Um método simples e barato para a determinação da sensibilidade Fria e Adaptação no Mice

Summary

O Ensaio Plantar a Frio (CPA) mede a capacidade de resposta ao frio entre 30 °C e 5 °C e também pode medir a adaptação ao frio. Este protocolo descreve como usar o CPA para medir a hipersensibilidade ao frio, analgesia e adaptação em camundongos.

Abstract

A hipersensibilidade ao frio é um problema clínico grave, afetando um amplo subconjunto de pacientes e causando reduções significativas na qualidade de vida. O ensaio plantar frio permite a avaliação objetiva e barata da sensibilidade ao frio em camundongos e pode quantificar tanto a analgesia quanto a hipersensibilidade. Os ratos são aclimatados em uma placa de vidro e uma pelota de gelo seco comprimido é mantida contra a superfície de vidro sob a pata traseira. A latência para retirada do vidro de resfriamento é usada como uma medida de sensibilidade ao frio.

A sensação de frio também é importante para a sobrevivência em regiões com mudanças sazonais de temperatura e, para manter a sensibilidade, os animais devem ser capazes de ajustar seus limiares de resposta térmica para corresponder à temperatura ambiente. O Cold Plantar Assay (CPA) também permite o estudo da adaptação às mudanças na temperatura ambiente, testando a sensibilidade ao frio de camundongos em temperaturas que variam de 30 °C a 5 °C. Os ratos são aclimatados conforme descrito acima, mas a placa de vidro é resfriada até a temperatura inicial desejada usando caixas de alumínio (ou pacotes de papel alumínio) cheias de água quente, gelo úmido ou gelo seco. A temperatura da placa é medida no centro usando uma sonda de termopar tipo T de filamento. Quando a placa atingir a temperatura inicial desejada, os animais são ensaiados conforme descrito acima.

Este ensaio permite testar camundongos em temperaturas que variam de inócuas a nocivas. O CPA produz respostas comportamentais inequívocas e consistentes em camundongos não feridos e pode ser usado para quantificar tanto a hipersensibilidade quanto a analgesia. Este protocolo descreve como usar o CPA para medir a hipersensibilidade ao frio, analgesia e adaptação em camundongos.

Introduction

Medir a capacidade de resposta fria em roedores é importante para melhorar a compreensão dos potenciais mecanismos de sensibilidade frio em seres humanos, tanto em condições normais e patológicas. The Cold Plantar Assay (CPA), originalmente desenvolvido há vários anos ^um, é projetado para gerar, respostas inequívocas murino comportamentais reprodutíveis a um estímulo frio entregue na RT. Mais recentes melhorias deste ensaio permitiu a medida reprodutível de sensibilidade frio a uma vasta gama de temperaturas ^{de 2.} Ambas as versões também são projetados para ser relativamente alto rendimento, e barato de usar.

Uma grande quantidade de progresso tem sido feito na compreensão dos mecanismos de sensibilidade frio usando outros métodos comportamentais. Um método é o teste de evaporação de acetona, enxugando ou que envolve a pulverização acetona na pata do rato e medindo a quantidade de tempo que o rato gasta sacudindo a ^3,4 pata. Infelizmente,as respostas a acetona evaporação são confundidos pela sensação molhada e o cheiro da acetona. Além disso, o estímulo frio que é aplicado no teste de acetona evaporação pode variar de acordo com a quantidade de acetona aplicada, e é difícil de quantificar. Finalmente, os ratinhos lesionados têm respostas mínimas para acetona a linha de base, o que torna impossível de medir a analgesia na ausência de hipersensibilidade com este método.

Outro ensaio clássico para respostas frias é o ensaio da ponta da cauda, ​​onde a latência para retirada é medida após a cauda está imerso em ^5,6 água fria. Enquanto as respostas comportamentais neste ensaio são inequívocos e o ensaio mede as respostas a uma temperatura específica, os animais devem ser imobilizados durante os testes, o que pode alterar a capacidade de resposta fria através bem descritos mecanismos analgésicos estresse induzido por ^7.

