Reforçada Análise Genética de solteiro biopartículas Humanos recuperado por Simplificado micromanipulação de Forensic Evidence 'Toque DNA'

Resumo

Aqui nós descrevemos uma estratégia de remoção otimizada e eficiente para a recolha de bio-partículas presentes em 'toque de DNA' amostras, juntamente com um protocolo de amplificação reforçada envolvendo um de uma etapa 5 jul micro-volume de lise / amplificação STR, para permitir a recuperação de repeat short tandem (STR) perfis do doador (s) bio-partícula.

Resumo

Perfis de ADN pode ser obtido a partir de evidências "toque DNA ', que compreende traços microscópicos de material biológico humano. Os métodos atuais para a recuperação de DNA trace swabs empregam algodão ou fita adesiva para provar uma área de interesse. No entanto, este tipo de abordagem 'blind-swabbing' co-amostra do material genético de diferentes indivíduos, mesmo que as células dos indivíduos estão localizados em locais geograficamente distintos sobre o item. Assim, algumas das misturas de ADN encontradas em amostras de DNA de toque são criados artificialmente pela própria raspagem. Em alguns casos, um ADN alvo pode ser encontrado em excesso significativo de mascaramento do DNA, assim, qualquer agente potencial.

A fim de contornar os desafios com métodos de recuperação e de análise padrão, temos desenvolvido um custo menor, o método "análise inteligente 'que resulta em análise genética melhorada de provas de DNA touch. Nós descrevemos um um otimizadod estratégia de recuperação eficiente a micromanipulação para a recolha de bio-partículas presentes em amostras de ADN de toque, bem como uma estratégia de amplificação aumentada envolvendo um passo de amplificação 5 ul microvolume lise / STR para permitir a recuperação de perfis STR a partir do dador de bio-partícula (s). A utilização de alguns ou indivíduo (isto é, "blocos") biopartículas resulta na capacidade de obtenção de perfis de uma única fonte. Estes procedimentos são as técnicas avançadas alternativas para o isolamento e análise de partículas biológicas individuais de provas de DNA forense toque. Embora não seja necessário em todas as investigações forenses, o método pode ser altamente benéfica para a recuperação de um único perfil de ADN da fonte agente em casos que envolvem agressão física (por exemplo, o estrangulamento) que pode não ser possível, utilizando técnicas de análise normalizadas. Além disso, as estratégias desenvolvidas aqui oferecem uma oportunidade de obter informação genética ao nível de uma única célula a partir de uma variedade de other traço não-forense material biológico.

Introdução

DNA O toque é uma forma de traço evidência biológica que é a transferência direta de material celular (por exemplo, lançar as células da pele) de um indivíduo a um objeto ou outro indivíduo durante o contato físico ^1. A capacidade de obter perfis de ADN a partir de uma variedade de objetos tocados (documentos, roupas de cama, sapatos, armas de fogo, recipientes de bebida, canetas, pasta alças) tem sido relatado na literatura ^2-9.

Um fator crítico na análise das provas de DNA de toque é a recuperação bem sucedida do traço material biológico presente. Toque provas de DNA é normalmente recolhida por raspagem da área suspeita com uma mecha de algodão estéril (referido como "cega-enxugamento"). Usando esta abordagem, a natureza do material biológico recolhido não é conhecido e a amostragem de uma área generalizada é realizada. A presença de sulcos superficiais ou fendas podem impedir a recuperação bem-sucedida do muitas vezes já pequena quantidade de biological presente material. Além disso, uma abordagem de "blind-swabbing" vontade material celular necessariamente co-amostra dos diferentes indivíduos cujas células estão presentes no item, mesmo que as células dos indivíduos estão localizados em locais espacialmente distintos sobre o item. A recuperação de perfis de ADN miscigenadas, que são muitas vezes difíceis de resolver particularmente com amostras de DNA de baixo do modelo, é frequentemente observada ^8,10,11 e em muitos casos será um artefato consequente do processo de enxugamento si. Se apenas uma pequena quantidade de material estava presente a partir de um dos doadores, técnicas de extracção e de análise padrão pode falhar para recuperar um perfil a partir do menor contribuidor. Além disso, o tipo de zaragatoa ou se foi utilizada a seco ou molhado (pré-humedecidos com água estéril) podem influenciar a quantidade de material biológico que é recolhida, devido a diferenças em absortividade e adsorção e a eficiência de libertação do material biológico ^12. Smétodos de extração tandard pode resultar em perda de amostra adicional devido à manipulação física exigida dos passos de exemplo ou de transferência de amostra.

