Artigo de método

Novel Microscopia de Força Atômica bioprospecção Based para Isolamento de Morfologia reagentes específicos contra TDP-43 variantes em Esclerose Lateral Amiotrófica

DOI:

10.3791/52584

⸱

12 de fevereiro de 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1School for Engineering of Matter, Transport and Energy, Arizona State University, 2Department of Neurology, Georgetown University Medical Center, 3Department of Pathology, Georgetown University Medical Center

Neste artigo

Resumo

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Usando microscopia de força atômica em combinação com a tecnologia de biopanning, criamos um sistema de biopanning negativo e positivo para adquirir anticorpos contra variantes proteicas específicas da doença presentes em qualquer material biológico, mesmo em baixas concentrações. Obtivemos sucesso na obtenção de anticorpos para variantes da proteína TDP-43 envolvidas na Esclerose Lateral Amiotrófica.

Resumo

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Porque variantes de proteína desempenham papéis críticos em muitas doenças, incluindo TDP-43 em Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS), alfa-sinucleína em doença e beta-amilóide e de tau na doença de Alzheimer, é criticamente importante desenvolver reagentes morfologia específicos que podem direccionar selectivamente Parkinson estes proteína específica da doença variantes para estudar o papel destas variantes na patologia da doença e para potenciais aplicações de diagnóstico e terapêuticas. Nós desenvolvemos novos microscopia de força atômica (AFM) técnicas de bioprospecção base que permitem o isolamento de reagentes que reconhecem seletivamente variantes de proteína de doenças específicas. Existem duas fases principais envolvidos no processo, as fases de panning negativos e positivos. Durante a fase de panning negativo, os fagos que são reativos a antígenos off-alvo são eliminados através de várias rodadas de panning subtrativo utilizando uma série de cuidadosamente selecionados antígenos fora do alvo. Uma característica fundamental no negativofase panning está utilizando imagens AFM para acompanhar o processo e confirmar que todas as partículas de fago indesejados são removidos. Para a fase de deslizamento positivo, o antigénio alvo de interesse é fixa sobre uma superfície de mica e fagos ligados são eluídos e pesquisados ​​para identificar os fagos que se ligam selectivamente o antigénio alvo. A variante da proteína alvo não necessita de ser purificada para proporcionar os controlos negativos adequados panning foram utilizados. Mesmo variantes da proteína alvo que estão presentes apenas em concentrações muito baixas em material biológico complexo pode ser utilizado no passo de filtração positivo. Através da aplicação desta tecnologia, adquirimos anticorpos para proteínas variantes de TDP-43 que são encontrados seletivamente no tecido cerebral humano ALS. Espera-se que este protocolo deve ser aplicável para geração de reagentes que se ligam selectivamente variantes proteicas presentes numa grande variedade de diferentes processos biológicos e doenças.

Introdução

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A presença de variantes de proteína tem sido implicada como um factor na progressão de muitas doenças, incluindo as doenças neurodegenerativas, tais como Alzheimer, Parkinson, ALS e demência fronto-temporal (FTD) 1,2,3,4,5,6,7,8,9 , 10,11. Formas oligoméricas de proteínas da beta-amilóide e alfa-sinucleína está pensado para ser as espécies tóxicas responsáveis ​​pela doença de Alzheimer e de Parkinson, respectivamente 2,3,4,5. Agregados de TAR ADN da proteína de ligação 43 (TDP-43) têm sido associados a ALS e FTD 12,13,14. Portanto reagentes tais como anticorpos que podem atingir selectivamente as diferentes variantes de proteína podem ser ferramentas poderosas para servir como marcadores de diagnóstico e terapêuticas potenciais. Neste estudo, focado no desenvolvimento de reagentes que se ligam selectivamente variantes da proteína TDP-43 implicado em ELA, no entanto a técnica descrita no presente documento deve ser aplicável ao isolamento de reagentes contra uma ampla gama de protein variantes.

