Visualização de Streptococcus pneumoniae Dentro Microle- cardíacas e remodelação cardíaca Subsequente

Resumo

Streptococcus pneumoniae forma lesões microscópicas discretas e não purulentas no coração. Está delineado o protocolo para um modelo murino de formação de microlesões cardíacas. São fornecidas instruções sobre visualização de microlesões usando microscopia, discriminação entre microlesões precoces e tardias e métodos para detectar remodelação cardíaca em corações de animais convalescentes.

Resumo

Durante a bacteremia Streptococcus pneumoniae pode translocar através do endotélio vascular para o miocárdio e formar bactérias cheios de lesões microscópicas discretas (microlesões) que são notáveis ​​devido à ausência de infiltrado de células imunitárias. Devido a sua liberação de produtos cardiotóxicos, S. pneumoniae dentro microlesões são pensados ​​para contribuir para a insuficiência cardíaca que é freqüentemente observado durante a doença pneumocócica invasiva fulminate em adultos. Nisto é demonstrado um protocolo para a infecção experimental do rato que leva à formação reprodutíveis microlesion cardíaca dentro de 30 horas. Instrução é fornecida na identificação microlesion em hematoxilina & eosina seções coração manchado e as distinções morfológicas entre microlesões precoces e tardias são realçados. Instrução é fornecida em um protocolo de verificação de S. pneumoniae dentro microlesões usando anticorpos contra polissacarídeo capsular e pneumocócicaA microscopia de imunofluorescência. Por último, um protocolo para a intervenção antibiótico que resgata ratinhos infectados e para a detecção e avaliação da formação de cicatriz no coração dos ratos convalescentes é fornecido. Juntos, esses protocolos irá facilitar a investigação dos mecanismos moleculares subjacentes invasão cardíaca pneumocócica, a morte de cardiomiócitos, remodelação cardíaca como resultado da exposição a S. pneumoniae, e a resposta imune para o pneumococos no coração.

Introdução

Internação de adultos para pneumonia adquirida na comunidade (PAC) carrega um risco documentado para eventos cardíacos adversos que contribui para a mortalidade ^1-4. Em um estudo recente realizado por Corrales-Medina et al. Complicações cardíacas foram encontrados para ser associado com e / ou responsáveis ​​por 27% dos óbitos associados à pneumonia ^3. Streptococcus pneumoniae (pneumococo), a causa mais comum de PAC e sepse ^5, foi diretamente associada a eventos cardíacos adversos em tantos como 19% dos pacientes adultos internados ^6. Eventos cardíacos adversos associados com pneumonia incluem falha nova ou agravada cardíaca congestiva, arritmias e infarto do miocárdio em ordem decrescente de freqüência ^{de 6.}

Num artigo recente PLoS Pathogens por Brown et al., S. pneumoniae foi encontrado para ser capaz de translocação através do endotélio vascular cardíaca, a entrada no myocardium, e formação de lesões microscópicas não purulentos discretos (microlesões) cheios de bactérias nos ventrículos durante a doença pneumocócica invasiva (DPI) ^7. Evidência de formação microlesion cardíaca foi observada em amostras cardíacas a partir de primatas não humanos e os indivíduos que tinham sucumbido à infecção pneumocócica. Da mesma forma, camundongos infectados experimentalmente reproducibly desenvolvido microlesões cardíacos. Em camundongos, o tamanho microlesion e número foi positivamente correlacionada com a duração e gravidade de bacteremia, os níveis de troponina cardíaca em soros e eletrofisiologia cardíaca aberrante. A translocação bacteriana para o coração foi observado que ocorre através dos mesmos mecanismos responsáveis ​​pela translocação do pneumococo através da barreira sangue-cérebro e o desenvolvimento de meningite pneumocócica, ou seja, a proteína de ligação a colina A invasão mediada por células endoteliais vasculares em um receptor de laminina e Plaquetas receptor do fator de -activating forma dependente ^8. Microlesformação de iões também exigiu a pneumocócica toxina pneumolisina de formação de poros que foi encontrado para matar cardiomiócitos ^7.

