O método de imagem vertical descrito neste protocolo permite a visualização detalhada dos pólos de um ovo de Drosophila melanogaster em desenvolvimento. Essa visão final fornece uma nova perspectiva sobre os arranjos e morfologias de vários tipos de células no epitélio folicular.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
A oogênese de Drosophila melanogaster fornece um contexto ideal para estudar processos de desenvolvimento variados, uma vez que o ovário é relativamente simples em arquitetura, é bem caracterizado e é passível de análise genética. Cada câmara de ovo consiste em células germinativas cercadas por uma única camada epitelial de células foliculares somáticas. Subconjuntos de células foliculares sofrem diferenciação durante estágios específicos para se tornarem vários tipos de células diferentes. As técnicas padrão permitem principalmente uma visão lateral das câmaras de óvulos e, portanto, uma visão limitada da organização e identidade das células foliculares. O protocolo de imagem vertical descreve uma técnica de montagem que permite uma nova visão vertical das câmaras de ovos com um microscópio confocal padrão. As amostras são primeiro montadas entre duas camadas de geléia de glicerina em uma posição lateral (horizontal) em uma lâmina de microscópio de vidro. A geléia com câmaras de ovos envoltas é então cortada em blocos, transferida para uma lamínula e virada para posicionar as câmaras de ovos na vertical. As câmaras de ovos montadas podem ser visualizadas em um microscópio confocal vertical ou invertido. Essa técnica permite o estudo da especificação, organização, marcadores moleculares e desenvolvimento de óvulos das células foliculares com novos detalhes e de uma nova perspectiva.
Introdução
Estudo da Drosophila melanogaster tem proporcionado grandes insights sobre a regulação genética de uma ampla gama de fenômenos. Em particular, tem havido uma extensa pesquisa sobre o desenvolvimento do ovo, porque oogenesis fornece uma maneira dócil para investigar vários processos de desenvolvimento diferentes, incluindo padrões de tecidos, alterações de polaridade celular, comutação do ciclo celular, e regulação de translação 1,2,3,4. Um evento morphogenic importante durante oogenesis é a especificação, aquisição de motilidade, e migração de um conjunto de células, chamadas de células de fronteira (revisto em 5). Uma vez que a migração celular é uma característica fundamental da morfogénese dos animais, e porque a regulação genética do presente processo é bem conservada, determinados mecanismos de moscas são susceptíveis de ser importante em outros contextos. Assim, estamos investigando o controle molecular da migração celular fronteira. Para os nossos estudos, desenvolvemos um novo método para observar os pólos anterior de desenvolvimento de ovos,onde surgem as células de fronteira, para examinar como elas se desenvolvem em detalhe.
Dentro do ovário, câmaras de ovo em várias fases de desenvolvimento existir ao longo das cadeias chamadas ovarioles, que são envolvidas por uma bainha fina (Figura 1A). Cada câmara ovo vai continuar a formar um ovo. Durante oogenesis, vários tipos de células diferentes deve desenvolver-se de forma coordenada. O D. câmara melanogaster ovo é composto por 16 células germinativas, incluindo um oócito, cercado por uma única camada de epitélio folicular 6. Um pequeno número de células especializadas, chamadas células polares, surgem as anteriores e posteriores pólos do epitélio. As células de fronteira 6-8 originam no epitélio anterior da câmara de ovo, induzida pelas células polares 5,7. Em meados de oogénese (etapa 9), as células de fronteira desanexar das suas vizinhas e migram entre as células de enfermagem para atingir o oócito na parte posterior da câmara do ovo 5,7. Este movimento deve ser realizadoenquanto que as células permanecem na fronteira um cluster circundante duas células polares não-móveis, tornando este um tipo de migração celular colectiva. Migração bem-sucedida do grupo de células de fronteira garante o bom desenvolvimento da micrópila da casca do ovo, que é necessário para a fertilização.
