O método de imagem vertical descrito neste protocolo permite a visualização detalhada dos pólos de um ovo de Drosophila melanogaster em desenvolvimento. Essa visão final fornece uma nova perspectiva sobre os arranjos e morfologias de vários tipos de células no epitélio folicular.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A oogênese de Drosophila melanogaster fornece um contexto ideal para estudar processos de desenvolvimento variados, uma vez que o ovário é relativamente simples em arquitetura, é bem caracterizado e é passível de análise genética. Cada câmara de ovo consiste em células germinativas cercadas por uma única camada epitelial de células foliculares somáticas. Subconjuntos de células foliculares sofrem diferenciação durante estágios específicos para se tornarem vários tipos de células diferentes. As técnicas padrão permitem principalmente uma visão lateral das câmaras de óvulos e, portanto, uma visão limitada da organização e identidade das células foliculares. O protocolo de imagem vertical descreve uma técnica de montagem que permite uma nova visão vertical das câmaras de ovos com um microscópio confocal padrão. As amostras são primeiro montadas entre duas camadas de geléia de glicerina em uma posição lateral (horizontal) em uma lâmina de microscópio de vidro. A geléia com câmaras de ovos envoltas é então cortada em blocos, transferida para uma lamínula e virada para posicionar as câmaras de ovos na vertical. As câmaras de ovos montadas podem ser visualizadas em um microscópio confocal vertical ou invertido. Essa técnica permite o estudo da especificação, organização, marcadores moleculares e desenvolvimento de óvulos das células foliculares com novos detalhes e de uma nova perspectiva.
Introdução
Estudo da Drosophila melanogaster tem proporcionado grandes insights sobre a regulação genética de uma ampla gama de fenômenos. Em particular, tem havido uma extensa pesquisa sobre o desenvolvimento do ovo, porque oogenesis fornece uma maneira dócil para investigar vários processos de desenvolvimento diferentes, incluindo padrões de tecidos, alterações de polaridade celular, comutação do ciclo celular, e regulação de translação 1,2,3,4. Um evento morphogenic importante durante oogenesis é a especificação, aquisição de motilidade, e migração de um conjunto de células, chamadas de células de fronteira (revisto em 5). Uma vez que a migraçã....
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Protocolo
1. Dissecção da ovaríolos
- Transferir cerca de quinze 2-4 dias de idade moscas fêmeas e alguns machos a uma mosca frasco fresco alimentos com adição de levedura seca activa. Use algodão como um plug para os frascos, e adicione algumas gotas de água para o algodão para manter a umidade alta.
- Coloque o frasco numa incubadora a 25 ° C durante 14-16 h, para maximizar o número de câmaras de 8-10 fase de ovo.
NOTA: O tempo de incubação varia dependendo da temperatura e estágio desejado. - Prepare a mídia de dissecação, 0,1 M KPO 4 e NP40 soluções conforme necessário para o dia seguinte (ver Materiais).
- Anestesiar as m....
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Resultados
O método de imagem na vertical nos permitiu ver diretamente a organização das células do epitélio folicular anterior na fase 8. Um marcador geral para o destino células do folículo, o Absent Eyes (EJA) de proteínas, bem como o marcador de DNA nuclear DAPI, mostrou ainda expressão através deste campo de células, e demonstrou que todas as células podem ser vistos com intensidades de coloração semelhante (Figura 2B "). As proteínas reguladas, em resposta à UPD citoquina, no entanto, mostraram padrões .......
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Discussão
Aqui nós descrevemos um método para montar e pequena imagem, o desenvolvimento de câmaras de ovos de uma perspectiva end-on. Técnicas comuns para câmaras de ovos de imagem são otimizados para vistas laterais e permitir principalmente a visualização precisa das células do folículo medio-lateral quando coradas com anticorpos fluorescentes. O uso de Z-stacks ou 3-D reconstruções auxilia na visualização de vários planos focais, mas ainda é insuficiente para a resolução de sub-celular dos pólos de câmaras de ovos elípticos <.......
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a assistência de membros da comunidade de moscas, particularmente da Dra. Denise Montell, Dra. Lynn Cooley e Dra. Pernille Rorth, para reagentes. Agradecemos à Flybase, ao Bloomington Drosophila Stock Center e ao Developmental Studies Hybridoma Bank pelas informações e pelo fornecimento de estoques de moscas e anticorpos, respectivamente. O LM é apoiado pelo Departamento de Educação Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) bolsa de treinamento (P200A120017) e por uma Iniciativa NIGMS para Maximizar o Desenvolvimento do Aluno Grant (2 R25-GM55036). Uma parte do trabalho de microscopia foi apoiada pela concessão de ressonância magné....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampão fosfato de potássio (KPO4 Buffer) | Adicione 3,1 g de NaH2PO4• H2O e 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) a H2O destilado para perfazer um volume de 1 L. O pH da solução final será 7,4. Este buffer pode ser armazenado por até 1 mês a 4 graus C. | ||
| Solução aquosa de paraformaldeído a 16%, grau EM | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710 | livre de metanol para preservar a fluorescência GFP |
| Agulha de 30G x 1/2 polegada | VWR | BD305106 | Levedura Seca Ativa de Bisel Regular |
| Genesee Scientific | 62-103 | Para engordar moscas fêmeas | |
| Albumina de soro | bovino PAA-cell culture company | A15-701 | Usado no tampão de lavagem NP40 |
| Fórceps Dumont #5 Fine | Science Tools | 11295-10 | Liga Dumostar, ponta biologie; pontas afiadas são essenciais para a dissecção |
| do ovárioDAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml solução estoque |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Adicionado ao meio de dissecção suplementar (10%) |
| Tubo de cultura de vidro | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Lâminas de Depressão de Vidro | VWR | 470019-020 | 1,2 mm de Espessura, |
| Geleia de Glicerina de Cavidade Dupla | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mídia de montagem |
| Glicerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% em PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML( | intercambiável para Nonidet P-40) Usado em Tampão de Lavagem NP40 |
| Estereoscópio Fluorescente Leica | Leica Microsystems | ||
| Microscópio Confocal Leica SP5 | Leica Microsystems | 40x/0.55NA objetiva seca | |
| Micro espátula | VWR | 82027-518 Lâmina de | em aço inoxidável |
| VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm | |
| NP40 Tampão | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA e 0,02% azida sódica | ||
| Penicilina-estreptomicina-Glutamina | Life Technologies | 10378-016 | Adicionado ao meio de dissecção suplementar (0,6X) |
| Petrídiche- Poliesterina, estéril | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Tampão de Fosfato Salino | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 pacotes de fosfato |
| de potássio dibásico | em pó Sigma Aldrich | P3786-500G | Usado em 0.1 M KPO4 Buffer |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma Aldrich | P9791-500G | Usado em 0.1 M KPO4 Buffer |
| [cabeçalho] | |||
| Schneider' s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 | Com L-glutamina e bicarbonato de sódio |
| Azida de sódio | Sigma Aldrich | S2002-25G | Usado na coloração de anticorpos fluorescentes |
| Cloreto de sódio | Sigma Aldrich | S3014-500G | Usado no tampão de lavagem NP40 |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7,4 |
| Volocidade Imagem 3D Software de análise | PerkinElmer | para processamento de pilhas Z confocais |
Referências
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Bastock, R., St Johnston, D. Drosophila oogenesis. Curr Biol. 18 (23), R1082-R1087 (2008).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A.
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Reimpressões e permissões