Microlesões cardíacos pneumocócicas são distintas do soft-tecido purulenta e abcessos cardíacos que são causadas por outras bactérias Gram-positivas, incluindo Staphylococcus aureus. Estes são caracterizados por um único focos das bactérias rodeadas por neutrófilos e a deposição de fibrina ^9,10. Microle- formado por S. pneumoniae são menores em tamanho, distribuídos por todo o coração afetado, e carecem de infiltrados de células imunes. Durante as fases iniciais da infecção, microlesões causada por S. pneumoniae aparecem como áreas de tecido danificado ou inflamado reminiscente dos sinais patológicos de cardiomiopatia. Alguns monócitos podem ser observados durante este tempo, no entanto a sua presença é de curta duração e lesões rapidamente tornam-se necróticas na aparência e cheia de bactérias ao mesmo tempo continuar a GRow em tamanho até a morte do animal ou intervenção antimicrobiana. É importante salientar, no prazo de 3 dias de intervenção antibiótico, infiltração de células imunes profusa é observada no antigo local da lesão e isso é acompanhado por deposição de colágeno robusto. Remodelação cardíaca semelhante foi relatado para ocorrer após o infarto, juntamente com consequências duradouras na função cardíaca ^11-15. Assim, microlesões são uma possível explicação para os eventos cardíacos adversos que ocorrem durante o IPD e, possivelmente, o aumento da incidência de mortalidade cardíaca relacionada com em indivíduos convalescentes que sobreviveram o episódio da doença.

Nisto, a instrução é fornecido no modelo experimental de rato IPD e a formação da lesão cardíaca e visualização de microlesões cardíacas em estágios precoces e tardios da infecção. O protocolo para detecção de deposição de colágeno nos animais que foram salvos pela intervenção antimicrobiana é demonstrada. O objetivo deste artigo é o de facilitate a pesquisa de outros pesquisadores sobre esta patologia pneumocócica importante e romance.

Protocolo

NOTA: Todas as experiências com camundongos foram revisadas e aprovadas pelo Animal Care Institucional e Comissões de uso na University of Texas Health Science Center em San Antonio (protocolo nº 13032-34-01C). Cuidados com os animais e os protocolos experimentais aderiram ao Direito Público 89-544 (Animal Welfare Act) e suas alterações, as orientações serviços de saúde pública, e no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA).

1. Infecção

1. Obter ratinhos BALB / c de ambos os sexos com idades entre 10-12 semanas de idade.
   NOTA: S. pneumoniae sorotipo 4 estirpe TIGR4 é um isolado clínico virulenta que foi seqüenciado ^16.
2. Cresça TIGR4 em caldo de Todd-Hewitt a 37 ° C em 5% de _CO2 até atingirem uma densidade óptica (DO) ₆₂₀ de 0,5 (correspondendo a 1,0 x 10 ⁸ unidades formadoras de colónias [] CFU / ml). Agregar a cultura de pneumococos por centrifugação durante 10 min a 3, 500 x g e eliminar o sobrenadante usando uma linha de vácuo. Suspender as bactérias e diluir com solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) a uma concentração final de 1,0 x 10 ⁴ CFU / mL.
3. Utilizando uma câmara de indução, anestesiar ratos com 2,5% de isoflurano vaporizado em oxigênio. Confirme estado de anestesia por pitada toe suave com uma pinça sem corte.
   1. Segurando o rato anestesiado pela sua nuca e na vertical com uma mão, injetar cada rato por via intraperitoneal (ip) com 100 mL da S. pneumoniae suspensão utilizando uma seringa com uma agulha de calibre 27-30 (correspondente a uma dose de desafio de 1,0 x 10 ³ CFU). Coloque a parte de trás do mouse em sua gaiola. Ratos normalmente despertar 30-40 seg após a injeção.
4. Permitir que a infecção para continuar por pelo menos 24 (antecipado) ou 30 (avançado) hr.
   1. Eutanásia dos ratinhos por asfixia com CO _2. Execute deslocamento cervical para garantir rato tem falecido. A eutanásia é ainda confirmada pela remoçãodo coração no passo 1.6.
5. Desinfetar a cauda com um algodão embebido em álcool e cortar uma seção de 2-3 mm. Recolhe 2 ul de sangue em série e diluir o sangue de 10 vezes em PBS contendo heparina de sódio 1 U / ml de cinco vezes. Diluições em série de placa sobre uma placa de agar tríptico de soja sangue e incubar durante a noite a 37 ° C em 5% de CO _2. O próximo dia de extrapolar colónia conta o nível de bacteremia.
6. Imobilizar o mouse em decúbito dorsal sobre uma plataforma cirúrgica. Pulverizar o peito com etanol 70% e seque. Usando uma tesoura cirúrgica e uma pinça abrir a cavidade torácica, retire a caixa torácica, e transecto o diafragma para expor o coração e os pulmões. Usando uma tesoura cortar os vasos sanguíneos ligados ao coração e extirpar suavemente o coração com cuidado para evitar contusões com uma pinça.
7. Lavar o coração com PBS e, em seguida, colocar em cassetes de colheita de amostras de tecidos que tais secções coronais seria obtido durante o corte do tecido. Para inclusão em parafina, place as cassetes em 10% solução tamponada com formalina e no dia seguinte enviar para inclusão em parafina.
   1. Alternativamente congelamento flash usando outubro Composto dentro de um cryomold que foi colocado em gelo seco.

