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Artigo de método

Derivação de Cardiomyocytes altamente purificada de induzidas pelo homem pluripotentes células estaminais usando pequenos Diferenciação modulada-Molecule e Subsequente Glucose Fome

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DOI:

10.3791/52628

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18 de março de 2015

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Institute of Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Cardiovascular Medicine Division, Department of Medicine, Child Health Research Institute, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos um protocolo robusto para derivação de cardiomiócitos humanos que combina diferenciação cardíaca modulada por pequenas moléculas e purificação de cardiomiócitos mediada por privação de glicose, permitindo a produção de cardiomiócitos purificados para fins de modelagem de doenças cardiovasculares e triagem de drogas.

Resumo

-Tronco pluripotentes derivadas de células cardiomiócitos Humanos induzida (hiPSC-CMS) tornaram-se uma importante fonte de células para suprir a falta de cardiomiócitos primários disponíveis para aplicações de pesquisa básica e translacional. Para diferenciar hiPSCs em cardiomiócitos, vários protocolos, incluindo corpo embryoid (EB) diferenciação baseada e indução do fator de crescimento têm sido desenvolvidos. No entanto, estes protocolos são ineficientes e altamente variáveis ​​na sua capacidade para gerar cardiomiócitos purificadas. Recentemente, uma pequena protocolo utilizando modulação baseada molécula de sinalização Wnt / β-catenina foi mostrado para promover a diferenciação cardíaca com alta eficiência. Com este protocolo, superior a 50% -60% de células diferenciadas foram cardiomiócitos troponina positiva cardíacos foram observados de forma consistente. Para aumentar ainda mais a pureza de cardiomiócitos, as células diferenciadas foram sujeitas a inanição glicose para eliminar especificamente não-cardiomiócitos com base na diferença metabólicas entre cardiomiócitos e não-cardiomiócitos. Utilizando esta estratégia de selecção, que, consistentemente, obtido um aumento superior a 30% na proporção de cardiomiócitos a não cardiomiócitos em uma população de células diferenciadas. Estes cardiomiócitos altamente purificadas deverão aumentar a confiabilidade dos resultados de humano com base em estudos de modelagem em iPSC doença in vitro e testes de rastreio de drogas.

Introdução

Cardiomiócitos primários humanos são difíceis de obter devido à exigência de biópsias cardíacas invasivos, dificuldade em se dissociar para células individuais, e por causa da sobrevivência celular a longo prazo pobre em cultura. Devido a esta falta de cardiomiócitos humanos primários, induzida pelo homem-tronco pluripotentes cardiomiócitos derivados de células específicas do paciente tecnologia (hiPSC-CM) tem sido considerado como uma fonte de cardiomiócitos alternativa poderosa para a pesquisa básica, bem como as aplicações clínicas e translacionais como modelagem de doença e drogas descoberta 1. Os esforços iniciais em diferenciação de células estaminais pluripotentes em cardiomiócitos empregues protocolos de diferenciação, usando corpos embrióides (EBS), mas este método é ineficiente porque em cardiomiócitos que produzem muitas vezes menos do que 25% de células em um EB são batendo cardiomiócitos 2,3. Comparativamente, um protocolo de diferenciação com base em monocamada utilizando as citocinas activina A e BMP4 exibida uma maior eficiência do que as EBs, maseste protocolo ainda é relativamente ineficiente, requer fatores de crescimento caros, e só funciona em um número limitado de pluripotentes humanas linhas de células estaminais 4. Recentemente, um protocolo de diferenciação de cardiomiócitos com base em monocamada hiPSC altamente eficiente foi desenvolvido pela modulação da sinalização de Wnt / β-catenina 5. Estes hiPSC-CMs expressar troponina T cardíaca e alfa actinina, duas proteínas sarcoméricas que são marcadores padrão de cardiomiócitos 6. O protocolo de descrever aqui é uma adaptação deste pequeno-base molécula, alimentador de célula livre, diferenciação monocamada método 5,7. Nós somos capazes de obter bater cardiomiócitos de hiPSCs após 7-10 dias (Figura 1). No entanto, seguindo uma diferenciação de cardiomiócitos resultando em 50% de células batendo, de forma consistente imunomarcação mostra a existência de uma população de cardiomiócitos que não são negativas para os marcadores específicos de cardiomiócitos, tais como a troponina T cardíaca específica e alfa-actinina. Para further purificar cardiomiócitos e eliminar não-cardiomiócitos, populações heterogéneas de células diferenciadas foram submetidos a jejum de glucose, tratando-os com um meio extremamente baixo de glucose para a cultura de vários dias (Figura 2). Este tratamento elimina selectivamente não-cardiomiócitos, devido à capacidade de cardiomiócitos, mas não não-cardiomiócitos, para metabolizar lactato como fonte de energia primária, a fim de sobreviver em um ambiente de baixa glicose 8. Após esta fase de purificação, é observado um aumento de 40% na proporção de cardiomiócitos para não-cardiomiócitos, (Figura 3, Figura 4) e estas células podem ser utilizadas para análise da expressão do gene a jusante, modelagem doença, e ensaios de rastreio de drogas.