As células polares anteriores instruir destino celular fronteira ativando uma cascata de transdução de sinal. Células polares secretar uma citocina, Unpaired (UPD), que se liga a um receptor de membrana, Domeless (DOME), na vizinha células foliculares durante a fase de desenvolvimento do oócito 8 8,9. A ligação da UPD provoca Janus tirosina quinase (JAK) para fosforilar o transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 8,10,11. STAT, em seguida, move-se para o núcleo para activar a transcrição. Células de Fronteira lenta (SLBO) é um fator de transcrição que é um alvo direto da transcrição do STAT e também é necessário para a migração celular fronteira 12. Vistas laterais de câmaras de ovos indicam tatividade STAT chapéu é regulada em um gradiente através do epitélio anterior 8,11,13. Células do folículo mais próximos às células polares têm os mais altos níveis de STAT ativado, assim, tornam-se células de fronteira e invadir o tecido germinal adjacente.
Para entender como as células de fronteira são especificados dentro e destacar do epitélio, precisamos observar como o tecido é organizado. Se virmos câmaras de ovos de uma perspectiva anterior-on, esperaríamos simetria radial da atividade STAT nas células foliculares que cercam as células polares. Um fim-em vista também mostram mais precisamente as diferenças de proteínas de membrana e interfaces célula-célula antes e durante o descolamento do que comparando células em diferentes planos focais. Porque câmaras de ovo são oblongas e ligados uns aos outros por células pedunculares, estabelecem-se em lâminas lateralmente, tornando-o difícil de observar a arquitectura anterior. Assim, muita informação sobre as células nos pólos da câmara de ovo temsido inferida a partir de vistas laterais. Embora algumas informações podem ser obtidas através de algoritmos reconstruções 3-D de secções ópticas, espalhamento de luz, fotodegradativas e limites mais pobres da resolução no eixo Z tornar essa informação menos detalhada e confiável na ausência de técnicas caras, como microscopia de super-resolução 14 . Outros tipos de imagem baseado em seção (por exemplo, microscopia eletrônica ou microtome seccionamento) exigem extensa manipulação de tecidos, incluindo a desidratação, aumentando a probabilidade de artefatos. Assim, foi desenvolvido um novo método para a imagem D. câmaras melanogaster ovos, enquanto na posição vertical. Este método já provou útil para elucidar como células móveis estão fadados (ver resultados representativos e Manning et al, em revisão), e é provável que seja mais amplamente útil em estudos de outros aspectos da oogenesis.
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Protocolo
1. Dissecção da ovaríolos
- Transferir cerca de quinze 2-4 dias de idade moscas fêmeas e alguns machos a uma mosca frasco fresco alimentos com adição de levedura seca activa. Use algodão como um plug para os frascos, e adicione algumas gotas de água para o algodão para manter a umidade alta.
- Coloque o frasco numa incubadora a 25 ° C durante 14-16 h, para maximizar o número de câmaras de 8-10 fase de ovo.
NOTA: O tempo de incubação varia dependendo da temperatura e estágio desejado. - Prepare a mídia de dissecação, 0,1 M KPO 4 e NP40 soluções conforme necessário para o dia seguinte (ver Materiais).
- Anestesiar as moscas usando CO 2, e colocar sob um microscópio de dissecção. Pipet várias gotas de mídia dissecção em cada cavidade no slide depressão vidro.
- Segure fórceps em cada mão em um ângulo de aproximadamente 30 ° para o topo da tabela e orientar uma mosca fêmea com as asas para baixo. Com a mão não-dominante, pegar a fêmea com a pinça, agarrando-a no anterior do abdômen, perto do tórax, e mergulhe-a para a mídia dissecção na depressão de slides (Figura 1A inserção).
- Com o outro par de fórceps, segure o exoesqueleto no ventral posterior do abdômen e perfurar. Agarre os ovários na extremidade posterior, em seguida, puxe-os para fora do abdômen e coloque no meio fresco, do outro lado do slide depressão. (Figura 1A inserção). Evite puxar para além do intestino. Descarte a carcaça.
- Repita o procedimento com as outras moscas fêmeas até que todos os ovários são dissecados. Descartar os machos.
- Com um par de fórceps, segure um ovário na extremidade posterior (perto das maiores câmaras de ovos), e com a outra mão use uma pinça para beliscar uma das câmaras de ovos mais anteriores (germário). (Figura 1A).
- Lenta e progressivamente, puxe uma cadeia ovaríolo fora da bainha de ovário. Continue a dissecar ovarioles individualmente até que todas as câmaras de ovos desejados são removed.
- Repita os passos de 1,7-1,8 para todos os ovários dissecados.