2. A visualização das lesões cardíacas e pneumococos dentro das lesões

1. Reduzir secções de coração embebidos em parafina de tal forma que os quatro câmaras do coração são visíveis na secção de cada tecido. Cortar as lâminas com uma espessura de 5 mm.
2. Desparafinar e mancha slides com hematoxilina e eosina (H & E) usando métodos padrão ^17.
3. Ver H & E manchada seções cardíacos usando um microscópio de luz em baixa (100X, 200X) e alta (imersão em óleo: 400X, 1000X) ampliações. Caracterizar os corações para a presença de microlesões no miocárdio. Aqui, adquirir H & E imagens usando um microscópio Zeiss Axioskop 2 equipado com um 100X 1,3 numérica objetivo abertura Plan-Neofluar.
   NOTA: Em fases iniciais l cardíacaesions são discriminados pela sua aparência colorida diferencial e, em alguns casos, a presença de células imunes (monócitos e granulócitos) que parecem ser monócitos. Nas lesões avançadas, particularmente aqueles observados em 30 horas, as células imunológicas são lesões vacuole-como ausentes e grandes são observados em seu lugar. É importante notar que, enquanto o influxo de células imunitárias durante as fases iniciais do desenvolvimento da lesão cardíaca pode ocorrer não parece ser um requisito.

3. Immunofluorescent Microscopia para pneumococos dentro Microle-

1. Seção coração em cryomolds com microtome a uma espessura de 5 seções um e colocar em lâminas de vidro com carga positiva. Permitir secções cardíacas congelados para descongelar e ar seco. Fix secções durante 10 minutos em 10% de formalina tamponada neutra (pH 6,8-7,2 a 25 ° C).
2. Lavagem das lâminas (3x) em PBS durante 5 min, para permeabilizar 15 min em 0,2% de Triton X-100 em PBS, em seguida, lavar novamente em PBS.
3. Secti tecido Bloco em em lâminas com 10% de soro de cabra em PBS durante 1 hora.
4. Lavar as lâminas com PBS, e incubar tampa com secções cardíacos de coelho anti-pneumococos do serotipo 4 anti-soro a 1: 1000 em PBS com 10% de soro de cabra durante 2 horas a 37 ° C.
   NOTA: Para os controles negativos investigadores devem usar ingênuo anti-soro de coelho
5. Após lavagem com PBS, a tampa e incubar secções com 10% de soro de cabra-PBS com cabra anti-coelho FITC anticorpo conjugado a 1: 2000 durante 30 min a 37 ° C.
6. Seguindo as instruções do fabricante, usar DAPI (4 ', 6- diamidino-2-fenilindolo) em 5 mg / ml para a visualização de núcleos eucarióticos. Lave e montar secções de tecido com FluorSave.
7. Adquirir imagens fluorescentes utilizando um sistema de microscópio confocal tanto a baixa como alta ampliação. Ajustar a abertura numérica em conformidade para se obter resultados óptimos. Aqui, adquirir imagens fluorescentes usando um sistema confocal com um objetivo abertura numérica 60X 1,42.

