Mosaic Zebrafish Transgénese para Análise Funcional Genomic de candidatos Genes de cooperação em Tumor Patogênese

Resumo

O objetivo deste estudo é demonstrar como a estratégia de transgênese em mosaico pode ser usada em peixe-zebra para avaliar de forma rápida e eficiente as contribuições relativas de múltiplos oncogenes na iniciação e progressão do tumor in vivo.

Resumo

A análise genômica abrangente descobriu um número surpreendentemente grande de alterações genéticas em vários tipos de câncer. Identificar de forma robusta e eficiente os "drivers" oncogênicos entre esses tumores e definir suas relações complexas com alterações genéticas concomitantes durante a patogênese tumoral continua sendo uma tarefa assustadora. Recentemente, o peixe-zebra emergiu como um importante modelo animal para o estudo de doenças humanas, em grande parte devido à sua facilidade de manutenção, alta fecundidade, vantagens óbvias para imagens in vivo, alta conservação de oncogenes e suas vias moleculares, suscetibilidade à tumorigênese e, o mais importante, a disponibilidade de técnicas transgênicas adequadas para uso em peixes. Modelos transgênicos de câncer de peixe-zebra têm sido amplamente utilizados para dissecar vias oncogênicas em diversos tipos de tumores. No entanto, o desenvolvimento de um modelo de peixe transgênico estável é tedioso e demorado, e é ainda mais difícil e demorado dissecar a cooperação de vários genes na patogênese da doença usando essa abordagem, que requer a geração de várias linhagens transgênicas com superexpressão dos genes individuais de interesse seguida de reprodução complicada dessas linhagens transgênicas estáveis. Portanto, o uso de uma abordagem transgênica transitória em mosaico em peixe-zebra oferece vantagens únicas para a análise genômica funcional in vivo. Resumidamente, os transgenes candidatos podem ser coinjetados em embriões de peixe-zebra do tipo selvagem ou transgênico em estágio de uma célula e podem se integrar em cada célula somática em um padrão de mosaico que leva a genótipos mistos no mesmo animal injetado principalmente. Isso permite investigar de maneira mais rápida e barata se e como os genes candidatos podem colaborar entre si para conduzir a tumorigênese. Por superexpressão transitória de ALK ativado no peixe transgênico superexpressando MYCN, demonstramos aqui a cooperação desses dois oncogenes na patogênese de um câncer pediátrico, neuroblastoma que resistiu à maioria das formas de tratamento contemporâneo.

Introdução

Cancros são doenças progressivas marcados pela acumulação de mutações patológicas, exclusões e ganhos de cromossomos ao longo do tempo. Estas anormalidades genéticas pode afectar vários processos celulares que variam do ciclo celular, morte celular, no metabolismo energético e montagem do citoesqueleto de salientar as respostas, tais como a hipoxia. Assim, tumorigenesis reflete as ações coletivas de várias aberrações genéticas em toda uma gama de processos biológicos. Os recentes esforços de integração genômicas de investigação, incluindo a sequenciação do genoma inteiro, exome seqüenciamento, sequenciamento alvejado, o seqüenciamento de profundidade e estudos de ass....

Protocolo

NOTA: Todos os estudos de peixe-zebra e manutenção dos animais foram feitas de acordo com a Mayo Clinic Institute IACUC-aprovado protocolo # A41213.

1. As construções de ADN para Transgénese

1. Amplificar uma região do promotor de 5,2 kb da dopamina-beta-hidroxilase (d βh) ^8, utilizando o clone de BAC CH211-270H11 (BacPac centro de recursos (BPRC)) como um molde de ADN. Usar um adequado sistema de PCR para a amplificação por PCR de comprimento e precisos de modelos longos de ADN e os seguintes programas do ciclo de PCR: 94 ° C durante 2 min, 10 ciclos de (94 ° C, 15 seg, 50 ° C, 30 seg, 68 ° C, 8 min), seguido ....

Resultados

Para investigar se a sobre-expressão de F1174L ALK mutacionalmente activado ou de tipo selvagem ALK pode colaborar com MYCN na indução de neuroblastoma, que sobre-expressa ou activada humana ou ALK-ALK humano do tipo selvagem sob o controlo do promotor d βh no PSNS de peixes transgénicos que sobre-expressam MYCN. Qualquer uma das seguintes construções, dβh - ALKF1174L ou dβh - ALKWT, foram co-injectado com dβh - mCherr.......

Discussão

Neste estudo representativo, foi utilizado co-injecção transiente e co-expressão de LFA activado com o gene repórter mCherry em MYCN -expressing peixes transgénicos para mostrar que estes genes cooperar para acelerar significativamente o aparecimento de neuroblastoma, consistente com a nossa verificação anterior no composto estável coexpress� peixes transgénicos tanto ALK e MYCN ⁸ activada. Esta abordagem transgénica mosaico possui várias vantagens distintas sobr.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Expanda o sistema de PCR de modelo longo	Roche Applied Science, IN	11681834001
vetor pCR-TOPO	Invitrogen, CA	451641
T4 DNA ligase	New England Biolabs, MA	M0202M
Gateway LR Clonase II enzyme Mix	Invitrogen, CA	11791-100
Gateway® BP Clonase® II mistura enzimática	Invitrogen, CA	11789-020
Sistema PCR RICO EM GC	Roche Applied Science, IN	12 140 306 001
Meganuclease I-SceI	New England Biolabs, MA	R0694S
Nikon SMZ-1500 microscópio de fluorescência estereoscópica	Nikon, NY
Mira digital Nikon Câmera DS-U1	Nikon, NY