Outra ferramenta utilizada é o teste de placa fria, que mede o comportamentorespostas dos ratos depois de serem colocados sobre uma placa arrefecida com Peltier ^8-10. Enquanto esta ferramenta fornece informações sobre as respostas de animais em temperaturas específicas, ele também tem sido usado de forma inconsistente; diferentes grupos foram medidos diferentes tipos de resposta incluindo o número de saltos ^8,11, a latência a primeira resposta ^{8,11- 13,} e o número de pata elevadores ^11,13,14 com resultados muito diferentes. O teste de placa de frio é também relativamente baixa taxa de transferência uma vez que apenas um animal pode ser testada ao mesmo tempo, e necessitam de um dispositivo de Peltier caros e frágeis.

O teste de preferência temperatura 2 placa é um derivado normalmente usado para o teste de placa fria, que mede a quantidade relativa de tempo em que os animais passam em 2 placas conectadas de diferentes temperaturas ^{9,15- 17.} Outro ensaio utilizado é semelhante ao ensaio de gradiente térmico, em que a quantidade de tempo que os ratos passam em diferentes zonas de temperaturavariando entre 5 ° C e 45 ° C em uma placa de metal é medida a longo ^16. Enquanto estes ensaios permitir a comparação das temperaturas, não está claro se o comportamento representa aversão temperatura ou a preferência de temperatura.

Finalmente, o ensaio de placa fria dinâmica tem sido usado para medir como ratos responder às mudanças nas temperaturas ambiente ^18. Este método envolve a colocação de ratos em um dispositivo Peltier RT e aumentando-a para 1 ° C enquanto mede o quanto os ratos saltar ou lamber as patas em diferentes temperaturas de placas. Enquanto isto testa como ratos se adaptar a um ambiente de arrefecimento, ele não fornece uma maneira de testar como os ratos responder a um estímulo frio na definição de uma temperatura ambiente mais fresco. Além disso, requer equipamentos caros para realizar e não fornece uma maneira de se aclimatar ratos para o equipamento de teste antes de medir a sua sensibilidade frio.

Para complementar estes ensaios, o CPA testa a ACCLIMAted respostas a um estímulo frio bem definida em uma variedade de faixas de temperatura, ou durante o processo de adaptação a temperaturas ambientes frios. Pode testar-se a 14 ratinhos de cada vez com o nosso aparelho actual, com o potencial de ser barata aumentada a escala para ensaios de elevado rendimento.

Protocol

Todos os protocolos de mouse estavam de acordo com os institutos nacionais de saúde e orientações foram aprovadas pelo Comitê de animal Estudos da Escola de Medicina da Universidade de Washington (St. Louis, MO).

1. Preparando a Placa e Recintos Testing

1. Limpar a superfície do vidro.
2. Segurar a sonda termopar filamento do tipo T à superfície no meio da placa de vidro com fita adesiva de laboratório.
3. Colocar o animal independente sobre a placa de vidro em uma única linha ao longo do meio da placa.
4. Passe a sonda termopar através do cerco animal centro e ligar para o registrador de dados. Vire o registrador de dados enquanto a desativação do recurso de auto-desligamento, e anexar o registrador de dados para o computador com o cabo fornecido.
   1. Se a gravação da temperatura da placa durante o experimento, abra o software registrador de dados para começar a gravar temperaturas placa.
   2. Se necessário, ajustar o software de recabo a temperatura da placa de uma vez a cada segundo.
   3. Começar a gravar temperaturas usando o software fornecido com o registrador de dados térmico.
5. Separe o recinto com pastilhas pretas para evitar a interação visual entre camundongos.
6. Posição espelhos por baixo do vidro de modo que a parte de baixo das caixas é visível a partir de uma posição sentada confortável.