Agregação citoplasmática de TDP-43 foi identificado como uma característica patológica em ALS 15,16,17,18,19. Tipicamente TDP-43 encontra-se no núcleo de todas as células de um indivíduo normal, apesar de tender a mover-se entre o citoplasma e núcleo 15,17. Formas No entanto, em ALS agregados de TDP-43 são detectadas no citoplasma de neurónios e células da glia seleccione com concentrações mais baixos encontrados no núcleo, sugerindo o movimento de TDP-43 a partir do núcleo para o citoplasma durante a progressão da doença 16,20. Apesar da agregação de TDP-43 encontra-se na maioria dos casos de ALS, não leva em conta todos os casos, desde 1% a 2% do total de casos de ALS (ou 15% -20% dos casos de ALS familiar) estão ligados a mutações no superóxido dismutase 1 (SOD1) 15,17 gene. Devido ao importante papel da TDP-43, na grande maioria dos casos de ELA, aqui vamos focar no desenvolvimento de reagentes de anticorpos com base que pode se ligar seletivamente a TDP-43 variantes que sãopresentes no tecido cerebral humano ALS utilizando nossas técnicas de bioprospecção baseado romance AFM.

Inicialmente precisamos de um repertório diversificado de ligação do anticorpo domínios. Combinamos três (scFvs) bibliotecas diferente de apresentação de fagos de fragmentos de anticorpos de domínio variável de cadeia única, (Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21). O processo de filtração é dividida em fases panning negativos e positivos. Os fagos das bibliotecas são primeiro submetido ao processo de panning negativo durante o qual os fagos reactivo para fora múltiplos antigénios-alvo são excluídos. Após a conclusão de cada ciclo de prospecção negativa contra cada antigénio fora do alvo, o processo é acompanhado por AFM imagiologia para assegurar que todos os fagos de ligação dos antigénios-alvo fora ter sido removido. Somente após a verificação pela AFM imagem que todos os fagos reativas são removidos podemos avançar para o próximo alvo. Para isolar reagentes contra TDP-43 variantes implicados em ALS utilizamos os seguintes antígenos panning negativos: 1) de BSA para remover fago que se ligam fracamente ou não-especificamente a proteínas; 2) alfa-sinucleína agregado para remover fagos que se ligam a elementos estruturais genéricas de proteínas agregadas; 3) homogenatos de tecido cerebral humano para remover fagos que se ligam a quaisquer proteínas ou outros componentes presentes em amostras pós-mortem de tecido de cérebro humano saudável; 4) imunoprecipitou TDP-43 do cérebro humano saudável para remover fago que se ligam a todos os TDP-43 formas associadas com o cérebro humano saudável; e 5) imunoprecipitada a TDP-43 isolada a partir de homogenatos de cérebro de FTD para remover fago que se ligam TDP-43 variantes associadas com a patologia não-ALS. Após remoção de todo o fago reactivo a todos os antigénios off-alvo, que, em seguida, procedeu-se à fase de filtração positivo durante o qual os fragmentos de anticorpos que se ligam ao antigénio de interesse são isolados, neste caso TDP-43 imunoprecipitada a partir de tecido cerebral humano ALS. Estes anticorpos isolados podem ser reativas a formas de TDP-43 agregados ou modificados.

"> Convencional bioprospecção fago centra-se principalmente na fase de filtração positiva 22,23. Normalmente, o alvo de interesse estiver imobilizado, a biblioteca de fago adicionado e fagos ligados eluídos. Os fagos são então amplificados e adicionado ao alvo novamente. Este processo de amplificação e a incubação geralmente é repetido várias vezes para aumentar a percentagem de fago de ligação positivo. Embora variações deste processo têm sido extensivamente usados ​​para isolar os reagentes de anticorpos contra uma vasta gama de antigénios alvo, que geralmente requer grandes quantidades de antigénio alvo purificada 24,25,26, 27, enquanto que o nosso processo requer apenas pequenas quantidades do antigénio alvo. O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para isolar os reagentes que se ligam selectivamente a antigénios alvo que estão presentes em concentrações muito baixas, sem a necessidade de purificação e a filtração pode ser efectuada directamente contra antígeno presente em amostras de tecidos complexos. O uso de protocolos panning negativas exaustivas como verificadopor AFM garante que clones isolados contra o antígeno positivo deve se ligar seletivamente o alvo, mesmo quando não purificado ou enriquecido.