- Uma vez completo, transferir ovarioles a um tubo de 0,6 ml usando uma pipeta de plástico.
- Vamos ovarioles se depositam no fundo do tubo, em seguida, proceder à fixação e coloração etapas.
2. Immunofluorescent (IF) Coloração de ovaríolos
- Remova cuidadosamente media dissecção de ovarioles com uma pipeta. Cuidado para não remover quaisquer ovarioles ou câmaras de ovo. Deixe aproximadamente 50 l de ovarioles e meios de comunicação de dissecação.
- Adicionar 50 mL de 16% de paraformaldeído para 150 mL de 0,1 M KPO 4 tampão em um tubo, e adicionar solução para câmaras de ovos para corrigi-los. Incubar, enquanto balançando para 10 min. CUIDADO: paraformaldeído é tóxico.
- Remover fixador e lavar duas vezes com 0,5 ml de tampão de lavagem NP40.
- Lavar duas vezes durante 15 minutos cada à temperatura ambiente.
- Consulte o padrão se o protocolo 15 para as etapas subseqüentes.
- Resumidamente, após a fixação, adicionarOs anticorpos primários nas diluições apropriadas e incubar O / N a 4 ° C. Lavar em várias vezes NP40, em seguida, adicionar anticorpos secundários (1: 200) diluições.
- Lavar várias vezes em NP40, em seguida, adicionar DAPI (1: 1000) durante 10 min, em seguida, repetir lavagens. Uma vez SE protocolo é completa, adicionar 200 ul de glicerol a 50% em PBS para as câmaras de ovos e deixar repousar à temperatura ambiente durante 2 horas.
- Remova a solução, substitua-o por 70% de glicerol em PBS, e cubra com papel alumínio. Coloque amostra em 4 ᵒC até que esteja pronto para a montagem. Enquanto isso, continue com a etapa 3.
3. Preparação Prévia de glicerina geléia Slides
- Medida pelo menos 4 ml de glicerina geléia com uma espátula e encher um tubo de cultura de células de vidro para a marca de meio caminho. Derreter glicerina geleia num banho de água a 55 ° C durante 30 min.
- Verter uma pequena gota de glicerol, cerca de 300 ul, a partir da solução estoque em duas lâminas de microscópio. Utilizando um tecido, de glicerol em espalhar um la finayer através de cada um dos slides. Isto proporciona uma base e permite a fácil remoção de glicerina geleia no passo 5.6.
- Corte a ponta fora de uma pipeta de ponta 1.000 ul filtrada. Use cut ponteira para transferir 1000-1500 ul de warm geléia glicerina lentamente para cada lâmina de microscópio. Tome cuidado para evitar bolhas.
- Vamos lâminas glicerina geléia sentar por 5 min a RT para definir.
- Coloque cada slide glicerina geléia em 60 mm x 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Coloque a 4 ° CO / N. Opcionalmente, loja glicerina lâminas de geléia para até 5 dias a 4 ° C.
4. Montagem ovo Chambers
- Usando amostras do passo 2.5, pipeta várias gotas 3 ul de câmaras de ovos em 70% de glicerol através de uma glicerina geléia slide. Continue pipetagem 3 gotas ul até que todas as câmaras de ovos estão neste slide. Certifique-se de cada gota contém, pelo menos, dez câmaras de ovo. Enquanto isso, aqueça um tubo de cultura de glicerina geléia em um banho de água a 55 ° C.
- Coloque o slide glicerina geléia com câmaras de ovo sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma gota de câmaras de ovo está no campo de visão (figura 1B).
- Usando uma agulha de calibre 30 como uma colher, pegar a câmara fase de ovo desejado. Quando necessárias, as câmaras de ovo desejados separados de uma cadeia ovaríolo utilizando a agulha, como uma faca.
- Para evitar detritos que podem interferir com a imagem, a câmara de transferência de ovo para a segunda lâmina de glicerina geleia, com o anterior virada para a esquerda (Figura 1E -1). Repetir até que não haja, pelo menos, sete câmaras de ovo alinhados em uma coluna (Figura 1C).
- Formar novas colunas de sete até que todas as câmaras de ovos desejados são transferidos para o segundo slide glicerina geléia.