2. O aquecimento / resfriamento da placa de vidro

1. Preencha caixas de alumínio com água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco e posicioná-los de forma adequada sobre a placa de vidro (pacotes de folhas de alumínio preenchidos com gelo seco também pode ser usado para resfriar o vidro; Figura 1) ^2.
   1. Para os testes, a 30 ° C, posicione as caixas de alumínio de aproximadamente 0,25 '' longe dos recintos de animais (Figura 2B) ^2.
      1. Definir um circulador de água aquecida em ambos os lados da placa de vidro. Definir o circulador para 45 - 60 ° C, e nósenviar um e-lo para preencher as caixas de alumínio com um fluxo constante de água quente (Figura 1C) ^2.
      2. Posicionar os circuladores de tal modo que a água quente a partir das caixas de alumínio escoa directamente de volta para dentro do reservatório da bomba de circulação em cada um dos lados (Figura 1C) ^2.
   2. Para os testes à temperatura ambiente, deixar as caixas vazias (Figura 2) ^2.
   3. Para os testes a 17 ° C, posicione as caixas de aproximadamente 0,25 '' longe dos recintos de animais de cada lado e encher com gelo molhado (Figura 2) ^2.
   4. Para os testes a 12 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 1,25 '' distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) ^2.
   5. Para os testes, a 5 ° C, posicionar as caixas de aproximadamente 0,25 '' distância das caixas de cada lado e encher com gelo seco (Figura 2) ^2.
      1. Quando arrefecer o copo com gelo seco, verifique se não há ventilação suficiente para evitar o acúmulo de CO ₂ no quarto.
2. Espera para o vidro para atingir a gama de temperatura desejada.
3. Adicionar os ratos para os compartimentos da placa.
   NOTA: Um gerador de ruído branco podem ser utilizados para diminuir as perturbações de ruído.
4. Aguarde até que os ratos para se aclimatar.
   NOTA: Em nosso serviço isso leva aproximadamente 2,5 horas, mas isso pode variar significativamente com base nas condições de manipulação e de alojamento dos animais.
5. Manter o vidro no intervalo de temperatura desejado, garantindo que as caixas são mantidas cheias de água aquecida, gelo molhado, ou gelo seco.
   NOTA: Com o nosso aparelho as caixas precisam ser recarregados com gelo aproximadamente a cada 90 min.
   NOTA: Para a 17 ° C condição, é útil para esvaziar a maior parte da água das caixas de alumínio através dos furos de drenagem antes de enchê-lo com gelo. Isto irá estabilizar a temperatura melhor, e prevento estouro
   NOTA: A quantidade exacta do gelo seco irá variar sazonal, mas, em geral, mantendo as caixas de mais do que ¼ cheio ao longo de todo o comprimento da caixa, será manter a temperatura constante.

3. Teste o Mice em temperaturas fixas

1. Do lado de fora da sala de comportamento, encher um balde de gelo sobre meio cheio de gelo seco.
2. Usando um martelo ou malho, esmagar o gelo seco em um pó fino.
   NOTA: O excesso de balde irá tornar mais difícil para esmagar completamente o gelo seco em pó.
3. Usando uma lâmina de navalha ou tesoura, corte a parte de cima de uma seringa de 3 ml.
4. Usando uma agulha de 21 G, picar 3 furos em lados opostos da seringa (total de 6 furos).
   NOTA: Estes furos vai diminuir a pressão gerada por sublimação, enquanto comprime o gelo seco. A seringa de corte pode ser reutilizada para vários experimentos.
5. Pegue na seringa, o pó de gelo seco, e um cronômetro de mão na sala de comportamento.
6. Encha a câmara de seringa meio cheio de pó de gelo seco. Segurar a extremidade cortada da seringa de encontro a um objecto chato, e firmemente comprimir o pó usando o êmbolo. Seja cuidadoso; o êmbolo plástico pode entortar ou quebrar com a pressão. Se isso acontecer, substitua o êmbolo de uma seringa nova.
7. Estender a ponta do comprimido sedimento gelo seco além da extremidade da seringa.
8. Ratos de teste que são completamente em repouso.
   1. A 30 ° C, 23 ° C e 17 ° C, os ratinhos de teste, que têm todas as 4 patas sobre o vidro e não se deslocam, mas não totalmente ¹⁹ adormecido.
   2. A 12 ° C e 5 ° C, os ratos de teste que são em 2 patas ou 4 patas e não em movimento ou de salto.
9. Usando os espelhos para segmentação, gentil mas firmemente alisar o resplendor pellet contra a superfície de vidro debaixo da pata traseira do mouse (Figura 1A) ^2. Comece a mão-timer.
10. Parar o temporizador e remover o sedimento quando o rato afasta-se do vidro arrefecida.
    NOTA: O movimento de retrocesso pode ser vertical ou horizontal.
    1. Se o mouse se move muito rapidamente a pata e, em seguida, retorna para a superfície de refrigeração, continuar a cronometragem e estimulando até que o rato faz um movimento permanente de distância.
       NOTA: O nosso laboratório usa um tempo máximo de 20 segundos de estímulo para os ratos, na maioria dos casos.
11. Repita este procedimento até que o teste pelo menos três valores em cada pata de cada animal são coletados. Experimentações separadas testando as patas opostos no mesmo rato por, pelo menos, 7 min, e ensaios consecutivos separados em qualquer única pata por, pelo menos, 15 min.
12. Se for necessário, utilizam diferentes espessuras de vidro para gerar diferentes taxas de arrefecimento (Figura 3) ^1.
    NOTA: A taxa de arrefecimento está inversamente correlacionada com a espessura do vidro.