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Protocolo

NOTA: As informações fornecedor para todos os reagentes utilizados neste protocolo foi listado na Tabela 1 e Lista de Materiais. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células têm de ser estéreis e técnica asséptica deve ser utilizado em conformidade. Executar todas as incubações de cultura numa atmosfera humidificada a 37 ° C, 5% de CO2, a menos que especificado de outra forma. Neste protocolo, todas as diferenças são realizadas em placas de 6 poços, em que os hiPSCs são semeadas. Seguindo diferenciação e purificação, as células podem ser dissociadas e plaqueadas novamente para uso a jusante.

1. Preparação Médio

  1. Para a forma E8, fazer uma solução estoque de cada componente de suporte (NaHCO3, ácido L-ascórbico 2-fosfato, selenito de sódio, transferrina, insulina, FGF2, TGFB1) e armazenar as soluções a -20 ° C. Adicionar uma quantidade adequada de soluções de ações para a garrafa de DMEM / F12 e filtrar para esterilizar. A solução concentrção e configuração de reação para os componentes de ações e médio E8 podem ser encontrados na Tabela 1.
  2. Para a solução de matriz extracelular, descongelar a matriz da membrana basal (geralmente fornecido a 10 mg / ml) a 4 ° CO / N. Matrigel é vulgarmente utilizado para a cultura de células estaminais pluripotentes porque as células estaminais pluripotentes humanas podem aderir bem a esse material, utilizando a alfa-6-beta-1 integrina 9. Uma vez descongelado, fazer 2,25 mg (250 ul) alíquotas em gelo usando pontas de pipetas de gelo frio e os tubos e armazenar as alíquotas a -80 ° C.
    1. Quando pré-revestimento de placas com ECMS, descongelar e Alíquota da solução matriz extracelular (ECMS) em gelo. Misture a ECMS e meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200 em gelo. Manter a calma para evitar a solidificação prematura ECMS.
  3. Para o RPMI / B27 sem meio de insulina, adicione 10 ml de B27 Minus Insulina em 500 ml de meio RPMI.
  4. Para o RPMI / B27 (com insulina) médio, adicione 10 ml de B27 Supplement (com insulin) e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI.
  5. Para o médio glicose baixa, adicione 10 ml de B27 Supplement e 5 ml de antibiótico Pen-strep em 500 ml de meio RPMI livre de glicose.
  6. Para a forma / a criopreservação de congelação, mistura de soro fetal bovino, juntamente com dimetilsulfóxido (DMSO) a uma proporção de 9: 1. O meio de congelação podem ser armazenadas até 1 mês a 4 ° C.
    NOTA: Todos os meios devem ser filtrado e armazenado a 4 ° C e utilizadas dentro de 2 semanas a menos que especificado de outra forma. Todos os volumes de reagente / solução usados ​​abaixo destinam-se a um único poço em uma placa de 6 poços, salvo indicação em contrário.

2. Pré-revestimento de placas de 6 poços com ECMS

  1. Adicione ECMS misturando matriz da membrana basal (por exemplo, Matrigel) com meio DMEM / F12 com gelo numa proporção de 1: 200, em seguida, aplicam-se 2 ml de ECMS acabado de fazer a cada poço para uma placa de 6 poços. Cada poço de uma placa de 6 poços receberá aproximadamente 90 mg ECMS.
  2. Incubar a ECMS placas revestidas durante 1 hora a 37 ° C. Imediatamente antes do plaqueamento das células, aspirado de solução DMEM / F12 de cada poço. As placas então estará pronta para receber células.

