Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.
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Artigo de método
Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
-Tronco pluripotentes derivadas de células cardiomiócitos Humanos induzida (hiPSC-CMS) tornaram-se uma importante fonte de células para suprir a falta de cardiomiócitos primários disponíveis para aplicações de pesquisa básica e translacional. Para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos, vários protocolos, incluindo corpo embryoid (EB) diferenciação baseada e indução do fator de crescimento têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são ineficientes e altamente variáveis na sua capacidade para gerar cardiomiócitos purificadas. Recentemente, uma pequena protocolo utilizando modulação baseada molécula de sinalização Wnt / β-catenina foi mostrado para promover a diferenciação cardíaca com alta eficiência. Com este protocolo, superior a 50% -60% de células diferenciadas foram cardiomiócitos troponina positiva cardíacos foram observados de forma consistente. Para aumentar ainda mais a pureza de cardiomiócitos, as células diferenciadas foram sujeitas a inanição glicose para eliminar especificamente não-cardiomiócitos com base na diferença metabólicas entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Utilizando esta estratégia de selecção, que, consistentemente, obtido um aumento superior a 30% na proporção de cardiomiócitos a não cardiomiócitos em uma população de células diferenciadas. Estes cardiomiócitos altamente purificadas deverão aumentar a confiabilidade dos resultados de humano com base em estudos de modelagem em iPSC doença in vitro e testes de rastreio de drogas.
Introdução
Cardiomiócitos primários humanos são difíceis de obter devido à exigência de biópsias cardíacas invasivos, dificuldade em se dissociar para células individuais, e por causa da sobrevivência celular a longo prazo pobre em cultura. Devido a esta falta de cardiomiócitos humanos primários, induzida pelo homem-tronco pluripotentes cardiomiócitos derivados de células específicas do paciente tecnologia (hiPSC-CM) tem sido considerado como uma fonte de cardiomiócitos alternativa poderosa para a pesquisa básica, bem como as aplicações clínicas e translacionais como modelagem de doença e drogas descoberta 1. Os esforços iniciais em diferenciação de células estaminai....
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Protocolo
NOTA: As informações fornecedor para todos os reagentes utilizados neste protocolo foi listado na Tabela 1 e Lista de Materiais. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células têm de ser estéreis e técnica asséptica deve ser utilizado em conformidade. Executar todas as incubações de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2, a menos que especificado de outra forma. Neste protocolo, todas as diferenças são realizadas em placas de 6 poços, em que os hiPSCs são semeadas. Seguindo diferenciação e purificação, as células podem ser dissociadas e plaqueadas novamente para uso a jusante.
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Resultados
As alterações morfológicas durante a diferenciação hiPSC.
O hiPSC cultivadas em placas de livre-de alimentação cresceu como planas, colônias bidimensionais. Ao atingir cerca de 85% de confluência, hiPSCs foram tratados com 6 uM CHIR para diferenciação (Figura 1A). Quantidades substanciais de morte celular, um fenômeno normal e comum, foram observados após 24 horas de tratamento CHIR. Depois de dois dias de tratamento com CHIR, os hiPSCs continuaram a diferen.......
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Discussão
A obtenção de uma grande quantidade de derivados de cardiomiócitos hiPSC altamente purificadas é crítica para a investigação básica cardíaca, bem como aplicações clínicas e translacionais. Protocolos de diferenciação cardíacos tenham sido submetidos a enormes melhorias nos últimos anos, a transição de métodos baseados em corpo embri�des utilizando crescimento cardiogênico fatores 2, a matriz métodos sanduíche 12 e, finalmente, para as pequenas métodos baseados monocamada modulada-molécula e .......
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Divulgações
Os autores não declaram interesses conflitantes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH / NHBI (U01 HL099776-5), o NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RB3-05129), a American Heart Association (14GRNT18630016) e o Endowed Faculty Scholar Award da Lucile Packard Foundation for Children e do Child Health Research Institute em Stanford (para SMW). Também reconhecemos o apoio financeiro da American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 e do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Matrigel (9-12 mg/ml) | BD Biosciences | 354277 | |
| Mídia RPMI | Invitrogen | 11835055 | |
| Mídia RPMI livre de glicose | Invitrogen | 11879-020 | |
| B27 Minus Insulin | Invitrogen | A1895601 | |
| B27 Suplemento (c/ insulina) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Antibiótico Pen-strep | Invitrogen | 15140122 | |
| Soro fetal bovino | BenchMark | 100-106 | |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| Inibidor de ROCK Y-27632 | EMD Millipore | 688000 | |
| CHIR99021 | Thermo Fisher | 508306 | |
| IWR1 | Sigma | I0161 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Levantador de células Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Fisher | 08-100-240 | ||
| Cryovial | Fisher (tubos NUNC) | 375418 | |
| TrypLE Select Enzyme | Invitrogen | 12563-011 |
Referências
- Sharma, A., Wu, J. C., Wu, S. M. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for cardiovascular disease modeling and drug screening. Stem Cell Research & Therapy. 4 (6), 150(2013).
- Kehat, I., et al.
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Reimpressões e permissões