"> 4. Salvamento Antibiótico de fossa séptica Mice

1. Comece com ratinhos infectados ip com 1,0 x 10 ³ CFU de TIGR4 como anteriormente indicado na etapa 1.
2. Começando às 30 horas pós-infecção, administrar farmacêutica ampicilina grau ip (80 mg / kg de peso corporal) em 100 ul de solução salina a cada 12 h durante 36 h. Recolha corações no ponto de tempo desejado e processo tal como descrito no passo 1.6 para inclusão em parafina e tecido, o seccionamento.

5. Collagen Detection Deposition

1. Usando xileno e lavagens álcool graduado com água, Desparafinar e tecidos hidrato seções deionizada usando métodos padrão ^17. Tratar secções com ácido fosfomolíbdico aquosa a 0,2% durante 5 minutos e lavar com água desionizada durante 5 minutos.
2. Secções mancha com 0,1% de vermelho Sirius em ácido pícrico de 2 h à temperatura ambiente.
3. Lave os cortes em ácido clorídrico 0,01 N durante 3 min e enxaguar utilizando etanol a 70% durante 1 min.
4. Desidrataçãote as seções usando o idêntico, mas a fim de lavagens ao indicado na 5.1 reverter, desidratar seções cardíacas no aumento e classificados concentrações de etanol, em seguida, xileno.
5. Cortes de tecido Mount com uma solução de montagem para avaliação microscópica.
6. Para identificar as regiões de deposição de colágeno, examinar secções de tecido manchado por áreas de coloração leitura profunda com baixa e alta ampliação usando um microscópio de luz. Qualquer área dentro dos ventrículos do coração, que é o vermelho é uma área onde o colágeno tem sido depositado. Áreas sem essa mancha vermelha são locais de tecido saudável falta deposição de colágeno. Aqui, adquirir Picro Sirius Red imagens coradas utilizando um microscópio equipado com um objetivo abertura numérica 20X 0,5.
   NOTA: As manchas vermelhas no átrio tecidos saudáveis.

Resultados

Visualização de microlesões por H & E

Microlesões cardíacas foram observadas nos ventrículos de H & E coradas secções cardíacas de ratos com IPD seguintes seu desafio ip com TIGR4. A Figura 1 demonstra o aumento no tamanho das lesões entre 24 e 30 horas pós-infecção (hpi), com maior número de hematoxilina -stained (ie, azul-púrpura) pneumococos visível no interior da lesão. Microle- foram caracterizadas por uma morfologia semelhante vacúolo, mais de...

Discussão

Neste relatório, um método altamente reprodutível para induzir S. pneumoniae mediada microlesões cardíacos em ratos durante IPD e as técnicas para a sua visualização é demonstrada. Os ratinhos são infectados com uma dose de bactérias que ultrapassa o limiar do sistema imunitário para a depuração, que conduz a bacteremia de alto grau, semelhante ao que ocorre durante a sepsia humano, e leva a uma eventual translocação bacteriana no miocárdio. Por razões ainda desconhecidas, S. pneumoniae no coração é ca...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo Todd-Hewitt	Composto Neogen	7161A
O.C.T;	Tecido-Tek (Sakura Finetek)	4583
Triton X-100	Fisher Scientific (Acros)	9002-93-1
Soro de Cabra Normal	Abcam	ab7481
anti-sorotipo 4 pneumococo anti-soro	Statens Serum Institut	16747
anticorpo conjugado FITC anti-coelho para cabras	Jackson ImmunoResearch	111-096-144
DAPI	Invitrogen	D1306
Fluorsave	Millipore	345789
Permount	Fisher Scientific	S70104
Ampicilina	Sigma	A9393
ácido fosfomolíbdico 0.2%	Ciências de Microscopia Eletrônica	26357-01
0.1% Sirius Red em ácido pícrico	Ciências de Microscopia Eletrônica	26357-02
0.01 N ácido clorídrico	Microscopia Eletrônica Sciences	26357-03
Lâminas de Microscópio de Aderência de Tecido	Polysciences, Inc	24216
Pomada Paralube Vet	Dechra	12920060
Kit de Coloração de Hematoxilina e Eosina	não especificado		padrão