Como descrito acima, as técnicas de esfregar simples para a recuperação de material biológico pode resultar na perda de quantidades vestigiais de amostra biológica, bem como um aumento da ocorrência de perfis misturados devido a uma falha para separar os componentes biológicos individuais. Assim, buscou-se desenvolver estratégias de recuperação mais seletivos e eficientes para a coleção de micropartículas celulares presentes em objetos tocados. A estratégia desenvolvida para a análise de material biológico a partir de provas de DNA toque (referido aqui como "biopartículas", devido ao facto de um núcleo não é sempre visível uma vez que a maioria das células presentes na camada epidérmica mais externa da pele são mortos ou moribundos queratinócitos ¹³⁾ envolve o seguinte: 1) recolha de material biológico (isto é, biopartículas) através de gel de fr-películaom tocou objetos e superfícies, itens de vestuário gastas ou pele humana direta, 2) o exame microscópico do material biológico recuperado para assegurar a cobrança do potencial de material biológico humano, e 3) de micromanipulação de bio-partículas única ou poucas usando um adesivo solúvel em água, e 4) autossômica perfis de ADN-STR dos bio-partículas coletadas usando um microvolume (5 mL) de uma etapa de lise / reacção de amplificação.

Este procedimento oferece inúmeras vantagens sobre os métodos de análise utilizados tradicionalmente. Recuperação de partículas biológicas utilizando o filme de gel permite um exame microscópico do material biológico presente na amostra antes da análise. Embora a maioria das biopartículas recuperados a partir de provas de DNA toque pode não ser células nucleadas tornando-o mais difícil de determinar qual ou quantas bio-partículas deve ser seleccionado, o exame microscópico das amostras antes da análise proporciona a oportunidade para procurar as células nucleadas assim maximizing a probabilidade de recuperação de perfis de ADN. A coleção de biopartículas usando micromanipulação assistida-adesivo solúvel em água permite a transferência direta de biopartículas alvo em tubos de reacção. Este procedimento é visualizado sob o microscópio para garantir o sucesso da transferência de material biológico. A reação reduzida ou microvolume aumenta a sensibilidade e reduzindo o custo de análise por amostra. Isto permite a análise do aumento do número de amostras a partir de uma peça individual de provas. Devido à gama no estado genético de bio-partículas em provas de DNA toque, várias amostragens de itens individuais são recomendados.

Aqui, vamos demonstrar o uso bem sucedido dos protocolos desenvolvidos para obter perfis genéticos altamente probatório dos doadores de material biológico em provas de DNA touch. A coleção biopartícula desenvolvido e métodos de criação de perfil de ADN fornecer uma abrangente 'inteligente' (ou seja, específicos, mensuráveis, attaabordagem baseada inable, realista e oportuno) molecular para a caracterização, análise e interpretação de material biológico de rastreamento. Embora originalmente desenvolvido para aplicação para análise forense de provas de DNA de toque, as estratégias desenvolvidas aqui pode ser aplicado a outras fontes de material biológico e oferecer uma oportunidade para se obter informação de identificação pessoal ao nível da célula individual.

Protocolo

NOTA: Os fluidos corporais foram coletadas de voluntários usando procedimentos aprovados pela University of Institutional Review Board da Flórida Central. Consentimento escrito informado foi obtido a partir de cada dador.

1. Recolha de biopartículas de objetos e superfícies tocadas

1. Cortar o filme-gel para o tamanho desejado. Assegurar que é o tamanho apropriado para a lâmina de vidro a ser usado como suporte sólido. Por exemplo, para um "x 1" lâmina de vidro 3, usar um tamanho de gel de película de 2 "x 0,75".
   NOTA: O comprimento e a largura do material pode ser reduzido, se desejado, mas não deverá exceder esse tamanho.
2. Retire a parte branca do filme-gel e anexar o filme-gel para a lâmina de microscópio (Figura 1A). Pressione firmemente para garantir um anexo completo.
   NOTA: Não é uma camada superior de protecção evidente que não deve ser removido para permitir que a pressão a ser aplicada ao longo do pedaço de gel-film sem contaminar a superfície de gel de película. Lâminas preparadas gel por película (com camada protetora em anexo) podem ser armazenados à temperatura ambiente até ser necessário.
3. Remover a película transparente top de proteção do filme-gel, usando uma pinça estéreis quando estiver pronto para usar (Figura 1B), a amostra gel-film. Coloque a superfície de película de gel em contacto directo com o objecto desejado tocado ou superfície (Figura 2). Aplicar uma pequena quantidade de pressão para assegurar uma transferência eficiente de bio-partículas para o filme de gel.
   NOTA: Se muita pressão é aplicada, a lâmina de vidro pode quebrar.
   NOTA: Várias amostras do mesmo objecto ou superfície podem ser recolhidos para o mesmo pedaço de gel de película.
4. Confirmar a transferência de partículas bio-película sobre o gel (figura 3), colocando a lâmina num estereomicroscópio (trans- ou epi-iluminação pode ser utilizado). Use ampliação de 20X ~ Para uma melhor visualização áreas maiores do-filme gel, e ampliação de ~ 200X para melhor vibio-ewing partículas individuais.
5. Armazenar as lâminas de amostra de gel de película à temperatura ambiente numa caixa coberta de slides ou usar imediatamente para a coloração e / ou recolha de bio-partícula.

