 G, ponta verde-oliva de 1,75 mm, 40 mm	Agnthos	1036
Micrótomo de congelamento Microm HM 400	Thermo Fischer Scientific
Placas multipoços de cultura celular de 24 poços	Greiner Bio-One	662160
Immunohistochemistry
Tefal vitacuisine vaporizador	Tefal	VS 4001
Netwell 24 mm inserções de membrana de malha de poliéster	Corning	3479	pré-carregado em placas de cultura de 6 poços
Inserções de membrana de malha de poliéster Netwell 15 mm	Corning	3477	pré-carregado em placas de cultura de 12 poços
Kit de suporte de plástico Netwell de 6 poços	Corning	3521	para inserções de membrana de malha de poliéster de 24 mm Kit
de suporte de plástico Netwell de 12 poços	Corning	3520	para inserções de membrana de malha de poliéster de 15 mm Kit
Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	PK-6100
DAB (hidrato de cloridrato de 3,3&e;-diaminobenzidina)	Sigma-Aldrich	D-5637	cancerígeno, sensível à luz
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01
Anticorpos primários
Rabbit IgG1 α-Ki67	Novocastra/ Leica Biosystems	NCL-L-Ki67MM1	DAB 1:400/IF 1:100; requer recuperação de epítopos
Coelho α-GFAP, AS-3-GF	Synaptic Systems	173 002	1:500
Goat IgG (H+L) α-GFP	Acris Anticorpos	R1091P	1:300
IgG1 de camundongo α-nestin	Abcam	ab6142	1:200; requer recuperação de epítopos
Cobaia IgG (H+L) α-Doublecortin	Merck Millipore	AB2253	1:500
Rato IgG2a α- BrdU (ascite)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030CX	para detecção de BrdU; DAB 1:500/IF 1:400
Rato IgG2a α-BrdU (purificado)	AbD Serotec/ Bio-Rad	OBT0030	para detecção de CldU; DAB 1:500/IF 1:250-400
Mouse IgG1 α-NeuN	Merck Millipore	MAB377	1:500
mouse IgG1κ α-BrdU	BD Biosciences	347580	Para detecção de IdU; DAB 1:500/IF 1:350
Anticorpos secundários
IgG de &alfa;-cobaia de burro (H+L)-Biotina	Dianova	711-065-152	1:500
IgG de &alfa;-rato de burro (H+L)-Biotina	Dianova	712-065-150	1:500
IgG de &alfa;-camundongo de burro (H+L)-Biotina	Dianova	715-065-151	1:500
IgG de &alfa;-rato de cabra (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares	A11006	1:250
Burro α-cabra IgG (H+L)-Alexa Fluor 488	Sondas Moleculares	A11055	1:250
Burro α-mouse IgG (H+L)-FITC, Fab-Fragment	Dianova	715-097-003	1:100
Burro α-mouse IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	715-605-151	1:250
Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Alexa Fluor 647	Dianova	706-605-148	1:250
Burro &alfa;-rato IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X	Dianova	712-295-150	1:250
Burro &alfa;-coelho IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X	Dianova	711-295-152	1:250
Burro &alfa;-cobaia IgG (H+L)-Rodamina Vermelho-X	Dianova	706-296-148	1:250
Estreptavidin-rodamina Red-X	Dianova	016-290-084	1:500
Cabra α-coelho IgG (H+L)-AMCA	Dianova	111-155-144	1:250, funciona apenas com coelho α-GFAP
Hoechst 33342	Sondas Moleculares	H3570	1:1000
DAPI	Sondas Moleculares	D1306	1:1000
Blocking
Fab-fragmento de burro α-camundongo IgG (H+L)	Dianova	715-007-003	1:20
Fab-fragmento de burro α-coelho IgG (H+L)	Dianova	711-007-003	1:20
Soro normal de burro	Merck Millipore	S30
Soro normal de coelho	Dianova	011-000-010
Soro normal de cabra	Dianova	005-000-001
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7906
Histology
Cresyl violet	Sigma-Aldrich	C5042
Neo-Clear	Merck Millipore	109843	substituto de xileno não tóxico
Neo-Mount	Merck Millipore	109016	meio
Microscopy
Axioskop 2	Carl Zeiss Microscopia
LSM 710	Carl Zeiss Microscopia