Kasturirangan e colegas (2003) levaram a cabo um processo de bioprospecção negativo e positivo semelhante para isolar anticorpos reativos ao oligom�ica beta-amilóide utilizando concentração nanograma do alvo 5. Aqui vamos expandir esse processo para permitir a geração de reagentes que se ligam seletivamente a proteína específica da doença variantes diretamente de amostras de tecidos humanos. Em estudos futuros, pretendemos investigar não só o valor diagnóstico dos reagentes isolados aqui, mas também avaliar a sua relevância terapêutica para o tratamento de ELA.

No geral, a nova tecnologia AFM bioprospecção com base deve ser aplicável ao isolamento de qualquer variante da proteína específica da doença em qualquer material biológico sem a necessidade de purificação da proteína ou modificação, mesmo quando o antigénio alvo Concentraçãns são extremamente baixos.

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Protocolo

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1. Produção Phage

  1. Execute todos os processos de produção de fagos e bioprospecção em uma cabine de segurança biológica. Produzir partículas de fagos das diferentes bibliotecas (bibliotecas Tomlinson I e J e folhas de bibliotecas 21) para o processo de bioprospecção usando as instruções do fabricante (http://www.lifesciences.sourcebioscience.com/media/143421/tomlinsonij.pdf).
    NOTA: Nós usamos várias bibliotecas em nosso processo de panning para aumentar a diversidade dos anticorpos disponíveis.
  2. Em resumo, as bactérias de cultura de existências das três bibliotecas em 200 ml de YT 2 × contendo glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° C até DO600 de 0,4.
  3. Adiciona-se 8 x 10 11 de fago auxiliar KM13 a 200 ml de bibliotecas Tomlinson I e J e 8 x 10 11 de fago auxiliar VCSM13 para 200 ml da biblioteca Sheets. Incubar as amostras da biblioteca com o fago auxiliar, durante 30 min a 37 ° C sem agitação.
  4. Centrifugar aculturas a 3000 xg durante 10 min e ressuspender o sedimento de células em 200 ml de YT 2 × com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de canamicina.
  5. Incubam-se as culturas de O / N a 30 ° C com agitação e, em seguida girar durante 30 min a 3300 xg o dia seguinte.
  6. Adicionam-se 50 ml de polietileno glicol (PEG) 8000 em 2,5 M de NaCl para 200 ml de sobrenadante a partir de cada uma das bibliotecas e incubar em gelo durante 1 hr. Após precipitação com PEG, girar as soluções de novo durante 30 min a 3.300 x g.
  7. Adicionar 1-2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o sedimento de células (dependendo do tamanho do grânulo) e transferência para tubos de microcentrífuga.
  8. Incubar partículas de fago em gelo durante 1 hr a 37 ° C com mistura ocasional antes da centrifugação durante 10 min a 11.600 x g. Recolhe-se o sobrenadante e armazenar a -80 ° C.
  9. Antes da congelação, transferir um pequeno volume das partículas de fago a partir de três bibliotecas para um outro tubo de microcentrífuga e titular cada bibliotecaindividualmente usando células TG1 para determinar a concentração. Abaixo está uma descrição do processo de titulação para uma biblioteca.
    1. Cultivar células TG1 de OD 600 de 0,4. Adicionar 990 ul de PBS para 6 tubos de microcentrífuga.
    2. Para o primeiro tubo de adicionar 10 ul de partículas fágicas. Após a mistura, retire 10 ul de um tubo e adicionar ao tubo 2. Repita este passo para os restantes 4 tubos.
    3. Adicionar 200 ul de células TG1 de 6 tubos e adicionar 10 ul de cada uma das seis diluições de fagos para esses tubos. Permitir que as partículas de fago para infectar durante 30 min sem agitação a 37 ° C.
    4. Placa de 100 ul das células Unto Luria-Bertani de ágar placas com 100 ug / ml de ampicilina (LBA). Incubar O / N a 37 ° C e, em seguida, determinar a pfu / mL, utilizando o número de colónias visíveis.

