Sincronização de Caulobacter crescentus Para Investigação do Ciclo Celular Bacteriana

Resumo

A sincronização das células bacterianas é essencial para estudos do ciclo e desenvolvimento celular bacteriano. Caulobacter crescentus é sincronizável através de centrifugação por densidade, permitindo uma ferramenta rápida e poderosa para estudos do ciclo celular bacteriano. Aqui fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização de células de Caulobacter.

Resumo

O ciclo celular é importante para o crescimento, replicação do genoma e desenvolvimento em todas as células. Nas bactérias, os estudos do ciclo celular se concentraram principalmente em células não sincronizadas, dificultando a ordenação dos eventos temporais necessários para a progressão do ciclo celular, replicação e divisão do genoma. Caulobacter crescentus fornece um excelente sistema modelo para o ciclo celular bacteriano pelo qual as células podem ser rapidamente sincronizadas em um estado G0 por centrifugação de densidade. Experimentos de sincronização do ciclo celular têm sido usados para estabelecer os eventos moleculares que governam a replicação e segregação cromossômica, para mapear uma rede regulatória genética que controla a progressão do ciclo celular e para identificar o estabelecimento de complexos de sinalização polar necessários para a divisão celular assimétrica. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para a sincronização rápida de células Caulobacter NA1000. A sincronização pode ser realizada em um formato de grande escala para perfis de expressão gênica e ensaios de western blot, bem como em um formato de pequena escala para ensaios de microscopia ou FACS. A rápida sincronizabilidade e o alto rendimento celular de Caulobacter tornam este organismo um poderoso sistema modelo para estudos do ciclo celular bacteriano.

Introdução

O ciclo celular bacteriana controla a replicação do genoma e a divisão de células filhas. É importante salientar, como a resistência aos antibióticos é uma ameaça crescente para a saúde pública, o ciclo celular bacteriana apresenta um alvo inexplorado para o desenvolvimento de antibióticos.

No bactéria Caulobacter crescentus, cada ciclo celular conduz a uma divisão assimétrica, obtendo-se duas células filhas de destinos diferentes (Figura 1A) ^1,2. Uma célula filha herda um flagelo e é móvel, enquanto a outra filha herda uma haste e é séssil. Um circuito genético integrado controla a progressão do ciclo celular e destino celular por regulação da transcrição, fosfo-sinalização, e proteólise regulamentado ^3. Além disso, a replicação do cromossoma e células filhas segregação de rendimento concomitantes que contêm uma cópia exacta do cromossoma ^4. É importante notar que estes dois tipos de células podem ser rapidamente separados por colloidal de partículas de sílica de centrifugação de densidade na estirpe sincronizável NA1000 ^5-7 permitindo o isolamento das células swarmer do resto da população com rendimentos elevados (Figura 1B). Isolado swarmer células em seguida, proceder de forma síncrona através da divisão celular assimétrica. Aqui, nós detalhe o protocolo utilizado para a sincronização de Caulobacter NA1000 estirpe. Nós fornecemos protocolos e dicas de solução de problemas comuns para ambos de grande e pequena escala sincronizações. Este procedimento experimental proporciona uma ferramenta poderosa para interrogar o controlo espacial e temporal da Caulobacter ciclo celular e o destino celular.

Protocolo

1. grande escala Synchrony - Optimal para Western Blot, Microarray / RNA-Seq, e outros ensaios Intensivo de materiais

1. A partir de um estoque congelador ou uma placa, um crescer 5 ml O / N cultura da estirpe NA1000 por agitação a 28 ° C em meio PYE.
2. Inocular 0,5 ml de células a partir do passo 1 em 25 ml de M2G (Tabelas 1-2) e agitar a 28 ° C até a cultura atingir uma OD ₆₀₀ entre 0,5 e 0,6.
3. Inocular as células em 1 L de M2G e agitar a 28 ° C.
4. Uma vez OD ₆₀₀ atinge 0.5 a 0.6, confirmar a presença de swarmer células usando microscopia de fase líquida montado. Ponto 1 ml de células em uma lâmina de vidro, cubra com uma tampa de deslizamento e imagem por meio de microscopia de fase. Confirmar a presença de células Swarmer, visualizando as células rapidamente natação na população.
5. Girar células durante 15 min a 7 kxg a 4 ° C num rotor JA-10.
6. Desprezar o sobrenadante e adicionar 180 ml de frio M2 (Tabelas 1-2) e res delicadamenteuspend todas as células utilizando uma pipeta serológica. Descarte células frouxamente peletizadas; eles são células predivisional e saiu.
7. Adicionar 60 ml de solução de sílica coloidal fria (não se esqueça de misturar a suspensão de sílica coloidal bem antes de adicionar às células) e misturar a suspensão de células bem.
8. Verter a suspensão de células em oito tubos de 30 ml e girar durante 30 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
   NOTA: Deve-se ver duas bandas distintas; a banda swarmer é a banda inferior, enquanto espreitavam / células predivisional estão na faixa superior (Figura 1B).
9. Aspirar cuidadosamente a banda superior e retire o líquido a ~ 1 cm acima da banda swarmer (a banda inferior).
10. (Crítica) Usando uma pipeta Pasteur, retire cuidadosamente a banda swarmer e coloque em um tubo limpo. Para lavar a sílica coloidal, parte superior do tubo fora com frio M2 e centrifugação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
11. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender oas células em 20 ml de frio M2 e rotação durante 10 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20.
12. Ressuspender todas as pelotas em 30 ml de frio M2 e medir o OD ₆₀₀ usando um espectrofotômetro e em branco, utilizando meio M2 frio. Salve 1 ml para a imagem latente fase para verificar se há swarmer células; 90-95% das células devem ser Swarmers.
13. Girar as células durante 5 min a 6,4 kxg a 4 ° C num rotor JA-20. Ressuspender as células em meio de 28 ° C de modo que o M2G A ₆₀₀ é ~ 0,3-0,4 e começar agitação a 28 ° C.
    NOTA: Os rendimentos típicos são entre 30 e 60 mL de swarmer cultura de células de 1L de células não sincronizadas.
14. Comece a tomar pontos no tempo (cultura de tipo selvagem levará aproximadamente 135-140 minutos para dividir) ^8,9. Em cada ponto de tempo, medir o OD _600. Verifique se o OD ₆₀₀ após a divisão é de aproximadamente 2X o OD inicial _600.
15. Para blot ou de expressão de genes ensaios ocidentais, retirar alíquotas de 1 mL do cuLTURE nos momentos desejados, girar na velocidade máxima em uma centrífuga de mesa para 30 seg, rapidamente decantar ou aspirar o meio, e flash congelar o pellet celular em nitrogênio líquido. Armazenar as células à temperatura de -80 ° C até à análise a jusante.