2. Coloração opcional de biopartículas para ajudar na visualização

1. Colocar a lâmina de amostra de gel de película preparada no Passo 1 para um suporte de lâminas mancha sobre uma pia.
2. Usando uma pipeta de transferência descartável, cobrir a superfície do gel de película inteira com mancha azul de tripano (Figura 4A). Incubar à temperatura ambiente durante 1-2 min.
3. Retire o excesso de mancha inclinando a lâmina para permitir que a mancha para escorrer na pia (Figura 4B).
   NOTA: O slide pode ser lavado por inundações suave com água estéril usando uma pipeta de transferência descartável, se necessário (Figura 4C).
4. Permitir que o slide para o ar seco antes de prosseguir para o isolamento de bio-partículas. Veja o slide usando um microscópio estereoscópico (~ 20X para a visão global e ~ 200-300X para vIEW biopartículas individuais) para assegurar a coloração adequada (Figura 4D-E).
   NOTA: A lâmina pode ser armazenado em temperatura ambiente em uma caixa de slides coberto.

3. Isolamento de biopartículas de interesse para análise

1. Inserir o número apropriado de 0,2 ml em tubos de PCR uma cremalheira e rotular os tubos apropriadamente.
2. Prepare a mistura de amplificação STR (ver lista de materiais) em uma capa designado amplificação PCR ou gabinete de biossegurança. Vortex da mistura principal bem e centrifugar brevemente em um mini-centrífuga.
   1. O volume de mistura de amplificação necessária por amostra é de 3,5 l; preparar um volume adequado de mistura principal para o número de amostras desejado.
3. Pipet 3,5 ul de mistura de amplificação em cada tubo de 0,2 ml. Tampe cada tubo vagamente.
4. Coloque um pedaço de fita dupla vara em uma lâmina de vidro limpa ou diretamente em um bloco de vidro.
   NOTA: Este será usado para segurar oTubo de 0,2 ml no local durante a coleta de amostras.
5. Coloque um pedaço de fita dupla vara em uma lâmina de vidro limpo. Coloque um pedaço de fita de onda de solda solúvel em água na parte superior da fita de dupla face.
   NOTA: Este diapositivo pode ser armazenado num exsicador para uso futuro.
6. Coloque o primeiro tubo de 0,2 ml para o slide duplo tape vara ou bloco preparada no passo 3.4. Definir este tubo de lado até que a amostra é coletada.
7. Coloque a fita de solda por onda de slides solúvel em água sob o microscópio (baixa ampliação). Com a ponta de uma agulha de tungsténio, raspe a superfície da fita, a fim de recolher uma pequena quantidade (ou "bola") de adesivo na extremidade da agulha (Figura 5A).
   NOTA: O tamanho da bola pode ser feita pequena ou grande, dependendo do número de biopartículas que serão recolhidos.
8. Cuidadosamente remover a agulha de tungsténio com adesivo sob o microscópio, sem perturbar a ponta da agulha. A agulha podeser realizada em um rack, se desejar durante a colocação da amostra.
9. Colocar a amostra de película de gel preparado (a partir de Passos 1 e 2) na platina do microscópio. Ajuste o foco e ampliação, até que as partículas biológicas podem ser facilmente visualizados. Identificar os bio-partículas que serão recolhidos.
   NOTA: Um bloco de vidro pode ser utilizado para suportar a lâmina se necessário.
10. Recuperar a agulha de tungstênio com bola adesivo e colocar a agulha sobre a superfície gel de filme onde os bio-partículas de interesse estão localizados. Pressionar a ponta da agulha (com adesivo) para baixo de modo que ele se encontra em contacto com o bio-partícula (Figura 5B). Levantar a agulha para cima para assegurar que a bio-partícula foi recolhido. Repita este processo até que tenha sido recolhido o número desejado de bio-partículas.
11. Colocar o preparado de 0,2 ml tubo de PCR na platina do microscópio. Regule a ampliação de modo que o fundo do tubo contendo a mistura de amplificação está em foco.
12. Com cuidado, insira o needl tungstêniode e para o tubo de PCR de 0,2 ml, até a ponta da agulha se encontra na mistura de amplificação.
    NOTA: Este é melhor executada durante a visualização através do microscópio.
13. Segurar a agulha na mistura de amplificação até dissolver o adesivo e as biopartículas são libertados em solução (Figura 5C). Retire a agulha, coloque os 0,2 ml na posição vertical e vagamente tampar o tubo.
14. Repita o procedimento de coleta de amostras adicionais. Limpe a agulha de tungstênio com álcool pré-umedecido (isopropanol) toalhetes entre amostras.