2. Negative Processo bioprospecção

Nota: Evite muitos degelo congelamento dos fagos em todo o processo de bioprospecção. Identidadeeally, o melhor é realizar o maior número de etapas panning negativos quanto possível em um dia. Após a conclusão das rodadas de panning negativo ou positivo contra cada alvo é importante para salvar alguns dos fagos em caso de contaminação em qualquer etapa.

  1. 12 rodadas de Panning negativa contra albumina sérica bovina (BSA)
    1. Adicionar 4 ml de / ml de solução de BSA a 1 mg em PBS a 12 imunotubos e incubar O / N a 4 ° C.
    2. Combinar 1 x 10 12 partículas de fago a partir de cada uma das três bibliotecas (reservar uma pequena quantidade desta mistura de fagos para verificação futura do processo de panning negativo).
    3. Descartar a solução de BSA a partir do primeiro tubo e o tubo de lavar 2-3 vezes com PBS para remover toda a BSA não ligado.
    4. Adicionar as bibliotecas de fago combinados para este primeiro tubo, incubar durante 30 min à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados.
    5. Repita o passo 2.1.3 com o segundo imunotubo e adicione o fago coletadas a partir do passo 2.1.4 do presente immunotube. Repita o passo 2.1.4.
    6. Repetir passos 2.1.3-2.1.4 com os restantes 10 tubos de solução de BSA e o fago não ligado recolhidas após cada incubação.
    7. Para verificar a remoção de todos os ligantes BSA fagos usar AFM. Adicionar 10 ul de fago a partir do passo 2.1.2 e 10 ul de fago remanescente após o passo 2.1.7 separadamente a 10 ug / ml de BSA ligadas a mica clivada. Uma versão resumida do processo AFM é descrito na secção 8.
    8. É importante para salvar uma pequena quantidade de fago depois de terminar as inúmeras rodadas de panning negativa contra cada alvo para verificar o sucesso do processo de filtração.
  2. 10 rodadas de Panning negativo contra diversas formas de alfa-sinucleína
    NOTA: Neste projeto, nós queremos remover fago que poderia ligar outras formas agregadas de proteínas como a alfa-sinucleína (monômero, dímero, trímero, etc.) e por isso vamos eliminar qualquer um destes fagos (o objetivo é eliminar o maior muitos fagos de reação cruzada possível). Permitir purificada alfa-sinucleína agregar por pelo menos 7 dias, para que ambas as formas monoméricas e oligoméricas estão presentes para panning negativo.
    1. Prepare 4 imunotubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína em PBS e 4 imunotubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e incubar O / N a 4 ° C.
    2. Descartar a solução de um dos tubos, com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína, lava-se com PBS e adicionar a biblioteca de fagos recolhida após 12 ciclos de panning negativo com BSA.
    3. Incubar o tubo durante 30 minutos à temperatura ambiente no rotor e recolher os fagos não ligados.
    4. Repita os passos 2.2.3 e 2.2.4 para os restantes tubos com 500 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína e, em seguida, os tubos com 100 ug / ml de agregado de alfa-sinucleína usando o fago não ligado de cada vez recolhidos após o passo 2.2.4.
    5. Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 500 ng / ml de alfa agregada-sinuclea e os fagos após a oitava rodada de panning negativa contra 100 mg / ml de alfa-sinucleína.
    6. Para eliminar todos os fichários negativas contra alfa-sinucleína preparar dois imunotubos extras com 500 ng / ml de agregado alfa-sinucleína e repita os passos 2.2.2-2.2.4.
  3. 10 rodadas de Panning negativa contra saudável Cérebro humano homogeneizado de tecido
    1. Adicionar tampão 1x Sten (50 mM de Tris (pH 7,6), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,2% de NP-40, 0,2% de BSA, PMSF 20 mM e cocktail inibidor de protease) para o tecido cerebral humano 28. Homogeneíza-se a 24.000 rpm durante 1 min, as amostras de centrifugação a 3.000 rpm e recolher o sobrenadante.
    2. Preparar dois imunotubos com 2 ml de 50 ug / ml de tecido de cérebro humano em PBS e 8 imunotubos com 10 ug / ml de tecido de cérebro humano e incubar O / N a 4 ° C.
    3. Repetir passos 2.2.3-2.2.5 primeiro com os tubos contendo 50 ug / ml de tecido de cérebro humano e, em seguida, com os que contêm 10 ug / ml de b humanotecido chuva usando o fago não ligado recolhidas após a panning negativa contra alfa-sinucleína.
    4. Repetir o passo 2.1.8 utilizando o fago após a primeira de deslizamento negativo contra 50 ng / ml de tecido de cérebro humano e o fago após o décimo ciclo de prospecção negativa contra o tecido do cérebro humano.
  4. 8 rodadas de Panning negativa contra Saudável imunoprecipitou TDP-43
    1. Imunoprecipitam saudável proteína TDP-43 a partir de tecido do cérebro humano saudável utilizando o protocolo descrito na secção 9. Devido à menor quantidade de proteína imunoprecipitado, realizar estas rodadas de panning negativo usando mica.
    2. Cleave oito superfícies mica.
    3. Para o primeiro mica adicionar ~ 100 uL de 5 ug / ml de proteína imunoprecipitada e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
    4. Lava-se a mica 5 vezes com PBS com 0,1% de Tween 20 (PBST).
    5. Adicionar 100 l ~ do fago após a filtração negativa contra o tecido saudável do cérebro e incubar durante 5-10 min aRT.
    6. No meio do caminho de incubação da etapa 2.4.5, realizar o passo 2.4.3 usando o segundo mica.
    7. Recolhe-se o fago a partir do passo 2.4.5 e lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
    8. Lave mica do passo 2.4.6 e adicione o fago de 2.4.7.
    9. Repita os passos 2.4.4 a 2.4.9 até o fago é criticado negativamente contra todos os oito mica com a proteína imunoprecipitou. Repita o passo 2.1.7 usando o fago após o primeiro e oito ciclo de prospecção negativo.
  5. 2 Rounds de Panning negativa contra FTD imunoprecipitou TDP-43
    1. Imunoprecipitam TDP-43 proteína do cérebro de indivíduos com FTD.
    2. Cleave 2 superfícies mica.
    3. Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de FTD TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA.
    4. Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
    5. Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43. Incubar durante 5 min.
    6. Recolha os fagos não ligados.
    7. Repeats passos 2.5.3 a 2.5.6 com o segundo mica e o fago não ligado coletadas em 2.5.6.