2. pequena escala Synchrony - Optimal de Microscopia

1. A partir de um estoque congelador ou uma placa, crescer uma cultura de 5 ml O / N com agitação a 28 ° C em M2G.
2. Diluir em 15 ml de M2G (Tabelas 1-2) e crescer até meados de log (OD ₆₀₀ = 0,5-0,6).
3. Rotação em 6,4 kxg durante 10 min a 4 ° C num rotor JA-20, e ressuspender em 1 ml M2 frio (Tabelas 1-2) e transferência para um tubo de microcentrifugação de 2 ml.
4. Centrifugação 15 kxg durante 3 min num tubo de microcentrífuga para sedimentar as células, aspirar o sobrenadante, o sedimento colocado em gelo, e ressuspender em 900 ul de frio M2.
5. Adicionar 900 ul de PVP frio revestido de sílica coloidal e centrifugação durante 20 min a 15 kxg a 4 ° C num microfonetubo rocentrifuge.
6. (Critical) Aspirar ou pipeta fora do topo perseguido banda de células predivisional / e recolher o fundo swarmer banda em um novo tubo de microcentrífuga.
7. Lavar as células duas vezes swarmer em 1 ml de frio, enquanto M2 centrifugação a 15 kxg durante 3 min.
8. Antes da centrifugação final, mover as células em 1 ml de um tubo de ensaio de vidro pré-gelada e medir a DO ₆₀₀ das células em comparação com um branco de M2.
9. Ressuspender o sedimento celular final a 28 ° C a uma DO M2G entre 0,3-0,4 e agitar células / rolo a 28 ° C.
   NOTA: Os rendimentos típicos são entre 2 e 4 ml de cultura de células swarmer.
10. Para experimentos de microscopia, nos momentos lugar 1 ml de células desejado para uma almofada de agarose M2G para geração de imagens.

Resultados

Sincronização normalmente produz duas bandas de células (Figura 1B): a banda swarmer, que tem uma densidade mais elevada, e uma banda de células perseguido / predivisional de menor densidade. Para garantir controles comuns de sincronização eficiente incluir o acompanhamento da OD ₆₀₀ e medição dos níveis de proteína CtrA por western blot no ciclo celular momentos distintos. O OD ₆₀₀ deveria aumentar em cerca de 2 vezes durante o decurso do ciclo celular (Figura 2)....

Discussão

O ciclo celular bacteriano é um processo fundamental na vida e é importante para o estudo do crescimento e como alvo para antibióticos de próxima geração. Aqui, detalhamos os procedimentos de sincronização rápida para C. crescentus NA1000, um organismo modelo para o estudo do ciclo celular bacteriano e da divisão celular assimétrica. Este método pode ser alterado para western blot, perfil de expressão gênica e ensaios de microscopia de fluorescência para investigar a regulação espaço-temporal do ciclo celular b...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sílica coloidal revestida com PVP (Percoll)	Sigma-Aldrich	P4937
Sílica coloidal (Ludox AS-40)	Sigma-Aldrich	420840
JA10 Rotor	Beckman-Coulter	369687
JA20 Rotor	Beckman-Coulter	334831
Solução de sulfato ferroso quelato	Sigma-Aldrich	F0518
Tubos de centrífuga de 30 ml	Corning	8445
Na2HPO4	EMD	SX0720-1
KH2PO4	VWR	BDH9268-500G
NH4Cl	Amresco	0621-500g