4. Combinada Microvolume Ácido Nucleico Isolation (Lise Direto) e autossômica Curto Tandem Repeat (STR) Profiling

1. Prepare o tampão de lise (ver Materiais) em uma capa designado amplificação PCR ou gabinete de biossegurança. Adicionar 1,5 uL de tampão de lise a cada tubo para um volume total de reacção de 5 ul. Fechar tampas tubo bem.
   NOTA: Os 0,2 ml tubos já contêm 3,5 mL damix de amplificação ea coleção bio-partículas de Passo 3.
2. Colocar as amostras do termociclador e amplificar as amostras utilizando as seguintes condições de ciclo: 75 ° C durante 15 min; 95 ° C durante 11 min; 34 ciclos de 94 ° C durante 20 seg e 59 ° C durante 3 min; 60 ° C durante 10 min; e 4 ° C espera.
   1. Produtos de amplificação armazenar a 4 ° C para armazenagem de curta duração.

5. Detecção de Produto - Eletroforese Capilar (CE)

1. Em uma placa de 96 poços, adicione 10 ml de mistura CE running (9,7 ul formamida deionizada e tamanho 0,3 ul padrão, ver Materiais). Adicionar 1 ml de produto amplificado ou escada alélica para cada poço.
   CUIDADO: Formamide é um potencial mutagênico e deve ser tratado em uma capa química enquanto usava equipamentos de proteção individual adequados.
2. Use condições eletroforéticas especificados pelo fabricante no manual do kit de amplificação ou internally condições validado.
3. Analisar dados brutos com software de análise de STR.

Resultados

Imagens representativas de biopartículas individuais e aglutinados que foram recuperados a partir de um colarinho de camisa (100% poliéster) usado por um dador macho são mostradas na Figura 6 (biopartículas individuais) e Figura 7 (biopartículas aglutinados). Os biopartículas foram recuperados do colarinho da camisa usando o protocolo descrito aqui: transferência de biopartículas do colarinho da camisa de gel de filme através do contato direto, a coloração dos biopartículas recuperados com azul de tripan, coleta de amostras biopartícula usando uma agulha de tungstênio e adesivo solúvel em água STR e análise utilizando a amplificação de micro-5 ul volume de lise / STR. As Figuras 6 e 7 representam uma amostra típica de biopartículas que iria ser analisados ​​a partir de um produto de ADN toque individual (20 individuais biopartículas individuais e 20 / biopartículas aglutinado). O biopartícula (s) coletados em cada imagem são rotulados com comprimento e largura medidas (em microns). O percentuais de alelos STR recuperados a partir de cada um dos biopartícula recolhido (s) é fornecida em cada imagem individual para demonstrar os graus variáveis ​​de sucesso que se pode esperar para ser obtida a partir biopartículas com este tipo de provas. As biopartículas recuperados a partir de amostras de DNA de toque são em grande parte os queratinócitos mortos ou moribundos e, por conseguinte, um perfil STR de prova não é obtida a partir de cada biopartícula recolhidos, como pode ser visto nas Figuras 6 e 7. Para esta camisa amostra gola, perfis STR foram obtidos a partir de 14/20 (70%) das partículas biológicas individuais e 15/20 (75%) aglutinados biopartículas. No entanto, cada um dos perfis recuperados varia em valor de prova: 3-97% de recuperação do alelo para perfis individuais biopartículas e 3-100% de recuperação de alelo para os perfis biopartícula aglutinados. Devido à variabilidade nas taxas de sucesso, é recomendada a coleta de numerosas partículas biológicas de cada item DNA touch. Isso garante uma melhor chance de obter um altamente probative perfil STR.

O perfil STR obtido a partir de uma das amostras individuais biopartícula do colarinho de camisa é mostrada na Figura 8 (a biopartícula a partir do qual se originou o perfil é mostrado à esquerda). Quase um perfil STR completa (28 de 30 alelos, um locus de cair para fora, a precisão do perfil obtido verificada por comparação com um perfil de referência) foi obtido a partir deste biopartícula indivíduo. O perfil obtido é de alta qualidade, com alturas de pico inter-locos razoavelmente equilibradas e não alélicas cair fora. Allelic desistem e desequilibradas artefatos altura de pico são ambos muito observada em amostras de DNA de baixo do modelo. O perfil STR obtido a partir de uma das amostras biopartícula aglutinados do colarinho é mostrado na Figura 9. Um perfil completo STR (30/30 alelos, a precisão do perfil obtido verificada por comparação com um perfil de referência) foi obtido. Como mencionado anteriormente, um perfil de STR que não é recuperada a partir de cada vezy biopartícula recolhidos. Um exemplo do perfil de ADN de uma única vencida biopartícula (3% de recuperação do alelo, 1/30 alelos) é mostrado na Figura 10 (biopartícula indivíduo). Enquanto isto biopartícula indivíduo não foi bem sucedida, perfis STR altamente probatório dos doadores dos biopartículas nesta amostra foram obtidas de outras partículas biológicas recuperados a partir da mesma amostra. Isso ilustra a necessidade de realizar várias amostragens única célula / moita do mesmo objeto.

