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Artigo de método

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

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DOI:

10.3791/52566

⸱

27 de abril de 2015

 ,  , 
1Biotactical Engineering, Faculty of Science, Engineering and Technology, Swinburne University of Technology

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve como usar o aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro para estimular a diferenciação e a atividade intracelular de cálcio em células neuronais. Esses resultados potencialmente abrem novas aplicações em próteses neurais e estudos fundamentais em neurociência.

Resumo

Estudos recentes demonstraram que os nervos podem ser estimulados de várias maneiras pelo aquecimento transitório associado à absorção de luz infravermelha pela água no tecido neuronal. Essa técnica tem grande potencial para substituir ou complementar as técnicas de estimulação padrão, devido ao potencial de maior localização do estímulo e minimização do contato mecânico com o tecido. No entanto, as abordagens ópticas são limitadas pela incapacidade da luz visível de penetrar profundamente nos tecidos. Além disso, a modelagem térmica sugere que os efeitos cumulativos de aquecimento podem ser potencialmente perigosos quando vários locais de estímulo ou altas taxas de repetição de laser são usados. O protocolo descrito abaixo descreve uma abordagem aprimorada para a estimulação infravermelha de células neuronais. O mecanismo subjacente é baseado no aquecimento transitório associado à absorção óptica de nanobastões de ouro, que podem causar o desencadeamento da diferenciação celular neuronal e aumento dos níveis de atividade de cálcio intracelular. Esses resultados demonstram que os absorvedores de nanopartículas podem potencializar e/ou substituir o processo de estimulação neural infravermelha baseado na absorção de água, com potencial para futuras aplicações em próteses neurais e terapias celulares.

Introdução

Estudos recentes têm demonstrado que o aquecimento transitória associada com a absorção de luz infravermelha por água (comprimento de onda> 1400 nm) pode ser utilizado para induzir potenciais de acção em tecidos nervosos 1 e transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos 2. A utilização de luz infravermelha tem suscitado grande interesse para aplicações em próteses neurais, devido ao potencial de resolução espacial mais fina, a falta de um contacto directo com o tecido, a minimização de artefactos de estimulação, e remoção da necessidade de modificar geneticamente as células antes da estimulação ( conforme exigido no optogenética) 1. Apesar de todas estas vantagens, os modelos térmicos desenvolvidos recentemente sugerido que os tecidos / células-alvo pode ser afectada por efeitos cumulativos de aquecimento, quando vários sítios de estímulo e / ou elevadas taxas de repetição são utilizados 3,4.

Em resposta a estes desafios, os pesquisadores têm reconhecido o potencial de usar unidade de absorvância extrínsecabros para a estimulação do nervo para produzir efeitos de aquecimento mais localizadas no tecido. Huang et al. Demonstrou esse princípio usando nanopartículas de ferrita superparamagnéticos para ativar remotamente os canais TRPV1 sensíveis à temperatura em células HEK 293 com um campo magnético 5 de rádio-freqüência. Embora esta técnica pode permitir a penetração mais profunda (campos magnéticos relativamente interagem fracamente com o tecido), apenas as respostas foram registadas ao longo de períodos de segundos, em vez de as durações milissegundo necessários em dispositivos biônicos 5. Da mesma forma, Farah et al. Estimulação elétrica demonstrada de neurônios corticais de ratos com micro-partículas negras em vitro. Eles mostraram precisão em nível celular em estimulação usando durações de pulso na ordem de centenas de ms e energias na faixa de μJ, potencialmente permitindo que as taxas de repetência mais rápidos 6.

A utilização de absorventes extrínsecos também foi aplicado para induziralterações morfológicas in vitro. Ciofani et al. Mostrou um aumento de ~ 40% no crescimento de células neuronais usando nanotubos de nitreto de boro piezoelétricos excitados por ultra-som 7. Da mesma forma, nanopartículas de óxido de ferro endocitose nas células PC12 têm sido relatados para aumentar a diferenciação de neurites de uma forma dependente da dose, devido à activação de moléculas de adesão celular, com o óxido de ferro 8.