- Rasgue um pequeno pedaço de tecido e torção. Use-o para absorver o excesso de PBS-glicerol das câmaras de ovo levemente tocando cada um. Tome cuidado para não remover câmaras de ovo.
- Corte oponta de uma pipeta de ponta de 200 ul filtrada. Utilize este para transferir 150 mL de glicerina geléia para cobrir todas as colunas de câmaras de ovo.
NOTA: A quantidade de geléia glicerina necessário para cobrir as colunas é baseado em etapas da câmara de ovos e número de colunas. Este valor pode ser ajustado. - Deixe câmaras de ovos montados sentar-se durante 5 min à temperatura ambiente até que a camada superior de glicerina geleia é completamente solidificado (Figura 1D).
- Colocar a lâmina de câmaras de ovos montados em 60 mm × 15 milímetros placa de petri e cubra com filme plástico. Armazenar a 4 ° CO / N para permitir que as camadas glicerina geléia para solidificar juntos (lugar no escuro, se há uma preocupação com a fotodegradação).
5. Preparação de ovo Chambers for Imaging
- Coloque slides das câmaras de ovos montados sob um microscópio de dissecção. Ajustar ampliação de modo a que apenas uma coluna de câmaras de ovo está no campo de visão.
- Usando um ângulo de 45 ° bisturi miniatura, corte um straight linha ao longo do lado direito da primeira coluna de câmaras de ovo (próxima da face posterior das câmaras de ovo). (Figura 1D-E)
- Em seguida, cortado por cima da primeira câmara de ovo no topo e por baixo da última câmara de ovo na coluna. Neste ponto, a coluna de câmaras de ovo deve ser cortada em três lados.
- Usando um microlanceta, corte ao longo do lado esquerdo da coluna, tão perto quanto possível do lado anterior das câmaras de ovo (Figura 1E) -3.
- Pipetar 100 mL de frio 1X PBT sobre a coluna corte.
- Use uma espátula rodada gumes para remover o excesso de geléia glicerina em torno de três lados da coluna corte de câmaras de ovo e descartar, deixando o resto no slide.
- Insira a espátula no corte feito na face anterior das câmaras de ovos e separar a coluna do bloco de glicerina geléia primária.
- Preparar amostras em posição invertida (5.8.1) ou vertical (5.8.2) de microscopia para qualquer um.
- Para microscópio invertido: t Transferênciaele coluna de câmaras de ovos para uma lamela com face anterior das câmaras de ovo virado para baixo. Repita os passos 5,2-5,8 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidos e montados. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovos para evitar que sequem. Câmaras de ovos imagem diretamente sobre lamela.
- Para microscópio vertical: Transferir a coluna de câmaras de ovo para uma lâmina de microscópio com o lado anterior para cima. Repita os passos 5,2-5,9 até que todas as colunas de glicerina geleia foram removidas e montadas em lâminas de microscópio. Adicione um par de gotas de 50% PBS-glicerol para cada bloco de câmaras de ovo e blocos de cobertura com uma lamela ½ # 1.
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Resultados
O método de imagem na vertical nos permitiu ver diretamente a organização das células do epitélio folicular anterior na fase 8. Um marcador geral para o destino células do folículo, o Absent Eyes (EJA) de proteínas, bem como o marcador de DNA nuclear DAPI, mostrou ainda expressão através deste campo de células, e demonstrou que todas as células podem ser vistos com intensidades de coloração semelhante (Figura 2B "). As proteínas reguladas, em resposta à UPD citoquina, no entanto, mostraram padrões ...
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Discussão
Aqui nós descrevemos um método para montar e pequena imagem, o desenvolvimento de câmaras de ovos de uma perspectiva end-on. Técnicas comuns para câmaras de ovos de imagem são otimizados para vistas laterais e permitir principalmente a visualização precisa das células do folículo medio-lateral quando coradas com anticorpos fluorescentes. O uso de Z-stacks ou 3-D reconstruções auxilia na visualização de vários planos focais, mas ainda é insuficiente para a resolução de sub-celular dos pólos de câmaras de ovos elípticos <...