Os métodos de análise desenvolvidos "inteligentes" descritos aqui para provas de DNA toque têm sido utilizados com sucesso para recuperar perfis de origem única probatórios de solteiro e "agregadas" biopartículas de vários tocou objetos e itens de vestuário (por exemplo, apoios de braços da cadeira, volantes de automóveis, telefones celulares, copos de café, cigarros, canetas, camisas, shorts, e blusas). No entanto, mais importante, esta abordagem tem também sido utilizada para a detecção e caracterização de d machoonor DNA (fonte única) em amostras da mistura de contato / agressão física simulados (por exemplo, autor agarrando uma vítima de pulso, no pescoço ou na roupa, ou entre em contato com roupa de cama da vítima como em agressões sexuais).

Figura 1: Preparação de gel de lâminas de película para a recolha biopartícula. (A) A capa protetora para trás branco é retirado com uma pinça estéreis a partir do pedaço de gel-filme para expor o adesivo. O filme-gel é então feita aderir sobre uma lâmina de microscópio de vidro com uma pressão firme. (B) Quando a amostra de gel de película está pronta para ser utilizada para a recolha de biopartícula, o filme protector de topo é removida utilizando pinças estéreis.

Figura 2: coleção biopartícula usando gel-film a partir de vários substratos. As lâminas de película de gel pode ser utilizado para recolher partículas biológicas a partir de uma variedade de superfícies. O gel de película é colocada em contacto directo com o objecto ou superfície de interesse. Suave pressão é aplicada, a fim de transferir biopartículas sobre a superfície de gel de película. Coleção de biopartículas de (a) itens usados ​​vestuário (gola do casaco), (B) tocou objetos (viagem xícara de café), e (C) a pele humana direta (pulso masculino) são mostrados.

Figura 3:. Biopartículas em um item de vestuário usado (dentro da calça leg) biopartículas são transferidos para gel de filme através do contato direto com a superfície do objeto. Biopartículas pode ser encontrado como "blocos" ou biopartículas single / individuais (indicadas com setas vermelhas).

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Figura 4:. Coloração opcional de biopartículas em lâminas de gel-filme para uma melhor visualização do biopartículas, as amostras de gel de película pode ser manchado com trypan mancha azul. A totalidade da superfície de gel de película é coberta por azul de tripano (A). Depois de 1-2 minutos da coloração, a corrediça é suavemente inclinada para permitir que o excesso de corante para executar fora da corrediça (B). Inundação suave com água estéril (C) pode ser usado para remover o excesso de corante. Depois, a lâmina é seca ao ar, a lâmina pode ser visto ao microscópio para assegurar coloração adequada (D, E). Nota:. Nem todos os biopartículas aparecerá com detalhes (ou seja, de cor azul) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: coleta e análise biopartícula. (A) Uma pequena quantidade (ou "bola") de fita de onda de solda solúvel em água ("adesivo") é recolhida para a ponta de uma agulha de tungsténio por raspagem suave. (B) O adesivo é então pressionada para a distribuição do gel superfície do filme, a fim de recolher os biopartículas de interesse. Biopartículas individuais ou múltiplas podem ser recolhidas com uma única bola adesiva. (C) Uma vez que as partículas biológicas desejadas foram recolhidas, a ponta da agulha é colocada na mistura de amplificação de PCR num tubo de 0,2 ml. A agulha é realizada no líquido até que se dissolva e a liberação de partículas biológicas em solução é observado. Todas as etapas do processo de coleta são realizados e vistos sob o microscópio para assegurar a recolha biopartícula sucesso e de transferência. Por favor, clique aqui para ver um larger versão desta figura.