Recentemente, o interesse em absorvedores extrínsecos para ajudar a estimulação neural também centrou-se na utilização de nanopartículas de ouro (Au NPS). Au NPs têm a capacidade de absorver a luz laser de forma eficiente no pico plasmónico e dissipar para o ambiente circundante em forma de calor 9. Entre todas as formas de partículas disponíveis, a absorção óptica do nanorods ouro (Au NRs) corresponde convenientemente a janela terapêutica de tecidos biológicos (infravermelho próximo - NIR, comprimento de onda entre 750-1,400 nm) 10. Além disso, no context de estimulação neural, o uso de Au NRs proporciona biocompatibilidade relativamente favoráveis ​​e uma grande variedade de opções de funcionalização de superfície 11. Estudos recentes têm mostrado que um efeito estimulador sobre a diferenciação pode ser induzida após exposições a laser contínua de Au NRs NG 108-15 em células neuronais 12. Da mesma forma, os transientes de cálcio intracelular foram registrados em células neuronais cultivadas com Au NRs após a irradiação com laser modulado com freqüências variáveis ​​e pulso comprimentos 13. Despolarização da membrana celular também foi registada após iluminação por laser NIR de Au NRs em culturas primárias de neurónios do gânglio da espiral 14. A primeira aplicação in vivo com irradiado Au NRs foi demonstrado recentemente. Eom e colegas de trabalho expostos Au NRs em seu pico plasmonic e registrou um aumento de seis vezes na amplitude do potencial de ação do nervo composto (CNaPS) e uma diminuição de três vezes no limiar de estimulação no nervo ciático de ratos. O enresposta hanced foi atribuído a efeitos de aquecimento local que resultam da excitação do pico plasmónico NR 15.

No presente trabalho, protocolos para investigar os efeitos da estimulação do laser em NG108-15 células neuronais cultivadas com Au NRs são especificados. Esses métodos fornecem um simples, mas poderoso, caminho para irradiar populações de células in vitro utilizando técnicas de biologia padrão e materiais. O protocolo baseia-se em um diodo laser acoplada a fibra (LD) que permite um funcionamento seguro e repetitivo alinhamento. As Au NR preparação de amostras e métodos de irradiação a laser pode ser alargada a diferentes formas de partículas e culturas de células neuronais, proporcionando que os protocolos de síntese e de cultura específicos são conhecidos, respectivamente.

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Protocolo

1. Au NRs Preparação

Nota: Au NRs pode ser sintetizado por uma série de receitas 16, ou adquiridos de fornecedores comerciais.

  1. Medir a densidade óptica inicial (OD) da solução de Au NR via espectroscopia de UV-Vis, por um registo dos valores de absorção de 300 nm a 1000 nm, com uma resolução de 0,5-2 nm. Fazer variar o volume da solução a ser usado com a cuvete disponível.
  2. Avaliar a concentração molar inicial NP com uma técnica de 17 adequada (por exemplo, UV-Vis, única partícula espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado, microscopia eletrônica de transmissão) ou usar os valores de concentração fornecidos pelo fornecedor.
  3. Prepara-se uma solução estoque de 5 ml por diluição da amostra inicial de Au NR para atingir uma DO = 1. Para a melhor repetibilidade, manter constante o OD para todas as amostras testadas. Seguir o protocolo do vendedor comercial para a composição do solvente de diluição. Se não tiver certeza, Use água deionizada.
  4. Centrifugar 1 ml da solução de Au NR duas vezes durante 15 min a 7800 xg para remover qualquer excesso de produto químico a partir da solução. Ciclos de centrifugação podem variar em vigor e tempo (por exemplo, 20 min a 5.600 x g) 18.
  5. Remover o sobrenadante e re-suspender as NRs em água deionizada. Como partículas re-suspensão pode formar agregados em solução, prepará-los diariamente para ter os melhores resultados. Alternativamente, armazenar em um frigorífico para não mais do que uma semana. Não congelar.
  6. Antes de utilizar, sob condições de cultura de células, sonicar a solução Au NR durante 5 min e, em seguida esterilizar com luz UV durante 30 minutos (intensidade da radiação UV não menos do que 400 mW ∙ m -2 a 254 nm).