3. o descongelamento das hiPSCs congelados

NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante da hiPSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento.

  1. Descongelar um frasco de hiPSCs para cada poço de uma placa de 6 poços. Prepare um tubo de 15 ml com 9 ml de meio frio E8 com inibidor ROCHA (10 mM) para cada frasco. Inibidor ROCHA melhora hiPSCs sobrevivência após a criopreservação 10. Manter os frascos em 37 ° C banho de água para descongelar as células até um aproximadamente 5 mm de diâmetro de cristais de gelo é deixado.
  2. Pulverizar o exterior dos frascos com etanol a 70%. Limpe os frascos com papel de seda antes de movê-los para a capa laminar estéril.
  3. Transferem-se as células para dentro do tubo cónico preparado. Enxágüe tele frasco uma vez com 500 ul de meio E8 e transferir o meio contendo as células descongeladas para o mesmo tubo cónico. Centrifuga-se a TA, durante 4 minutos a 200 x g.
  4. Aspirar o sobrenadante após centrifugação e ressuspender cuidadosamente a pelete de células com 2 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Transferem-se as células em suspensão para um poço de uma placa de 6 poços pré-revestidos com ECMS.
  5. Substitua o meio com meio E8 sem inibidor ROCHA após 24 horas de cultivo. As células devem ter aderido a essa altura.

4. Passaging de hiPSCs

  1. Tipicamente, hiPSCs passagem depois de atingir 75% -80% de confluência numa placa de 6 poços. Aspirar o meio de cultura. Lavar rapidamente poços com 1 ml de solução estéril, RT PBS. Aspirar PBS.
    1. Adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM ou solução 1x separação celular (por exemplo, Accutase) e incubar durante 1-7 minutos à temperatura ambiente. Momento adequado para EDTA de incubação varia de acordo com a linha hiPSC. Esperar para ver o visível ondulaçãor espessamento de colónias em torno das bordas, como isto indicará que a solução de EDTA ou separação celular está pronto para ser removido.
  2. Aspirar o EDTA ou o desprendimento de células solução. Adicionar 1 ml de meio suplementado com 10 E8 uM inibidor ROCHA. Deslocar colônias hiPSC no poço pipetando repetidamente cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias deve ser dividido em 10/05 aglomerados de células após a conclusão.
  3. Transferem-se as colónias que são suspensos em 1 ml de meio com E8 inibidor ROCHA em um tubo de 15 ml.
  4. Disrupt os grandes aglomerados de células em pequenos aglomerados no meio E8. Adicionar um volume adequado de meios E8 com inibidor para a suspensão de células para diluir as células. O volume do meio para adicionar para diluição depende da densidade celular e o número de poços para ser semeada. Idealmente, uma única, 80% confluentes poço de hiPSCs devem ser diluídas 1:12.
    1. Adicionar 11 ml de meio E8 com inibidor de pedra para o 1 ml existentes de cell solução acima mencionado em 15 ml de tubo cónica para obter uma diluição de 1:12.
  5. Além disso triturar os aglomerados de células em fragmentos de células pequenas (cerca de 50-200 células em cada fragmento é melhor). Evite o excesso de trituração, pois isso reduz a sobrevivência da célula.
  6. Aspirar ECMS das placas pré-revestidas e adicionar 2 ml de células ressuspensas em cada poço. Cerca de 100.000 células por poço de uma placa de 6 poços é ideal. Destinam-se a distribuir as células uniformemente em torno do poço para evitar a aglomeração de células no centro do poço.
  7. Após 24 h de cultura, substituir o meio com meio E8 sem inibidor ROCK. Alterar o meio de cultura a cada 24 horas até que as células tornam-se 80% confluentes. Em seguida, as células estão prontas para passagem de novo. Ele normalmente leva 3-6 dias entre as passagens para chegar a 80% de confluência.