3. Positivo Panning contra imunoprecipitou TDP-43 a partir de indivíduos com ALS

  1. Imunoprecipitado proteína TDP-43 a partir de cérebros de indivíduos com ELA. Cleave 3 superfícies mica. Adicionar 50 ul de 10 ug / ml de ALS TDP-43 para uma de mica. Incubar durante 5 min à TA. Lava-se a mica 5 vezes com PBST 0,1%.
  2. Adicionar 50 ul do fago coletadas após panning negativa contra saudável TDP-43 para a mica. Incubar durante 5 min.
  3. Recolha os fagos não ligados. Também recolher os fagos ligados utilizando três métodos de eluição. É importante manter todos os fagos recolhidos nestes passos panning separadas.
    1. Em primeiro lugar, adicionar 50 ul de tripsina (1 mg / ml em PBS) a cada um de mica e incubar durante não mais do que 10 min. Recolhe a solução e salvar. Em seguida, adicionar 50 ul de trietilamina 100 mM (TEA) para cada mica e incubar durante não mais do que 10 min. Collect a solução, adicionar um volume igual de 1 M de Tris-HCl, pH 7,4, e guardar.
    2. Em terceiro lugar, adicionar 50 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 directamente para o mica e incubar durante 30 min a 37 ° C. Também adicionar os fagos obtidos pelos dois métodos de eluição em 3.3.1 a 100 ul de TG1 em OD 600 de 0,4 e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  4. Repita os passos 3.1 com um segundo mica.
  5. Leve o fago não ligado coletadas em 3.3.2. usando a primeira mica com ALS TDP-43 e adicioná-lo ao segundo mica com ALS TDP-43. Incubar durante 5 min.
  6. Repita todas as etapas em 3.3 para esses segundo conjuntos de mica.
  7. Combina-se as células TG1 infectadas com os fagos eluídos com tripsina a partir dos dois ALS TDP-43 mica e placa em placas de LBA. Repetir o mesmo processo para a TEA e TG1 fagos eluídos a partir dos dois ALS TDP-43 mica para um total de três placas.
    NOTA: Devido ao envolvimento da TDP-43 em ambos ALS e FTD, alguns dos clones isolados naduas rodadas de panning positivo contra ALS TDP-43 pode ser específico para essa meta, mas alguns podem também ligar FTD. Para melhor isolar ALS clones específicos, tomar o fago não ligado coletadas após duas rodadas de panning negativa contra FTD TDP-43 (uma vez que estes dois ciclos de panning negativo deve ter removido qualquer alvo que é reactivo a FTD TDP-43) e utilizar estes fagos em mais um ciclo de prospecção positivo contra o antígeno ALS TDP-43 em mica (preparar o ALS TDP-43 mica, como descrito acima, em 3,3 e 3,4).
  8. Repita todas as etapas em 3.3 com este terceiro mica ALS e placa das células TG1 infectados nas três placas LBA O / N a 37 ° C. No dia seguinte, contar o número de colônias nas 6 placas LBA com os potenciais clones ALS. Deveria haver menos colônias nas três placas LBA com os potenciais clones ALS após o terceiro ciclo de prospecção positiva em comparação com os três placas LBA após as duas rodadas de panning positivo.

