Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Resumo

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Resumo

Ambos transcrição e regulação pós-transcricional ter um impacto profundo sobre a expressão dos genes. No entanto, comumente adotadas testes de rastreio baseados em células se concentrar em regulação da transcrição, sendo essencialmente por objectivo a identificação de moléculas-alvo do promotor. Como um resultado, os mecanismos de pós-transcrição são em grande parte a descoberto pela expressão de genes de desenvolvimento de drogas específicas. Descrevemos aqui um ensaio de base celular com o objectivo de investigar o papel da "região não traduzida (3 'UTR a 3) na modulação do destino do seu mRNA, e a identificação de compostos capazes de modificar. O ensaio baseia-se no uso de uma construção repórter da luciferase contendo a UTR 3 'de um gene de interesse integrado de forma estável numa linha celular relevante doença. O protocolo é dividido em duas partes, com o foco inicial no rastreio primário destinado à identificação de moléculas que afectam a actividade de luciferase depois de 24 horas de tratamento. A segunda parte do protocolodescreve o contra-rastreio necessário para discriminar compostos que modulam especificamente a actividade da luciferase por meio da UTR 3 '. Em adição ao protocolo detalhado e os resultados representativos, nós fornecemos considerações importantes sobre o desenvolvimento do ensaio e a validação da batida (s) sobre o alvo endógeno. O ensaio do gene repórter baseado em células descrito vai permitir que os cientistas para identificar moléculas que modulam os níveis de proteína através de mecanismos de pós-transcrição dependentes de uma UTR 3 '.

Introdução

Durante um longo período de regulação de transcrição da expressão do gene foi pensada para desempenhar um importante papel, se não exclusiva no controlo da produção de proteína. Um acúmulo de evidências, no entanto, indica que a regulação pós-transcricional contribui tanto quanto, se não mais do que, a regulação da transcrição para determinar a abundância de proteína celular ^1,2. Controle pós-transcricional da expressão do gene é muito mais complexo e elaborado do que se pensava anteriormente. Na verdade, todas as diversas fases de controle pós-transcricional surgiram para ser regulamentada, incluindo processamento de mRNA, localização, volume de negócios,....

Protocolo

NOTA: A taxa de transferência de tais sistemas de ensaio depende do equipamento de laboratório HTS disponível. Este protocolo é facilitada por um Tecan Freedom EVO 200 robô, que executa o manuseamento de líquidos em formato de 96 poços. A miniaturização para o formato de 384 poços é também possível. O sistema robótico de manuseamento de líquidos está posicionada sob uma câmara de fluxo laminar, a fim de manter as condições assépticas durante todos os passos experimentais. Se não automatização da movimentação de líquido está disponível, o protocolo pode ser facilmente adaptado para o formato de baixa taxa de transferência.

Rastreio primário ....

Resultados

Utilizando a abordagem descrita, que rastreada uma biblioteca de 2.000 composto de potenciais moduladores de mecanismos de controlo pós-transcricional exercida através da 3 'UTR do gene MYCN. A Figura 3 mostra os resultados da despistagem primária exemplificado por uma placa única biblioteca. Sinal da luciferase apresentada como percentagem de controlos tratados com veículo foi obtida por medição da actividade de luciferase em placas em triplicado de células CHP134-mycn3UTR tratados com com.......

Discussão

Este protocolo descreve um ensaio de gene repórter baseado em células com o objetivo de identificar moduladores que visam processos pós-transcricionais dependentes de 3' UTR. Abrange o rastreio primário e o contra-rastreio e, se necessário, pode ser acompanhado por um ensaio de citotoxicidade. O resultado da triagem primária é uma série de compostos candidatos valiosos, cuja reprodutibilidade e especificidade são validadas na contra-triagem.

A identificação de hits primários é baseada em varia.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de cultura 96 poços	Branco PerkinElmer	6005688
StorPlate 96 poços fundo em U (placa de diluição)	PerkinElmer	6008190
100 ml calha descartável para reagentes	Tecan	10 613 048
300 ml reservatório robótico descartável	VWR	PB12001301
Pontas de robô DITI 50  μ l Pontas de	30038607		Tecan
DITI 200  μ l Matriz	de 30038617		Tecan
1.4 ml 2D Código de Barras c, Tubos de Fundo Plano	Sistema	3711
ONE-Glo da Thermo Scientific	Promega	E6120
RPMI	Lonza	BE12-918F
PBS-1x, sem Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17-516F
L-Glutamina 200  mM	Lonza	BE17-605E
FBS	Lonza	DE14-801F
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
A coleção Spectrum (biblioteca composta)	MicroSource Discovery Systems	N/A
Tecan Freedom EVO200 robot	Tecan	N/A
Tecan F200	Tecan	N/A

Robô Estéril Estéril de Ensaio Luciferase Leitor multiplaca