Este protocolo descreve como usar o aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro para estimular a diferenciação e a atividade intracelular de cálcio em células neuronais. Esses resultados potencialmente abrem novas aplicações em próteses neurais e estudos fundamentais em neurociência.
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Artigo de método
Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells
Neste artigo
Resumo
Resumo
Estudos recentes demonstraram que os nervos podem ser estimulados de várias maneiras pelo aquecimento transitório associado à absorção de luz infravermelha pela água no tecido neuronal. Essa técnica tem grande potencial para substituir ou complementar as técnicas de estimulação padrão, devido ao potencial de maior localização do estímulo e minimização do contato mecânico com o tecido. No entanto, as abordagens ópticas são limitadas pela incapacidade da luz visível de penetrar profundamente nos tecidos. Além disso, a modelagem térmica sugere que os efeitos cumulativos de aquecimento podem ser potencialmente perigosos quando vários locais de estímulo ou altas taxas de repetição de laser são usados. O protocolo descrito abaixo descreve uma abordagem aprimorada para a estimulação infravermelha de células neuronais. O mecanismo subjacente é baseado no aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro, que podem causar o desencadeamento da diferenciação celular neuronal e aumento dos níveis de atividade de cálcio intracelular. Esses resultados demonstram que os absorvedores de nanopartículas podem potencializar e/ou substituir o processo de estimulação neural infravermelha baseado na absorção de água, com potencial para futuras aplicações em próteses neurais e terapias celulares.
Introdução
Estudos recentes têm demonstrado que o aquecimento transitória associada com a absorção de luz infravermelha por água (comprimento de onda> 1400 nm) pode ser utilizado para induzir potenciais de acção em tecidos nervosos 1 e transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos 2. A utilização de luz infravermelha tem suscitado grande interesse para aplicações em próteses neurais, devido ao potencial de resolução espacial mais fina, a falta de um contacto directo com o tecido, a minimização de artefactos de estimulação, e remoção da necessidade de modificar geneticamente as células antes da estimulação ( conforme exigido no optogenética) 1.<....
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Protocolo
1. Au NRs Preparação
Nota: Au NRs pode ser sintetizado por uma série de receitas 16, ou adquiridos de fornecedores comerciais.
- Medir a densidade óptica inicial (OD) da solução de Au NR via espectroscopia de UV-Vis, por um registo dos valores de absorção de 300 nm a 1000 nm, com uma resolução de 0,5-2 nm. Fazer variar o volume da solução a ser usado com a cuvete disponível.
- Avaliar a concentração molar inicial NP com uma técnica de 17 adequada (por exemplo, UV-Vis, única partícula espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, microscopia eletrônica de transmissão) ou usar os ....
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Resultados
Usando protocolos 1, 2 e 3 descritos aqui, um efeito estimulador sobre a diferenciação foi observada em células NG108-15 neuronais cultivadas com Au PN (Au NRs, poli (estirenossulfonato) -Revestido Au NRs e revestido de silica Au NRs) após o laser exposições entre 1,25 e 7,5 W · cm -2. Imagens confocal de rhodamineB marcado Au NRs demonstrado que as partículas foram internalizadas desde o dia 1 de incubação de 12. A localização foi predominantemente observada no citoplasma da célula, indicando que .......
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Discussão
Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como cultura, diferenciar e opticamente estimular as células neuronais usando absorventes extrínsecos. As características NR (por exemplo, dimensões, forma, comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície e química) e os parâmetros de estimulação do laser (comprimento de onda, tais como, duração dos impulsos, taxa de repetição, etc.) pode ser variada para corresponder a diferentes necessidades experimentais. Os efeitos sobre o comportamen.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer NanoVentures Austrália por apoio de financiamento de viagens e Prof. John Haycock por ter sido sede parcialmente esta pesquisa da Universidade de Sheffield e Ms. Jaimee Mayne por sua ajuda durante as filmagens.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamina | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicilina / estreptomicina | Life Technologies | 15140122 | |
| Anfotericina B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldeído | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-beta; III-tubulina | Promega | G7121 | |
| anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com TRITC | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| UV-Vis espectrômetro | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrífuga | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Incubadora de cultura de células | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Centrífuga de cultura de células | Hettich | Rotofix 32A | |
| Diodo laser | Optotech | 780 nm fibra monomodo - LD acoplado | |
| Fibra óptica | Thorlabs | 780 HP | |
| Medidor de potência | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Microscópio epifluorescente | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide bem | Ibidi | 80826 | |
| Microscópio confocal invertido | Carl Zeiss Microscopia Ltda. | meta-confocal LSM 510 | |
| Osciloscópio | Tektronix | TDS210 |
Referências
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evok....
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Reimpressões e permissões
