Este manuscrito descreve o uso de tecnologia de ponta fornecida por microarrays de DNA. Os microarrays fornecem uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias incorridas sob uma condição específica. Além disso, destacamos a facilidade com que grandes quantidades de dados podem ser analisadas usando pacotes de software desenvolvidos internamente convenientes.
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Artigo de método
A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em
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Resumo
Resumo
A expressão gênica e de sua regulamentação são muito importantes para entender o comportamento das células sob condições diferentes. Várias técnicas são usadas hoje em dia para estudar a expressão do gene, mas a maioria são limitados em termos de proporcionar uma visão global da expressão de todo o transcriptoma. Microarranjos de DNA oferecem uma tecnologia de pesquisa rápida e econômica, o que dá uma visão completa da expressão gênica global e têm um vasto número de aplicações, incluindo a identificação de novos genes e fator de transcrição locais, caracterização da atividade transcricional das células e também de ligação ajudar na análise de milhares de genes (numa única experiência). No presente estudo, as condições para a análise do transcriptoma bacteriana desde a colheita de células para análise de DNA microarray foram otimizados. Levando-se em conta o tempo, custos e precisão dos experimentos, esta plataforma de tecnologia revela-se muito útil e universalmente applicabale para estudar transcripto bacterianames. Aqui, vamos realizar a análise de DNA microarray com Streptococcus pneumoniae como um caso de estudo comparando as respostas de transcrição de S. pneumoniae foram cultivados na presença de concentrações variáveis de L-serina no meio. O ARN total foi isolado utilizando um método Macaloid usando um kit de isolamento de ARN e a qualidade do ARN foi verificada usando um kit de controlo de qualidade de ARN. O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa e as amostras de ADNc foram marcados utilizando um dos dois corantes fluorescentes reactivos a aminas. Caseiros lâminas de microarranjos de DNA foram utilizados para a hibridização das amostras de cDNA marcadas e dados de microarranjos foram analisados usando um quadro de pré-processamento de dados de cDNA microarray (Microprep). Finalmente, Cyber-T foi utilizado para analisar os dados gerados usando Microprep para a identificação de genes expressos diferencialmente estatisticamente significativas. Pacotes de software Além disso, em casa construídas (pimenta, FIVA, divulgar, PROCURADOR, Genome2D) foram utilizados para analisardados.
Introdução
O estudo de todo o conjunto de mRNA abundância (transcriptoma) codificadas pelo genoma de um organismo unicelular ou uma célula eucariótica em um momento específico ou sob uma condição específica, incluindo a superexpressão de genes ou knock-out, é chamado transcriptomics. Transcriptomics nos permite observar em que medida os genes são expressos sob uma condição particular em um ponto X tempo e nos dá informações sobre como fortemente os genes são expressas em relação a uma referência.
Uma micromatriz é uma matriz bidimensional em um substrato sólido (geralmente numa lâmina de vidro ou de silício de película fina de células) que podem ser....
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Protocolo
1. Preparação de Mídia e Cultura de Células
- Crescer S. pneumoniae D39 estirpe selvagem 21 como descrito anteriormente 11. Inocular células armazenadas a -80 ° C em glicerol a 10% (com razão de 1/100 em tubos de 50 ml estéreis) em 50 ml de meio definido quimicamente (CDM), com um pH final de 6,4 15, mas omitir L-serina a partir do aminoácido mistura.
Nota: Foram utilizados dois diferentes MDL; uma contendo uma concentração mínima de L-serina (150 uM) e o outro contendo uma concentração máxima de L-serina (10 mM). Esta concentração mínima é, basicamente, a concentração de L-serina em plasma de sangu....
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Resultados
ARN, o isolamento e análise de cDNA
L-serina é um dos aminoácidos essenciais e a sua concentração no plasma sanguíneo humano varia de 60-150 uM em crianças e adultos. O seu papel na biossíntese de purinas e pirimidinas destaca a sua importância no metabolismo e é um precursor de várias aminoácidos (glicina, cisteína e triptofano). Para estudar o impacto da L-serina em todo o transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe de tipo selvagem, a análise de microarray da esti.......
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Discussão
Nós descrevemos um protocolo de fácil utilização que pode ser aplicado para realizar a análise de toda transcriptoma de bactérias. O ponto-chave sobre esta técnica particular é que a condição sob a qual as células são colhidas irão variar. Após a colheita de células e o isolamento de ARN, esta técnica torna-se igual para todos os tipos de amostras bacterianas e segue passos exactamente idênticas e, por conseguinte, pode ser aplicado a qualquer tipo de cultura bacteriana. O protocolo é muito simples e conveniente e começ.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Agradecemos a Anne de Jong e Siger Holsappel para obter ajuda com o DNA microarrays produção slide. O apoio da Anne de Jong para análise bioinformática também é apreciado. Agradecemos também a Jelle Slager para a revisão do papel. Muhammad Afzal e Irfan Manzoor são suportados pela Universidade GC, Faisalabad, Paquistão sob o programa de desenvolvimento do corpo docente da HEC Paquistão.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Ácido fenol | SigmaAldrich | P4682 | |
| Kit de isolamento de RNA Roche | Applied Science | 11828665001 | |
| Contas de | 105015 | ||
| Chloroform | Boom | 92013505.1000. | |
| IAA | 106630 | ||
| Nanodrop | Nanodrop ND-100 | ||
| Agilent BioAnalyser | Agilent | G2940CA | |
| Superscript III | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| AA-dUTP | Life technologies Invitrogen | AM8439 | |
| DDT | Life technologies Invitrogen | ||
| Primeiro buffer de fio | Life technologies Invitrogen | 18080044 | |
| NaOH | SigmaAldrich | S8045-1KG | |
| HEPES | SigmaAldrich | H4034-500G | |
| DyLight-550 | Thermoscientiffic | 62262 | |
| DyLight-650 | Thermoscientiffic | 62265 | |
| SHY Buffer | Cooler Speedvac SigmaAldrich | H7033-125ML | |
| Concentrador Eppendorf | RUGNE3140 | Speedvac mais | |
| Forno de Hibridização | Grant Boekel | Iso-20 | |
| Lifter-slips | Erie Scientific | 25x60I-M-5439 | |
| Wipe | KIMTECH | ||
| SDS | SigmaAldrich | L3771-100g | |
| SSC | SigmaAldrich | W302600-1KG-K | |
| Genpix autoloader 4200A1 | MSD tecnologias | Scanner | |
| microarray bicarbonato de sódio | SigmaAldrich | 104766 |
Referências
- Kayala, M. A., Baldi, P. Cyber-T web server: differential analysis of high-throughput data. Nucleic Acids Res. 40, W553-W559 (2012).
- Chang, T. W. Binding of cells to matrixes of distinct antibodies coated on solid surface. J. Immunol. Methods.
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Reimpressões e permissões