2. NG108-15 celular neuronal Linha Cultura e Diferenciação

  1. Para o meio de cultura de células, preparar 500 ml de meio estéril de Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) contendo 10% (w / v) de soro fetal de vitelo (FCS), 1% (w / v) de L-glutamina, 1%(W / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B.
    Nota: Os suplementos podem ser aliquotado, armazenado a -20 ° C e adicionado ao meio no dia necessária. Meio de cultura celular pode ser refrigerado numa condição estéril durante um período máximo de 1 mês.
  2. Para o meio de diferenciação celular, preparar 50 ml de DMEM estéril contendo 1% (w / v) de L-glutamina, 1% (w / v) de penicilina / estreptomicina e 0,5% (w / v) de anfotericina B.
  3. Cresça NG108-15 células neuronais em 10 ml de meio de cultura de células em frascos T75 em poliestireno numa incubadora com uma atmosfera humidificada (5% de CO2 a 37 ° C). Normalmente, sementes 1,5-2 × 10 5 células em cada frasco para estar pronto em 3-4 dias. Mudar meio de cultura celular a cada dois dias.
    Nota: Para evitar desvios genéticos ou variação, não use as células mais velhas do que a passagem de 21 para experimentos.
  4. Quando 70-80% confluentes em cultura, mudar o meio com meio de cultura de células frescas quente. Mecanicamente separar as células por suavemente KNOCrei o fundo do frasco confluente. Não use tripsina.
  5. Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 600 xg e re-suspender o sedimento celular em 2 ml de meio de diferenciação da célula quente.
  6. Semente 2 × 10 4 células / cm2 em uma cultura de tecidos de poliestireno placa de 96 poços com 200 ul de meio de diferenciação celular. Incubar a experiência durante 1 dia a 5% de CO 2/37 ° C.
  7. Adicionar entre 3,2 × 10 × 1 -4,2 9 0 10 partículas / ml de solução Au NR no dia 2 e incubar por 24 horas adicionais. Não adicione as partículas para os experimentos de controle.
    Observação: Como um controlo alternativo, Au PN com um pico de absorção de comprimento de onda bem diferenciado pode ser utilizado para fins de comparação 14. Para um comportamento celular mais consistente, manter a densidade de células constante e não modificar a superfície bem antes da semeadura de células.

3. Aperfeiçoamento crescimento de neurites

  1. Casalo laser com uma fibra óptica monomodo (abertura numérica = 0,13) e terminá-lo com um conector de fibra (FC conectores são convenientes e comumente disponíveis). Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Para obter os resultados mais eficazes, corresponder ao comprimento de onda de pico do laser para o pico de ressonância de plasmon de NRs.
  2. No dia 3 após a incubação NR, fixar o conector FC para o bem. Irradiar as amostras e os controlos em TA durante 1 min em onda contínua, para diferentes potências de laser. Permitir que a cultura prosseguir durante mais 3 dias em 5% de CO 2/37 ° C. Repetir a irradiação com laser durante um mínimo de 3 medições independentes.
    Nota: Diferentes tempos de irradiação e frequências de pulsação pode ser seleccionado, dependendo da aplicação.
  3. Caracterizar o laser em termos de diâmetro do feixe e irradiação laser (W ∙ cm -2).
    1. Para uma fibra monomodo padrão, use NA = n ∙ sin θ,onde n é o índice de refracção do meio em utilização e θ é a metade do ângulo do cone da luz que sai da fibra (ver Figura 1A). De trigonometria, r = tan θ ∙ d, em que r é o raio do feixe e d é a distância entre a fibra e a amostra. O conector FC coincide com o diâmetro do poço, por conseguinte, iluminando a amostra a uma distância d = 2,70 ± 0,20 mm. Luz sai da fibra em água (n = 1,33), dando r = tan (sin-1 (NA / n)) ∙ d.
    2. Usando esta última equação, calcular o raio do feixe laser, o feixe de área correspondente e a irradiação a laser média (potência do laser dividida pela área do feixe) para o alvo (ver o gráfico de exemplo na Figura 1B). Estes valores representam a irradiância média sobre a área iluminada.
    3. Avaliar os erros para as medições com a teoria geral da propagação de erros.
      Nota: A distância bntre o conector FC e a amostra pode ser medida por fotografias do arranjo experimental e de pós-processamento da imagem utilizando software apropriado (por exemplo ImageJ).
  4. No dia 5, remover o meio de diferenciação de células a partir das experiências e fixar as amostras com 3,7% (v / v) de solução de formaldeído, durante 10 min, em seguida, permeabilizar as células com 0,1% (v / v) de Triton X-100 durante 20 min.
  5. Adicionar 3% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA) para as amostras durante 60 minutos para bloquear os locais de ligação da proteína que não reagiu. Rotular as amostras durante a noite para anti-βIII-tubulina (5 ug / ml em PBS suplementado com 1% de BSA) a 4 ° C.
  6. Incubar as células durante 90 min no escuro com um anticorpo secundário apropriado (anticorpo de ratinho anti-TRITC por exemplo conjugado de IgG) utilizando uma concentração de 0,4-2 ug / ml em 1% de BSA em PBS. Rotular os núcleos celulares com DAPI (0,1 ug / ml em água desionizada) durante 10 min.
    Nota: conjugação de anticorpos e mig concentraçãoht variar de acordo com o protocolo da empresa. Lavar as amostras duas vezes com PBS durante 5 min após cada etapa de coloração.
    figure-protocol-1
  7. Amostras de imagem por epifluorescência ou microscopia confocal, utilizando pelo menos um 20 × objetivo. Escolha do microscópio filtra em conformidade com o anticorpo secundário. Selecione um filtro de DAPI (λ EX = 358 nm; λ EM = 488 nm) para visualizar os núcleos celulares.
  8. Analisar as imagens por avaliar: i) o comprimento de neurites máximo (ficha o comprimento da ponta da neurites para o início do corpo celular), ii) o número de neurites por célula neuronal (resumir todas as neurites por célula) e iii) a percentagem de células com neurites (dividindo o número total de células que expressam βIII-tubulina pelo número total de células com um núcleo corou positivamente) 19.