Figura 6:. Biopartículas individuais de uma amostra de colarinho de camisa biopartículas foram recuperados utilizando gel de película a partir do interior de um colarinho de camisa vestida por um dador macho. Os biopartículas foram coradas utilizando azul de tripan e imagens de vinte diferentes biopartículas individuais identificados na amostra são mostrados. Em cada imagem, a biopartícula que foi recolhido está circulado (círculos vermelhos indicando biopartículas em que um perfil foi recuperado; círculos pretos indicam biopartículas em que um perfil não foi recuperado). A percentagem de recuperação alelo (número de alelos observados de um total possível de 30) é mostrado acima da imagem de biopartícula a partir do qual um perfil foi recuperado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: clumped biopartículas em uma amostra colarinho biopartículas foram recuperados utilizando gel de película a partir do interior de um colarinho de camisa vestida por um dador masculino.. Os biopartículas foram coradas utilizando azul de tripan e imagens de vinte biopartículas clumped diferentes identificados na amostra são mostrados. Em cada imagem, a biopartícula que foi recolhido está circulado (círculos vermelhos indicando biopartículas em que um perfil foi recuperado; círculos pretos indicam biopartículas em que um perfil não foi recuperado O percentual de recuperação alelo (número de alelos observados de um total possível de 30). é mostrado para cada biopartícula a partir do qual um perfil foi recuperado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: autossómica STR perfil obtido a partir de um único biopartícula de um colarinho de camisa macho Um perfil autossómica STR foi obtido a partir de um único biopartícula (mostrada à esquerda), utilizando as cinco ul de lise directa / reacção de amplificação.. A precisão deste perfil foi determinada por comparação com uma amostra de referência dador. Quinze autossómica STR loci e amelogenina (determinação do sexo) são co-amplificadas numa única reacção e separados por electroforese capilar. Os resultados são mostrados aqui como um electroferograma. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e eixo y representa intensidade de sinal (RFU unidades de fluorescência relativa, desde cada número do alelo correspondente). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior esta figura.

Figura 9: autossómica STR perfil obtido a partir de um biopartícula agregada a partir de um colarinho de camisa macho Um perfil autossómica STR foi obtido a partir de um biopartícula agregada (mostrada à esquerda), utilizando as cinco ul de lise directa / reacção de amplificação.. A precisão deste perfil foi determinada por comparação com uma amostra de referência dador. Quinze autossómica STR loci e amelogenina (determinação do sexo) são co-amplificadas numa única reacção e separados por electroforese capilar. Os resultados são mostrados aqui como um electroferograma. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e ao eixo dos y representa a intensidade do sinal (RFU unidades de fluorescência relativa; fornecida sob cada número correspondente alelo).pg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 10:. Exemplo de uma falha para obter um perfil autossômica STR obtido a partir de um biopartícula coletadas O biopartícula indivíduo mostrado na esquerda foi coletado de uma camisa de colarinho amostra gel-film. Como pode ser visto a partir do perfil resultante STR (mostrado à direita), apenas um alelo (de 30 possíveis) obteve-se. Números de alelos estão designação abaixo de cada pico em cada locus. O eixo x representa o tamanho do fragmento (pares de bases, pb) e eixo y representa a intensidade do sinal (RFU unidades de fluorescência relativa, desde cada número do alelo correspondente). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Aqui descrevemos métodos para a recolha e análise genética melhorada do biopartículas recuperados a partir de provas de DNA touch. A abordagem desenvolvida envolve o seguinte: 1) coleta de material biológico (ou seja, biopartículas) via gel de filme a partir de objetos e superfícies tocadas, itens de vestuário usado ou pele humana direta, 2) o exame microscópico do material biológico recuperado para assegurar a cobrança do potencial de material biológico humano, e 3) micromanipulação de partículas biológicas únicas ou poucos utilizando um adesivo solúvel em água, e 4) de perfis de ADN autosomal-STR de biopartículas recolhidos utilizando um microvolume (5 ul) de um passo de lise / reacção de amplificação. A utilização de um único passo de reacção tubo fechado reduz o potencial para a contaminação da amostra e perda de manipulações adicionais ou de amostras de transferência para outros tubos de reacção. O reforçada microvolume de uma etapa (5 ul) lise / reações de amplificação STR permite a recuperação de todo ou probative STR perfis do doador de biopartículas única ou poucas. Esta abordagem foi desenvolvida para obter perfis fonte STR ​​únicos de provas de DNA toque único e multi-fonte (por exemplo, itens usados ​​de vestuário e outros artigos para o lar, tocou / objetos manipulados e superfícies, misturas pele / pele). Tem sido utilizado com sucesso para a detecção do dador macho em amostras da mistura de agressão físicos simulados.

Esta abordagem poderia ser melhor avaliadas em cenários adicionais mistura fluido corporal / tecido tais como vítima risca sua / seu agressor, em que apenas alguns biopartículas do assaltante estaria presente entre uma enorme quantidade de material biológico da vítima. Além disso, uma vez que esta abordagem desenvolvida no presente estudo permite a análise ao nível biopartícula único, poderia ser usada para obter uma melhor compreensão da natureza e extensão da transferência secundário ^14-19, em que um intermediário transfere um perfil de ADN sobre uma supce, objeto ou pessoa a outra superfície do objeto ou pessoa ^20. Uma abordagem cega-enxugamento para a análise de transferência secundário pode não conseguir identificar pequenas quantidades de material a partir do dador secundário. A abordagem aqui desenvolvido permite a análise de partículas biológicas únicas ou poucos e, por conseguinte, os resultados não são confundidos pela presença de uma enorme quantidade de material biológico a partir do dador primário. As metodologias desenvolvidas neste trabalho também pode ter implicações para a análise de vestígios de material biológico em casos de violência sexual, como os que envolvem a penetração digital da vagina, onde identificação positiva de vestígios de células da pele do agressor pode ser crucial para estabelecer que o contato sexual ocorreu.