4. A cultura e Phage Produtoion de potenciais clones positivos contra ALS Específico TDP-43

  1. Cresça cada colónia a partir das 6 placas em placas de 96 poços contendo 100 ul de 2xYT com glicose a 1% e 100 ug / ml de ampicilina, num agitador a 37 ° CO / N.
  2. A próxima transferência dia 10 ul dos poços contendo os clones das 3 placas de LBA depois da terceira ronda de separação positiva com a proteína ALS TDP-43 para tubos de microcentrífuga contendo 1 ml de YT 2 × com 1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina .
  3. Adicionar glicerol a todas as culturas em placas de 96 poços a uma concentração final de 15% e congelamento das placas a -80 ° C. Permitir que as culturas de 1 ml a crescer durante 2-3 horas com agitação a 37 ° C.
  4. Adicionar 10 9 de fago auxiliar KM13 e permitir que o fago auxiliar para infectar durante 1 hora a 37 ° C com agitação. Centrifugar as células durante 10 min a 3000 xg, descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose, 100 ug / ml de ampicilina e 50 ug / ml de Kanamycin.
  5. Cultura das células O / N a 30 ° C com agitação. Centrifugar os tubos a 3300 x g durante 30 minutos, transferir o sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga e adicionar 250 uL de PEG / NaCl para cada tubo.
  6. Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Centrifugar os tubos novamente em 3300 xg durante 30 minutos, rejeitar o sobrenadante e adicionar 100 ul de PBS a cada tubo.
  7. Incubar os tubos em gelo durante 1 h. Girar os tubos durante 10 minutos a 11.600 xg, e transferir o sobrenadante para tubos novos. Armazenar os fagos a -80 ° C.

5. Seqüenciamento do potencial Clones ALS

  1. Repetir o passo 4.2 e permitir a culturas a crescer O / N a 37 ° C com agitação. No dia seguinte realizar preps de plasmídeo DNA dos clones de acordo com as instruções do fabricante. Sequenciar os clones usando o apropriado para a frente e primers reverter.

6. Triagem potenciais clones positivos contra ALS TDP-43 Usando ELISA indireta Specific

  1. Adicionar 100 ul de 2,5 ug / ml de ALS, FTD e o tecido cerebral humano saudável para os poços de uma placa de ELISA de alta ligação para cada potencial clone de ALS. Incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta.
  2. Lavar as placas 3 vezes com PBST 0,1%. Adicionar 200 ul de 2% de leite em pó em PBS para o poço e incubar as placas a 37 ° C durante 1 h, com agitação lenta.
  3. Repetir o passo de lavagem e, em seguida, adicionar 100 ul de cada fago diluído, pelo menos, 1/100 em PBS aos poços. Após a incubação e passos de lavagem, adicionar 100 ul de 1 / 1.000 de anti-M13 HRP a cada poço. Lavam-se as placas e visualizar usando o kit de quimioluminescência do substrato femto ELISA.