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Divulgações
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a assistência de membros da comunidade de moscas, particularmente da Dra. Denise Montell, Dra. Lynn Cooley e Dra. Pernille Rorth, para reagentes. Agradecemos à Flybase, ao Bloomington Drosophila Stock Center e ao Developmental Studies Hybridoma Bank pelas informações e pelo fornecimento de estoques de moscas e anticorpos, respectivamente. O LM é apoiado pelo Departamento de Educação Grant, Graduate Assistance in the Areas of National Need (GAANN) bolsa de treinamento (P200A120017) e por uma Iniciativa NIGMS para Maximizar o Desenvolvimento do Aluno Grant (2 R25-GM55036). Uma parte do trabalho de microscopia foi apoiada pela concessão de ressonância magnética da NSF DBI-0722569 e pelo Keith R. Porter Core Imaging Facility. A pesquisa foi apoiada em parte por um NSF CAREER Award (1054422) e um Basil O'Connor Starter Scholar Award da March of Dimes, ambos concedidos ao MSG.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Tampão fosfato de potássio (KPO4 Buffer) | Adicione 3,1 g de NaH2PO4• H2O e 10,9 g de Na2HPO4 (anidro) a H2O destilado para perfazer um volume de 1 L. O pH da solução final será 7,4. Este buffer pode ser armazenado por até 1 mês a 4 graus C. | ||
| Solução aquosa de paraformaldeído a 16%, grau EM | Ciências de Microscopia Eletrônica | 15710 | livre de metanol para preservar a fluorescência GFP |
| Agulha de 30G x 1/2 polegada | VWR | BD305106 | Levedura Seca Ativa de Bisel Regular |
| Genesee Scientific | 62-103 | Para engordar moscas fêmeas | |
| Albumina de soro | bovino PAA-cell culture company | A15-701 | Usado no tampão de lavagem NP40 |
| Fórceps Dumont #5 Fine | Science Tools | 11295-10 | Liga Dumostar, ponta biologie; pontas afiadas são essenciais para a dissecção |
| do ovárioDAPI (4′,6-Diamidino-2-fenilindol dicloridrato) | Sigma Aldrich | D9542 | 5 mg/ml solução estoque |
| Soro Fetal Bovino (FBS) | Life Technologies | 16140-071 | Adicionado ao meio de dissecção suplementar (10%) |
| Tubo de cultura de vidro | VWR | 47729-576 | 14 ml |
| Lâminas de Depressão de Vidro | VWR | 470019-020 | 1,2 mm de Espessura, |
| Geleia de Glicerina de Cavidade Dupla | Electron Microsocpy Sciences | 17998-10 | Mídia de montagem |
| Glicerol | IBI Scientific | IB15760 | 70% em PBS |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I3021-500ML( | intercambiável para Nonidet P-40) Usado em Tampão de Lavagem NP40 |
| Estereoscópio Fluorescente Leica | Leica Microsystems | ||
| Microscópio Confocal Leica SP5 | Leica Microsystems | 40x/0.55NA objetiva seca | |
| Micro espátula | VWR | 82027-518 Lâmina de | em aço inoxidável |
| VWR | 16004-368 | 75x25x1 mm | |
| NP40 Tampão | 50 mM TRIS-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Ipegal, 1 mg/ml BSA e 0,02% azida sódica | ||
| Penicilina-estreptomicina-Glutamina | Life Technologies | 10378-016 | Adicionado ao meio de dissecção suplementar (0,6X) |
| Petrídiche- Poliesterina, estéril | VWR | 82050-548 | 60 W x 15 H mm |
| Tampão de Fosfato Salino | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | 10 pacotes de fosfato |
| de potássio dibásico | em pó Sigma Aldrich | P3786-500G | Usado em 0.1 M KPO4 Buffer |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma Aldrich | P9791-500G | Usado em 0.1 M KPO4 Buffer |
| [cabeçalho] | |||
| Schneider' s Insect Medium | Life Technologies | 11720018 | Com L-glutamina e bicarbonato de sódio |
| Azida de sódio | Sigma Aldrich | S2002-25G | Usado na coloração de anticorpos fluorescentes |
| Cloreto de sódio | Sigma Aldrich | S3014-500G | Usado no tampão de lavagem NP40 |
| TRIS-HCl | IBI Scientific | IB70144 | 1 M TRIS-HCl, pH 7,4 |
| Volocidade Imagem 3D Software de análise | PerkinElmer | para processamento de pilhas Z confocais |
Referências
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Reimpressões e permissões