Enquanto a coleção de biopartículas de amostra gel-filme não envolve manipulações difíceis e complexas, há passos críticos neste processo que precisam ser realizadas com muito cuidado para garantir a successful transferência de biopartículas para o vaso de reacção a jusante. A recolha de partículas biológicas com o adesivo solúvel em água tem de ser visto ao microscópio (isto é, estereomicroscópio com a ampliação elevada (~ 200-300X) para assegurar que apenas as partículas biológicas de interesse são recolhidas. Dependendo do tamanho do adesivo "bola" utilizada, há é o potencial para recolher o material circundante adicional que pode incluir tanto material biológico e não-biológico (por exemplo, fibras, outros detritos). A recolha de partículas biológicas adicionais indesejadas pode resultar na recuperação de perfis de ADN misturados. A recolha do material não biológico podem introduzir inibidores para a lise micro-volume / reações STR. Se vários biopartículas são coletados com o mesmo adesivo "bola", há um potencial para biopartículas coletados anteriormente para se tornar desapegado do adesivo. Isso não é muito freqüente, mas pode ocorrer quando um número maior de bioparticles são coletados (por exemplo, mais de 50) com um único adesivo "bola". Se um grande número de partículas biológicas são segmentados, recomenda-se que vários conjuntos de menos biopartículas são feitas, mas tudo transferido para o mesmo tubo de 0,2 ml. Uma vez biopartículas foram recolhidos, deve ser tomado cuidado durante a remoção da lâmina de película de gel a partir da fase de microscópio e o posicionamento do tubo de 0,2 ml, de modo que a ponta da agulha não é perturbado. Durante a colocação da ponta da agulha no interior da mistura de amplificação, na parte inferior do tubo de 0,2 ml, a ponta da agulha não deve entrar em contacto com os lados do tubo, a fim de evitar perda de material nos lados do tubo. Enquanto a solubilização do adesivo é tipicamente rápida (~ 30 segundos ou menos, dependendo do tamanho do adesivo "bola") e pode monitorizados durante o exame microscópico, a ponta da agulha deve ser lentamente removido da mistura de amplificação para assegurar que completa solubilizaçãode o adesivo ter sido alcançada. Se o adesivo não se ter dissolvido completamente, a agulha pode ser devolvido para o líquido para permitir a dissolução completa.

Os protocolos descritos aqui foram otimizados para uso com biopartículas e células humanas a partir de evidências biológicas forense. O tampão de lise seleccionado é compatível com o kit de amplificação de ADN-STR seleccionado. Embora possa haver tampões de lise alternativos adequados, a sua eficiência em termos de lise celular e de compatibilidade com a análise a jusante deve ser verificada pelo utilizador. Além disso, o número de kit de amplificação STR e ciclo de amplificação descrito neste protocolo ter sido otimizado para uso com biopartículas única ou poucas. Um estojo de amplificação de STR próxima geração, com elevada sensibilidade e robustez relatado foi seleccionado e foi demonstrado para resultar na recuperação de perfis de alta qualidade a partir de STR biopartículas únicas ou poucos. Enquanto vários outros kits STR, com variados amplifi recomendadonúmeros ciclo de cátions, estão disponíveis, eles não podem possuir sensibilidade adequada e, portanto, teria de ser devidamente avaliado antes da utilização nestes protocolos.

Apesar do sucesso do uso de métodos descritos para os perfis de recuperação STR de biopartículas única ou poucas, a taxa de sucesso de recuperação de perfil não será de 100%. Portanto, para algumas amostras pode ser observado um perfil de DNA parcial limitado ou nenhum perfil. Isto não pode ser evitado, devido à incapacidade para identificar conclusivamente a maioria das biopartículas visualmente como material celular, o estado de degradação potencial do material nuclear em biopartículas ou perda de material da amostra a partir do adesivo recolhidos antes da transferência para o recipiente de reacção. Portanto, a análise de uma amostra única biopartícula para cada item de ADN toque não é recomendado. Nós freqüentemente coletar 20 conjuntos de amostras de uma amostra de gel-film individual e irá recolher conjuntos de amostras adicionais, conforme necessário, se um perfil STR adequado não é obtido. Tele única limitação para colecções é a quantidade de material biológico presente na amostra de gel de filme (e provavelmente o custo de análise, embora as reacções microvolume proporcionar a oportunidade de recolher amostras adicionais para um custo semelhante ou inferior, como um único volume de reacção padrão ( por exemplo, 25 ul).