5. hiPSCs Congelamento

NOTA: Intimamente seguir este procedimento, uma vez que pode levar a cultura ideal e diferenciação jusante do quadrilSCs em hiPSC-CMs seguindo o ciclo de congelamento / descongelamento.

  1. Rotular tubos criogênicos com o nome da linha celular, tipo de célula, número de passagens, e data de congelamento. Como orientação geral, utilizar um frasco para cada poço de uma placa de 6 poços. Preparar um tubo de 15 ml cheio com 9 ml de meio E8 com inibidor ROCHA (10 uM). Prepare meio com FBS a 90% e DMSO a 10% frio, e manter o meio a 4 ° C até estar pronto para usar.
  2. Aspirar o meio de cultura, adicionar 500 ul de EDTA 0,5 mM, solução ou separação celular 1x e incubar durante 2-7 minutos à temperatura ambiente. A duração da exposição à solução de EDTA ou desprendimento de células varia de linha celular para linha celular.
  3. Aspirar solução de EDTA ou separação celular. Adicionar 1 ml de meio E8.
  4. Deslocar colônias hiPSC no bem por pipetagem cima e para baixo e pulverização colônias fora com uma pipeta P1000. Colônias não deve ser quebrado em menor que 100 aglomerados de células. Transfira as células em suspensão para o tubo cônico preparado contendo E8. Centrifugar a RT durante 4 minutos a 200 x g.
  5. Aspirar o sobrenadante e adicionar 500 uL de meio de congelação frio ao sedimento. Ressuspender o sedimento por pipetagem de uma a duas vezes. A sobrevivência celular é melhorado mantendo as células em grandes aglomerados.
  6. Transferem-se as células ressuspensas para um tubo criogénico marcado. Mover-se rapidamente os frascos num recipiente de congelamento contendo isopropanol, o que vai permitir o resfriamento gradual. Manter o recipiente com as células a -80 ° C durante 24 hr, em seguida, transferir as células em azoto líquido durante a armazenagem a longo prazo.

6. Cardiac Diferenciação de iPSC Humano

NOTA: Todos os meios devem ser, pelo menos em RT quando adicionado.

  1. Depois de dissociação com solução descolamento EDTA ou 1x celular, sementes aproximadamente 100.000 iPSCs humanos na ECMS revestidas placas de cultura de 6 poços de diferenciação (mesmos passos como procedimentos Passaging celular). Quando as células chegar a 85% de confluência, mudar o meio de RPMI / B27 sem meio de insulina com 6? M CHIR99021 inibidor GSK3-beta (CHIR) e manter durante 48 horas.
  2. Após 48 horas, substituir o meio de cultura contendo CHIR- com RPMI / B27 sem meio de insulina e deixar sozinho por 24 horas (até dia 3).
  3. No dia 3, alterar a mídia para RPMI / B27 sem insulina com 5 � Wnt inibidor IWR1 e manter durante 48 horas (até o dia 5).
    NOTA: Wnt inibição também pode ser tentada com outros compostos de moléculas pequenas, tal como descrito em estudos anteriores 11. IWR1 foi seleccionado para outros inibidores de moléculas pequenas de Wnt, devido ao aumento da gama em que se tem demonstrado ser eficaz na inibição da sinalização de Wnt 11.
  4. No dia 5, mudar o meio de volta para RPMI / B27 sem meio de insulina e deixe por 48 horas (até dia 7).
  5. No dia 7, substituir o meio com meio RPMI / B27 (com insulina) e substituir meio a cada 3 dias depois com a mesma forma. Surra espontânea de cardiomiócitos deve ser a primeira visível aproximadamente no dia 8 ao dia10.

