Artigo de método

Testes para Odor Discriminação e habituação em ratos

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DOI:

10.3791/52615

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5 de maio de 2015

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Studies, Baylor University, 2Department of Psychology and Neuroscience, Baylor University

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para examinar o sistema olfativo de roedores. O teste de habituação/deshabituação olfativa permitirá que os investigadores determinem se um camundongo se habitua a um odor apresentado repetidamente e se o camundongo demonstra deshabituação quando apresentado a um novo odor.

Resumo

Este vídeo demonstra uma técnica para estabelecer a presença de um sistema olfativo funcionando normalmente em um camundongo. O teste ajuda a determinar se o camundongo pode discriminar entre odores não sociais e odores sociais, se o camundongo se habitua a um odor apresentado repetidamente e se o camundongo demonstra deshabituação quando apresentado a um novo odor. Como muitos testes de comportamento social medem a resposta do animal experimental a um camundongo familiar ou novo, os falsos positivos podem ser evitados estabelecendo que os animais podem detectar e discriminar entre odores sociais. Existem considerações semelhantes em testes de aprendizagem, como o condicionamento do medo, que usa o odor para criar um novo ambiente ou pistas olfativas como estímulo associativo. Déficits no sistema olfativo prejudicariam a capacidade de distinguir entre contextos e formar uma associação com uma sugestão olfativa durante o condicionamento do medo.

No teste de habitação/deshabituação de odores, o camundongo é repetidamente apresentado a vários odores. Cada odor é apresentado três vezes por dois minutos. O investigador registra o tempo de cheiração direcionado ao odor como a medida da capacidade de resposta olfativa. Um camundongo típico mostra uma diminuição na resposta ao odor ao longo de apresentações repetidas (habituação). O experimentador então apresenta um novo odor que provoca um aumento do cheiro em direção ao novo odor (deshabituação). Após repetidas apresentações do novo odor, o animal novamente mostra habituação. Este protocolo envolve a apresentação de água, dois ou mais odores não sociais e dois odores sociais. Além de reduzir os fatores de confusão experimentais, este teste pode fornecer informações sobre a função dos sistemas olfativos de novas linhagens de camundongos knockout, knock-in e knockout condicional.

Introdução

Ratos são dependentes olfato para navegar novos ambientes, encontrar comida, para o reconhecimento de outras pessoas, e comportamento sexual 1-3. É essencial que os investigadores determinar se ou não os animais experimentais têm um sentido de cheiro funcionamento antes de administrar testes comportamentais que envolvem a comida, a interacção social, ou quaisquer odores destinados a induzir uma resposta a partir do ratinho. A anosmia ou a incapacidade de distinguir entre diferentes odores, poderia resultar em falsos positivos ou negativos em uma ampla variedade de paradigmas de comportamento, de modo a capacidade de um rato para detectar e distinguir os odores deve ser estabelecida antes de outros tipos de testes comportamentais são efectuadas.

O teste de habituação / dishabituation olfativo foi descrita pela primeira vez na década de 1980 4. O ensaio foi adaptado para utilização em ratinhos pelos Drs. Mu Yang e Jacqueline Crawley 5. Este é um teste simples e barato, que permite ao investigador ESTABlish que um rato pode detectar e diferenciar entre odores. Além de testar olfacto, este teste permite ao investigador observar o comportamento geral do rato e deve ser feita no início de um regime de testes. Observações qualitativas sobre a locomoção do rato, sinais de ansiedade, nível de atividade, e resposta a odores sociais contra os odores dos alimentos pode sinalizar novas áreas em que os testes poderiam ser realizados.

Neste teste, compressas de algodão embebido em vários odores são apresentados a um mouse três vezes em uma fileira. Com cada apresentação repetida de um odor, o rato vai habituar ao cotonete, gastando menos tempo investigando-o com cada apresentação subsequente. Quando um novo odor é apresentado, dishabituation ocorre, e um mouse típico vai gastar mais tempo a investigar o cotonete, indicando que ele pode discriminar entre os actuais e anteriores odores 5. Este teste é administrado a um rato de cada vez e inclui um 45 min acclimation período seguido de 45 minutos de teste.

Embora este teste é fácil de transportar para fora, pode ser utilizado para investigar perguntas sofisticadas sobre o sistema olfactivo do rato. Outros testes populares de olfacto, tais como o teste de alimentos enterrado, simplesmente determinar a presença ou ausência de anosmia. No entanto, o teste de discriminação e habituação olfactiva permite ao investigador para determinar que um mouse não só tem a capacidade de detectar odores, mas pode discriminar entre diferentes odores. O padrão de habituação e dishabituation foi usado para estabelecer novos mutantes que podem discriminar entre os odores 6,7. Em um estudo surpreendente, Fadool e seus colegas usaram misturas complexas de odores para mostrar que os ratos com supressão segmentadas gene do canal Kv1.3 são "super smellers" que podem discriminar odores muito similares melhor do que ratos normais 8.