4. laser-induzida intracelular de Ca2 + de imagem

  1. Prepara-se uma a 20% (w / v) de solução de estoque de Pluronic F-127 por dissolução de 2 g de soluto em 10 ml de dimetilsulfóxido anidro (DMSO). Aquece-se a solução de Pluronic F-127 a 40 ° C durante cerca de 20 min para aumentar a solubilidade. Prepare com antecedência se armazenado à temperatura ambiente.
  2. No dia 3 seguinte NR incubação, preparar uma solução de sal equilibrada (BSS; NaCl 135 mM, KCl 4,5 mM, CaCl 2 1,5 mM, MgCl 2 0,5 mM, glicose 5,6 mM, e 10 mM de HEPES, pH 7,4) e complementado com 5 ? M de Fluo-4 AM durante DMSO e 0,1% (w / v) de Pluronic F-127 solução.
    Nota: solução de BSS pode ser preparado antecipadamente e refrigerados durante um período máximo de 1 mês. Adicione os suplementos (Fluo-04:00 e Pluronic F-127) no dia do experimento.
  3. Remova o meio de diferenciação celular e substituí-lo com a solução de BSS suplementado. Para obter os melhores resultados com um microscópio confocal invertido, incubar as células em um micro-poços da lâmina.
  4. Carga NG108-15 células com Fluo-04:00durante 30 min no escuro a 5% de CO 2/37 ° C. Após o tempo de incubação, as amostras lavar duas vezes com BSS para remover qualquer fluoróforo descarregado extracelular.
  5. Pares a laser com uma fibra óptica de modo simples e clivar a ponta, utilizando técnicas convencionais. Observar a ponta resultante sob um microscópio óptico, para assegurar uma superfície de alta qualidade (ou seja, a ponta deve ser perpendicular ao eixo da fibra e plana sobre a inspecção microscopia).
    1. Medir a potência do laser de saída com um medidor de potência padrão. Insira o fibra entrega a luz em um suporte de fibra óptica e afixá-lo a um microposicionador. Consulte Brown et al. 20 para obter mais detalhes sobre a preparação de fibra óptica e de posicionamento.
      Atenção: Siga as regras gerais de segurança do laser durante a medição da potência do laser (por exemplo, não olhe diretamente para o feixe de laser, usar óculos de segurança a laser durante o manuseio, evitar a exposição a luz difusa para outros usuários de laboratório) <./ Li>
  6. Ligue um osciloscópio para o laser portátil para monitorar a modulação óptica. Use um sinal binário com freqüências variáveis ​​(0,5-2 Hz) e comprimentos de pulso (20-100 ms). Ligue o laser utilizando o sinal de modulação como a lógica transistor-transistor (TTL) de entrada para o microscópio, após a configuração mostrada na Paviolo et al. 13.
    1. Colocar as células sob um microscópio confocal invertido e posicionar a fibra de entrega de luz 250 ± 50 mm de distância a partir da célula alvo em modo de iluminação de transmissão. A esta distância, utilizar as equações apresentadas em 3.3.1 para calcular o raio do feixe para o alvo.
  7. Usar um laser de árgon-ião (488 nm) para excitar o corante Fluo-4 AM internalizado (λ EX = 494 nm; λ EM = 516 nm) e o LD sincronizado para a excitação de NRs endocitose. Realize a imagem de TR de amostras e controles usando pelo menos um objectivo de 40 ×, recolhendo scans de séries temporaiscom 256 × 256 pixels / resolução de quadro no modo de ida e volta, com uma frequência de pelo menos 4 Hz. Realizar uma gravação sem qualquer excitação LD para identificar qualquer interferência com laser de argônio-ion (ruído da linha de base).
  8. Retire o fundo a partir dos dados utilizando adaptativa ponderados penalizados mínimos quadrados algoritmos 21. Traçar as variações induzidas Ca2 + como uma função do tempo. Analisar os picos transientes na intensidade de fluorescência, utilizando software de imagem pós-processamento por thresholding a um nível de três vezes o desvio padrão do ruído de linha de base (3σ).