7. scFv Produção e rastreio utilizando ELISA Indireto

  1. Crescer HB 2151 células para DO600 de 0,4. Adiciona-se 5 ul dos diferentes fagos de 20 ul das células HB 2151. Permitir que os fagos para infectar 30 min a 37 ° C sem agitação. Divida placas LBA nas redes de modoque cerca de 20 clones podem ser semeadas em cada.
  2. Junte 5-10 ul de cada fago bactérias infectadas para a placa e incubar O / N a 37 ° C. No dia seguinte, adicionar colónias individuais de 1 ml de 2xYT com 0,1% de glucose e 100 ug / ml de ampicilina e agitar a 37 ° C durante 3-4 horas até DO600 é igual a 0,6.
  3. Adicionar 1 ml de 1 M de isopropiltiogalactósido (IPTG) a cada tubo e incubar O / N a 30 ° C com agitação. Girar os tubos a 11.600 xg durante 10 min e colher o sobrenadante para o ensaio de ELISA.
  4. Para o teste ELISA seguir os mesmos procedimentos no Capítulo 6, exceto em vez de fagos em 6,5 adicionar o scFv não diluída e para 6,6 adicione 100 ml de 1 / 1.000 9E10 HRP.

8. Processo AFM

  1. Adicionar 10-20 uL do antigénio alvo para a mica clivada e incubar durante 5-10 min. Lava-se a mica 5 vezes com água. Adicionar 10-20 uL dos fagos para o mica e incubar durante 5-10 min.
  2. Lava-se a mica 5 vezes wi novamenteth água e permitem que a mica para o ar seco. Visualize fago ligação usando AFM 1. Execute o processo de imagem AFM usando o modo tocando AFM com um controlador Nanoscope IIIa ao ar a RT 29. As sondas AFM silício tem uma freqüência de ressonância de 300 kHz e uma constante de 40 N / m primavera. Use uma velocidade de varredura de 3,05 Hz e uma resolução de digitalização de 512 amostras / linha.
  3. Processar as imagens por achatamento de base do fundo para assegurar que todos os tamanhos de partícula são comparáveis ​​dentro de cada imagem. Width fagos (não comprimento) pode variar de imagem para imagem devido a outros tamanhos de partículas e área de digitalização, mas nunca irá comprometer a precisão da existência ou não de fago se liga ao antígeno.
  4. Se durante a verificação da AFM para cada conjunto de fagos panning negativos são visíveis na mica, realizar rodadas de adição até que não fagos são detectados antes de prosseguir para o próximo conjunto de panning negativo.

9. Immunoprecipitation do Target Antigen

  1. Ao isolae o antígeno alvo (TDP-43), adicione 250 g de tecido homogeneizar cérebro (do córtex motor), 100 l de 1/100 diluição do anti-TDP 43 anticorpo policlonal e 1x STEN buffer para volume total de 700 mL de uma Eppendorf tubo 28.
  2. Incubar O / N a 4 ° C num rotor. Lavagem A / G agarose com o tampão 1x Sten 2-3 vezes e adicionar 25 ml à mistura de tecido. Incubar a 4 ° C durante 1,5 horas num agitador rotativo e depois centrifugar a 2.000-4.000 rpm durante 1 min.
  3. Remover o sobrenadante e lavar o sedimento uma vez com tampão 1x Sten e 5 vezes com PBS. Adicionar 40-60 uL de tampão 1x Sten ao sedimento e ferver durante 5 min. Depois que as amostras são legais, centrífuga e recolher o sobrenadante. Use de SDS-PAGE e transferência de Western para verificar o sucesso do processo de imunoprecipitação 30.