Ao examinar um novo modelo de nocaute do mouse é útil Establish na presença de um comportamento normal para tarefas sensoriais básicos. Quando feito no início de um regime de testes, a discriminação odor e teste de habituação dá um investigador a oportunidade de observar quaisquer comportamentos incomuns. Estas observações podem evitar resultados falsos positivos ou negativos em testes posteriores que são atribuíveis ao confundindo características do mutante. Como os investigadores continuam a investigar o comportamento social a necessidade de verificar a função olfativa básico torna-se cada vez mais importante. Além de examinar o olfato em linhas mutantes, este teste pode ser usado para tratar de questões específicas, como se um tratamento farmacológico aumenta especificamente a resposta de um animal a estímulos odor sociais ou se os seus aumentos de resposta a todos os estímulos odor.

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Protocolo

Os ratos machos adultos utilizados na experiência seguinte foram gerados e alojado na Universidade de Baylor a uma temperatura ambiente de 22 ° C, com uma luz de 14 h e 10 h escuro (20:00-06:00 h) ciclo diurno. Os ratos tiveram acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos para os ratos estavam em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório eo protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Baylor Animal Care e do Comitê Use. Os ratinhos foram testados no final da manhã / tarde. Para todos os procedimentos abaixo o pesquisador deve usar luvas para eliminar odores e evitar a contaminação.

1. Preparação de Odores não-sociais

  1. Prepare odores não sociais frescos cada dia de testes.
    Nota: O investigador deve usar luvas para preparar os odores.
    1. Encha três tubos de centrífuga com 10 ml de água cada.
    2. Pipetar 100 mL de extrato de banana em um 15 ml & #160; tubo cónico e 100 ul de extracto de amêndoa para um segundo tubo de 15 ml de uma diluição de 1: 100.
      Nota: O terceiro tubo de 15 ml conterá somente água.

2. Preparação de Odores Sociais

  1. Prepare odores sociais frescos na manhã de testes irá ocorrer. Obter odores sociais de duas gaiolas que não tenham sido limpos durante pelo menos três dias, e contêm um número igual de ratinhos. Obter odores sociais de ratos do mesmo sexo como o sujeito de teste.
    Nota: Estes estão a ser armazenados a temperatura ambiente e deve ser usada dentro de 4-6 horas para manter o odor forte e consistente.
    1. Determine quantas odor sociais cotonetes precisam ser criados: cada rato que está sendo testado será apresentado com três swabs de odor Social 1, e três de odor sociais 2.
    2. Prepare odores sociais limpando um cotonete de uma forma em zigue-zague através da parte inferior de uma gaiola suja. Sacudir qualquer excesso cama agarrado à ponta.
    3. Loja swabs em grandes frascos de vidro com tampas ou em copos cobertos com parafilme. Designar um recipiente para um odor sociais e um segundo para o odor sociais 2.
  2. Manter gaiolas de origem odor fora da sala de ensaio experimental.

3. A aclimatação do mouse Teste

  1. Calçar luvas e pesar o mouse para ser testado e coloque individualmente em uma gaiola limpa com uma tampa de arame em cima e garrafa de água removida.
  2. Permitir que o mouse para se aclimatar à nova gaiola por 45 min em uma sala diferente de sala de ensaios. Certifique-se de que não existem odores ou ruídos no quarto.
  3. Como teste leva cerca de 45 min, escalonar os tempos de aclimatação, colocando a próxima mouse para ser testado em uma gaiola limpa para se aclimatar à direita antes de testar o mouse atual.

4. Preparação da sala de teste

  1. Coloque compressas de algodão frescos, fita de laboratório, os frascos contendo swabs odor sociais, os tubos de nsobre-sociais odores, uma micropipeta, dois temporizadores, e um frasco de resíduos com uma tampa na sala de testes.
  2. Certifique-se de que a sala de ensaios é razoavelmente livre de odores, ruídos altos e luz brilhante. Não use perfumes ou loções perfumadas.
    Nota: O observador não deve ser mascar chicletes ou balas durante o período de testes e deve tentar limitar a sua exposição a fortes alimentos de odor.