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Resultados

Usando protocolos 1, 2 e 3 descritos aqui, um efeito estimulador sobre a diferenciação foi observada em células NG108-15 neuronais cultivadas com Au PN (Au NRs, poli (estirenossulfonato) -Revestido Au NRs e revestido de silica Au NRs) após o laser exposições entre 1,25 e 7,5 W · cm -2. Imagens confocal de rhodamineB marcado Au NRs demonstrado que as partículas foram internalizadas desde o dia 1 de incubação de 12. A localização foi predominantemente observada no citoplasma da célula, indicando que ...

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Discussão

Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como cultura, diferenciar e opticamente estimular as células neuronais usando absorventes extrínsecos. As características NR (por exemplo, dimensões, forma, comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície e química) e os parâmetros de estimulação do laser (comprimento de onda, tais como, duração dos impulsos, taxa de repetição, etc.) pode ser variada para corresponder a diferentes necessidades experimentais. Os efeitos sobre o comportamen...

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Divulgações

Os autores não têm interesses conflitantes a divulgar.

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer NanoVentures Austrália por apoio de financiamento de viagens e Prof. John Haycock por ter sido sede parcialmente esta pesquisa da Universidade de Sheffield e Ms. Jaimee Mayne por sua ajuda durante as filmagens.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Au NRSigma Aldrich716812
NG108-15Sigma Aldrich8811230
DMEMSigma AldrichD6546
FCSLife Technologies10100147
L-glutaminaSigma AldrichG7513
Penicilina / estreptomicinaLife Technologies15140122
Anfotericina BLife Technologies15290018
FormaldeídoSigma AldrichF8775
Triton X-100BDHT8532
BSASigma AldrichA2058
Anti-beta; III-tubulinaPromegaG7121
anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com TRITCSigma AldrichT5393
DAPIInvitrogenD1306
Fluo-4 AMInvitrogenF14201
DMSOSigma Aldrich472301
Pluronic F-127InvitrogenP6867
UV-Vis espectrômetroVarian Medical Systems Inc.Cary 50 Bio
Mini centrífugaEppendorfMini Spin
Sonic bathUnisonics AustraliaFPX 10D
Incubadora de cultura de célulasKendroHera Cell 150
Centrífuga de cultura de célulasHettichRotofix 32A
Diodo laserOptotech780 nm fibra monomodo - LD acoplado
Fibra ópticaThorlabs780 HP
Medidor de potênciaCoherentLaser Check
ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscópio epifluorescenteAxon InstrumentsImageX-press 5000A
μ-slide bemIbidi80826
Microscópio confocal invertidoCarl Zeiss Microscopia Ltda.meta-confocal LSM 510
OsciloscópioTektronixTDS210
Microscópio

Referências

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