4. Testando o Ratos Durante Fria Adaptação

NOTA: Este é um protocolo alternativo que permite testar como o plat de vidroe esfria, ao invés de uma vez que a placa se estabilizou e os ratos estão totalmente adaptados ao ambiente frio.

1. Siga as instruções listadas na Seção 1 para configurar o aparelho.
2. Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas de base na RT (Figura 7A) ^2.
3. Pré-resfriar as caixas de alumínio com gelo seco.
4. Uma vez que as latências de retirada da linha de base foram medidos, posicione as caixas pr�arrefecida na placa aproximadamente 1,25 '' longe dos gabinetes de ambos os lados (Figura 7A, seta rotulado como "gelo seco adicionado") ^2.
5. Siga as instruções indicadas no parágrafo 3 a tomar medidas como a placa de vidro esfria, tomando medidas o mais rápido possível.

Results

As respostas comportamentais induzidos de ratinhos a partir de 30 ° C, 23 ° C, 17 ° C, e 12 ° C são altamente reprodutível (Figura 4A) ^20. A fim de medir o estímulo frio sendo gerado sob a pata traseira, os ratos foram anestesiados com uma mistura de cetamina / xilazina / acepromazina e cocktail suas patas foram assegurados no vidro na parte superior de um termopar de tipo T filamento (Figura 4B) ^20. O vidro foi arrefecida ou aquecida para a faixa de teste desejada...

Discussion

O CPA pode ser usado para avaliar a sensibilidade ao frio e a adaptação ao frio em camundongos. Ele fornece uma maneira acessível e eficiente de medir as respostas ao frio em animais não contidos e aclimatados em uma ampla variedade de faixas de temperatura. Ele também fornece uma resposta comportamental inequívoca com uma variável de saída facilmente quantificada e analisada. Já foi usado para avaliar alterações na sensibilidade ao frio induzidas por inflamação¹, lesão neuropática¹, analgésicos...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonda termopar tipo T	Physitemp	IT-24p	Usado para medir a temperatura da superfície do vidro (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)Placa de
vidro	Empresa local de vidro (em St. Louis, Stemmerich Inc)		Usamos vidro pirex (flutuador de borosilicato). Nosso laboratório geralmente usa 1/4'', mas 3/16'' e 1/8'' também são úteis
Registrador de dados térmicos	Extech	EA15	Thermologger para acompanhar a temperatura do vidro (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3 ml Seringa	BD	309657	A parte superior é cortada e o gelo seco é comprimido na seringa para gerar uma sonda fria
Computador	Se estiver usando o registrador Extech, qualquer caixa de alumínio funcionará
de oficina			têm 3' de comprimento, 4,5'' de largura e 3'' de altura com uma tampa selada.  Há um furo de 1/2 '' perfurado em um lado curto de cada caixa, perto do fundo. Esses orifícios são preenchidos com torneiras de borracha quando as caixas são preenchidas com gelo úmido ou água quente.
Circulador de água aquecida	VWR		Qualquer modelo de circulador de água com bomba funcionará
Agulha de 21 G	BD	305165	O tamanho exato da agulha não é importante
Temporizador			Qualquer temporizador manual funcionará
Espelho			Qualquer espelho plano funcionará