7. Purificação de Cardiomyocytes Humanos por inanição Glucose

  1. No dia 10 pós-diferenciação, alterar o meio em cada poço da placa de 6 poços a 2 ml de meio de baixo teor de glucose e manter as células neste meio durante 3 dias (até ao dia 13).
  2. No dia 13, o retorno células de meio RPMI / B27 (com insulina).
  3. Opcionalmente, replate cardiomiócitos antes da segunda rodada de fome glucose para ajudar a soltar os não-cardiomiócitos da placa de cultura, permitindo a fácil dissociação dos não-cardiomiócitos durante a inanição glucose.
    1. No dia 13, o meio aspirado, lavar uma vez com PBS, e dissociar as células em células individuais utilizando 500 ul da enzima de dissociação de células durante 5 min a 37 ° C. Especificamente, após 5 min de tratamento com enzima, utilizar uma pipeta de 1000 ul de dissociar cardiomiócitos manualmente a partir da placa de 6 poços, puxando-se repetidamente a enzima dissociação celular e pulverizando-a contra o cardiomyomonocamada cyte. Até 30 repetições de pipetagem pode ser necessária para dissociar os cardiomiócitos em células individuais.
    2. Depois as células são dissociadas e estão na forma de uma única célula, recolher todas as células num tubo de 15 ml cheia com 5 ml de meio RPMI / B27 com insulina para diluir a enzima dissociação celular e centrifugar durante 4 minutos a 200 x g. Aspirar e desprezar o sobrenadante.
    3. Re-suspender as células com 2 ml de RPMI / meio B27 e placa para um novo ECMS-revestido placa de 6 poços. Normalmente, maior confluência de cardiomiócitos ajuda com a sobrevivência das células durante repique. Destinam-se a replate 2 milhões de células por nova 6 poços prato para a sobrevivência ideal durante repique.
  4. No dia 14, mudar o meio de volta para 2 ml de meio de baixo teor de glucose para um segundo ciclo de privação de glicose. Cultura as células neste estado glicose baixa para mais de 3 dias. A maioria dos cardiomiócitos não vai morrer nesta condição cultura pobre em glucose.
  5. No dia 17, para alterar a forma de R 2 mlMédio PMI / B27 com insulina. As células remanescentes serão cardiomiócitos altamente purificadas. Estes cardiomiócitos pode ser usado para a análise da expressão do gene, o rastreio de drogas, análise metabólica, e vários outros ensaios a jusante.

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Resultados

As alterações morfológicas durante a diferenciação hiPSC.

O hiPSC cultivadas em placas de livre-de alimentação cresceu como planas, colônias bidimensionais. Ao atingir cerca de 85% de confluência, hiPSCs foram tratados com 6 uM CHIR para diferenciação (Figura 1A). Quantidades substanciais de morte celular, um fenômeno normal e comum, foram observados após 24 horas de tratamento CHIR. Depois de dois dias de tratamento com CHIR, os hiPSCs continuaram a diferen...

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Discussão

A obtenção de uma grande quantidade de derivados de cardiomiócitos hiPSC altamente purificadas é crítica para a investigação básica cardíaca, bem como aplicações clínicas e translacionais. Protocolos de diferenciação cardíacos tenham sido submetidos a enormes melhorias nos últimos anos, a transição de métodos baseados em corpo embri�des utilizando crescimento cardiogênico fatores 2, a matriz métodos sanduíche 12 e, finalmente, para as pequenas métodos baseados monocamada modulada-molécula e ...

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Divulgações

Os autores não declaram interesses conflitantes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado em parte pelo NIH / NHBI (U01 HL099776-5), o NIH Director's New Innovator Award (DP2 OD004411-2), o Instituto de Medicina Regenerativa da Califórnia (RB3-05129), a American Heart Association (14GRNT18630016) e o Endowed Faculty Scholar Award da Lucile Packard Foundation for Children e do Child Health Research Institute em Stanford (para SMW). Também reconhecemos o apoio financeiro da American Heart Association Predoctoral Fellowship 13PRE15770000 e do National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program DGE-114747 (AS).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Matrigel (9-12 mg/ml)BD Biosciences354277
Mídia RPMIInvitrogen11835055
Mídia RPMI livre de glicoseInvitrogen11879-020
B27 Minus InsulinInvitrogenA1895601
B27 Suplemento (c/ insulina)Invitrogen17504-044
Antibiótico Pen-strepInvitrogen15140122
Soro fetal bovinoBenchMark100-106
DMSOSigmaD-2650
Inibidor de ROCK Y-27632EMD Millipore688000
CHIR99021Thermo Fisher508306
IWR1SigmaI0161
EDTAInvitrogen15575-020
Levantador de células AccutaseMilliporeSCR005
Fisher08-100-240
CryovialFisher (tubos NUNC)375418
TrypLE Select EnzymeInvitrogen12563-011

Referências

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