5. Procedimento de Teste

  1. Traga o mouse aclimatados em sua gaiola na sala de ensaio e colocar a gaiola em cima do balcão, a uma altura que seja confortável para visualização enquanto estiver sentado.
  2. Apresente cada odor 3 vezes em uma fila para 2 min cada vez. Utilizar a ordem de apresentação que pode ser encontrada na Tabela 1.
    1. Pipetar 50 ul de odorante no perfume a ser testado para a ponta da mecha de algodão e volte a fechar a fonte de odor. Levante a parte superior da gaiola de arame e insira a extremidade sem cheiro, de madeira do swab na abertura da garrafa de água, empurrandog o comprimento através do lado de baixo do fio para o topo. Evite tocar a ponta de algodão para nada, incluindo dedos, de modo que a contaminação odor é evitado.
    2. Continue a puxar o cotonete com a abertura da garrafa de água até cerca de 1 polegada do fim algodão trava para baixo na gaiola. Apor o fim da haste de madeira para o lado da gaiola usando fita laboratório.
      Nota: Tenha cuidado para não deixar a tampa cair de volta para a jaula, fazendo um ruído alto que iria perturbar o mouse teste.
    3. Começar imediatamente temporização para 2 min. Use um temporizador para cronometrar o 2 min de apresentação. Grave o tempo acumulado gasto cheirando o odor durante 2 min julgamento. Contagem comportamento sniffing do animal usando um cronômetro separado. Sniffing ativo é definido quando o nariz do animal é orientada para a ponta de algodão com seu nariz ~ 2 centímetros ou mais perto da ponta.
    4. Após a conclusão de cada julgamento, levantar a tampa do fio e retire o cotonete, puxando-a para baixo através da ONUderside da tampa (o que evita a contaminação de odores, impedindo que a ponta de algodão de tocar o fio). Selar o swab usado em uma garrafa de 500 ml de resíduos.
    5. Preparar e inserir o próximo swab e começar a cronometragem. Permitir que cerca de 1 min entre cada intervalo inter-julgamento. Continue até que cada perfume tem sido apresentado três vezes seguidas, durante 2 minutos de cada vez.
  3. Uma vez que o rato tenha completado todos os ensaios, esvaziar o frasco de resíduos contendo as cotonetes utilizadas em uma lata de lixo do lado de fora da sala de teste. Devolver o mouse para sua gaiola.

6. Análise

  1. Analisar os dados para cada grupo por condição odor usando ANOVA two-way seguido por Newman-Keuls ou um teste similar post hoc para determinar habituação significativa (menos tempo farejando sucessivas mesmos cheiros), e dishabitutation (mais tempo farejando um novo cheiro).

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Resultados

Seguindo o protocolo descrito, os resultados foram registados utilizando dez adultos (dia pós-natal 90-120) ratos machos C57BL / 6J e oito macho estirpe FVB mista-fundo (dia pós-natal 50-70). O teste foi realizado por um único investigador ao longo de vários dias. Cada ponto nos gráficos representa a média de tempo gasto a investigar um odor.

Quando o cotonete embebido em água é introduzido pela primeira vez, os ratos gastar uma grande quantidade de tempo a investigar este romance objeto

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Discussão

Os resultados apresentados neste artigo são ideais para camundongos. Os ratinhos demonstram uma forte resposta a um odor de novo, em seguida, rapidamente habituar. Um dos passos chave no presente método é a preparação dos odores. O investigador deve tomar muito cuidado para isolar os odores um do outro para evitar a contaminação. Outro aspecto importante é a apresentação do cotonete. O investigador precisa solucionar a melhor localização da ponta de algodão para que o rato pode investigar a ponta, mas não rasga na ponta...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho é apoiado por uma bolsa do Baylor University Research Council e por uma bolsa de pesquisa da Epilepsy Foundation.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Gaiola de ratoAllentownde rato padrão
Tampa de arameAllentownBCU Rato WBL 2500
Roupa de camaHarlan7090 Sani-Chips
CotonetesVWR89031-270Cabo de madeira de 6"
Extrato de bananaMcCormick
Extrato de amêndoaMcCormick
Fita de laboratórioVWR89098-062
CronômetroVWR62374-000
Luvas de nitriloVWR82026
Dispositivo de cronometragemVWR61161-350
Tubos cônicos de 15 mlVWR89003-294
Copos de 2 L Pyrex1003
ParafilmParafilmPM-9924" x 250'
Frasco de 1 L com tampaVWR89000-240
Gaiola

Referências

  1. Doty, R. L. Odor-guided behavior in mammals. Experientia. 42, 257-271 (1986).
  2. Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm Behav. 46, 247-256 (2004).
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