Os métodos de identificação de DNA desenvolvidos descrever aqui fornecer uma abordagem molecular para a caracterização, análise e interpretação de material biológico trace recuperado de amostras de DNA de toque. No entanto, não há informações suplementares genético que pode ser obtido a partir de biopartículas recuperados em adição à determinação do doador (isto é, o perfil de STR) do dador do material biológico. A fonte de fluido de tecido ou órgão de origem (por exemplo, a pele contra saliva) pode fornecer informações cruciais contextual a uma investigação criminal. Sem essa determinação, a ambiguidade da fonte de tecido de origem pode ser Exploitada circunstâncias como alternativas do crime (por exemplo, como o fluido corporal pode ter sido depositada) pode ser sugerido. Os biopartícula recolha e isolamento de protocolos descritos aqui pode ser utilizado para recolher partículas biológicas ou outras células (por exemplo, bucal, vaginal) para utilização num tecido de identificação de fonte (ARNm de perfilamento ^21-30) estratégia que envolve micro-volume de transcrição reversa (RT) e As reacções de amplificação. Com maior otimização também pode ser possível desenvolver uma estratégia de DNA / RNA co-isolamento para permitir a identificação do tipo de célula (RNA) e STR profiling da mesma amostra, incluindo biopartículas de provas de DNA touch.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de microcentrífuga naturais SealRite de 1,5 ml, estéreis	USA Scientific	1615-5510	vários fornecedores alternativos estão disponíveis, mas os tubos devem ser estéreis
tubos de PCR de 0,2 ml com tampa plana, natural	Phenix Research	MPX-200F	ou equivalente
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666 e/ou 06-666-11C
Almofadas de preparação de álcool	Fisher Scientific	06-669-62	alternativa é 06-665-24 (Fisher Sci); lata de lenços umedecidos com álcool maiores em vez de almofadas individuais
		estéril	18,2 MΩ, autoclavada
Lâminas de microscópio de vidro, fosco, 3" x 1": 1 mm	Fisher Scientific	12-544-3	marcas ou tamanhos alternativos são aceitáveis
Pipeta de transferência descartável	Fisher Scientific	13-711-9D	alternativas são aceitáveis
Solução azul de tripano	Sigma	T8154
Pipetas: 0,2-2, 2-20, 10-100, 100-1.000 μ l	várias
pontas de pipeta estéreis e resistentes a aerossóis	várias
Mini-centrífugas	vários
estereomicroscópios	Leica	M205C	outros são adequados, mas devem ser capazes de magificações de até 350X
GeneAmp Sistema de PCR 9700 ciclo térmico (bloco de prata ou ouro)	Life Technologies	N8050200 ou 4314878	outros modelos e fabricantes podem ser usados, mas o desempenho com o kit de amplificação STR deve ser verificado
3130 Analisador Genético	Life	3130-01	alternativas: 310 ou 3500 Agentes Genéticos (Life Technologies)
Software GeneMapper	Life Technologies	várias	versões do software estão disponíveis e podem ser usadas
WF Gel-Film , nível de retenção x8	Gel-Pak	WF-40-x8-A	Filme wafer de 4" x 4"; pode ser encomendado em outras especificações de tamanho
Fita dupla face	vária
Bloco de vidro, 3" x 1.5" x 3/8"	Microscópios e Acessórios McCrone	370-2	ou equivalente
[cabeçalho]
Agulha de tungstênio com suporte	Microscópios e Acessórios McCrone	106
Fita de solda de onda solúvel em água 3M, 5414 tampão de	70113977		da Allied Electronics
(forensicGEM Saliva, Zygem)	VWR	95043-992	O tampão de lise é preparado em 10 μ l (prepare porções adicionais do master mix conforme necessário para acomodar o número desejado de amostras). 1,5 μ l é usado para cada amostra. Para preparar 10 μ l de tampão de lise (suficiente para ~ 6 amostras): 6,9 μ l água estéril, 2,1 μ l 10x buffer - azul, 1 μ l forensicGEM.
Kit de amplificação STR, kit de amplificação AmpFlSTR Identifiler Plus PCR	Life Technologies	4427368	kits alternativos de amplificação STR podem ser usados, mas o desempenho teria que ser verificado pelo usuário. A mistura de amplificação é preparada da seguinte forma (volumes por amostra): 2,2 μ l Mistura de reação de PCR, 1,1 μ l Conjunto de primer, 0,2 μ l (1U) AmpliTaq Gold DNA polimerase. Deve ser preparada uma mistura principal suficiente para o número desejado de amostras. 3,5 μ l da mistura preparada é adicionada ao tubo de 0,2 ml para coleta de biopartículas.
AmpliTaq Gold DNA polimerase	Life Technologies	N808-0245
HiDi formamida	Life Technologies	4311320
GeneScan 500 LIZ tamanho padrão	Life Technologies	4322682
placas de reação óptica de 96 poços	Life Technologies	N8010560
septos de placas, 96 poços	Life Technologies	4315933
Polímero otimizado para desempenho, POP-7	Life Technologies	4363785	alternativas como POP-4 são aceitáveis