10. Análise Dot Blot

  1. Cortar papel de nitrocelulose em pequenos retângulos para cada clone, que será testado. Dot 2 ul de ALS, FTD e amostras de tecido cerebral humano saudáveis ​​até o papel de nitrocelulose e deixe secar completamente.
  2. Adicionar 1-2 ml de 5% de leite em pó em PBS e deixar agitar durante 1 hora à TA. Adicionar 1 ml de cada diluição 1/100 de fago e deixá-lo agitar O / N a 4 ° C. Lava-se a membrana 3 vezes durante 10 minutos cada com 0,5% de PBST.
  3. Adicionar 1 ml de 1 / 1.000 de diluição de anti-M13 HRP e deixar agitar durante 1 hora à TA. Repita o procedimento de lavagem e visualizada utilizando solução quimiluminescência ocidental.

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Resultados

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Na Figura 1, o esquema demonstra o processo de deslizamento negativo pelo qual removido fago de ligação antigénios fora do alvo da nossa biblioteca utilizando imunotubos. Inicialmente começou com BSA uma vez que este é um agente bloqueador comum e qualquer fago que iria reagir de forma não específica com esta meta seria problemático em imunoensaios futuras. Em seguida, removeu-ligantes para agregados alfa-sinucleína para eliminar fagos que são reactivos com estruturas genéricas de proteínas agregadas

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Discussão

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Demonstrou-se que variantes proteicas estão envolvidas na progressão de muitas doenças neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson, ELA e FTD1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. O isolamento de anticorpos que podem reconhecer seletivamente esses diferentes alvos variantes de proteínas pode ser reagentes eficazes para estudar, diagnosticar e potencialmente tratar essas doenças. Para gerar esses anticorpos específicos para variantes, desenvolvemos um novo processo de biopanning que utiliza microscopia de força atômica p...

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Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Esta pesquisa foi apoiada por uma concessão do NIH: R21AG042066. Gostaríamos de agradecer a Philip Schulz por suas contribuições na criação de vídeos de captura de tela.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bibliotecas Tomlinson I e JMRC (Cambridge, Inglaterra)
Biblioteca de FolhasMRC (Cambridge, Inglaterra)
2xYTBD Sciences244020
GlicoseAmresco0188-2,5KG
AmpicilinaAmresco0339-25GIrritante
KM13 HelperPhage MRC (Cambridge, Inglaterra)
KanamicinaOmniPur5880
Polietilenoglicol Irritante 8000OmniPur6510
Cloreto de SódioMacron7647-14-5
Fosfato de Sódio DibásicoAmresco0404-1KG
Cloreto de PotássioEMDPX1405-1Potássio
Irritante Fosfato MonobásicoAmresco0781-500GCélulas
TG1 IrritantesMRC (Cambridge, Inglaterra)
Luria-Bertani AgarEMD1.10283.0500
Soro Bovino AlbuminaAmresco0332-100G
STEN tampãoCrystalgen Inc.
ImmunotubesThermo Scientific470319
MicaSpruce Pine Mica24365
Tween 20EMD
TripsinaSigmaT-0303
TrietilaminaSigmaT-0886Glicerol Inflamável
Amresco0854-1LIrritante
Kit de Preparação de Plasmídeo DNAqiagen27106
Pó DesnatadoCravo
96-Well Placa ELISA de Alta LigaçãoCostar3590
Anti-M13 HRPGE Healthcare Life Sciences27-9421-01
ELISA Femto Kit de Substrato de QuimioluminescênciaThermo Scientific37074
Anti-TDP 43 Anticorpo PoliclonalProteinTech10782-2-AP
A/G Contas de AgaroseSanta Cruz Biotechnologysc-2003
HB 2151 CélulasMRC (Cambridge, Inglaterra)
IsopropiltiogalactosídeoTeknova13325
9e10 HRPSanta Cruz Biotecnologiasc-40
Membrana de NitroceluloseBiorad162-0115
CentrífugaInflamável Thermo ScientificSorvall RC 6 +
Nanoscópio IIIa Força Atômica MicroscópioVeeco
AFM SondasVistaProbesT300R-10
Irritante Irritante 33429775 Irritante Leite em Irritante

Referências

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