A Pipeline rápido e confiável para estudo de Análise de Caso bacteriana transcriptoma: Regulamento Gene Serina-dependente em Streptococcus pneumoniae

Resumo

Este manuscrito descreve o uso de tecnologia de ponta fornecida por microarrays de DNA. Os microarrays fornecem uma visão geral das alterações transcriptômicas em bactérias incorridas sob uma condição específica. Além disso, destacamos a facilidade com que grandes quantidades de dados podem ser analisadas usando pacotes de software desenvolvidos internamente convenientes.

Resumo

A expressão gênica e de sua regulamentação são muito importantes para entender o comportamento das células sob condições diferentes. Várias técnicas são usadas hoje em dia para estudar a expressão do gene, mas a maioria são limitados em termos de proporcionar uma visão global da expressão de todo o transcriptoma. Microarranjos de DNA oferecem uma tecnologia de pesquisa rápida e econômica, o que dá uma visão completa da expressão gênica global e têm um vasto número de aplicações, incluindo a identificação de novos genes e fator de transcrição locais, caracterização da atividade transcricional das células e também de ligação ajudar na análise de milhares de genes (numa única experiência). No presente estudo, as condições para a análise do transcriptoma bacteriana desde a colheita de células para análise de DNA microarray foram otimizados. Levando-se em conta o tempo, custos e precisão dos experimentos, esta plataforma de tecnologia revela-se muito útil e universalmente applicabale para estudar transcripto bacterianames. Aqui, vamos realizar a análise de DNA microarray com Streptococcus pneumoniae como um caso de estudo comparando as respostas de transcrição de S. pneumoniae foram cultivados na presença de concentrações variáveis ​​de L-serina no meio. O ARN total foi isolado utilizando um método Macaloid usando um kit de isolamento de ARN e a qualidade do ARN foi verificada usando um kit de controlo de qualidade de ARN. O ADNc foi preparado utilizando transcriptase reversa e as amostras de ADNc foram marcados utilizando um dos dois corantes fluorescentes reactivos a aminas. Caseiros lâminas de microarranjos de DNA foram utilizados para a hibridização das amostras de cDNA marcadas e dados de microarranjos foram analisados ​​usando um quadro de pré-processamento de dados de cDNA microarray (Microprep). Finalmente, Cyber-T foi utilizado para analisar os dados gerados usando Microprep para a identificação de genes expressos diferencialmente estatisticamente significativas. Pacotes de software Além disso, em casa construídas (pimenta, FIVA, divulgar, PROCURADOR, Genome2D) foram utilizados para analisardados.

Introdução

O estudo de todo o conjunto de mRNA abundância (transcriptoma) codificadas pelo genoma de um organismo unicelular ou uma célula eucariótica em um momento específico ou sob uma condição específica, incluindo a superexpressão de genes ou knock-out, é chamado transcriptomics. Transcriptomics nos permite observar em que medida os genes são expressos sob uma condição particular em um ponto X tempo e nos dá informações sobre como fortemente os genes são expressas em relação a uma referência.

Uma micromatriz é uma matriz bidimensional em um substrato sólido (geralmente numa lâmina de vidro ou de silício de película fina de células) que podem ser utilizados para ensaiar grandes quantidades de material biológico utilizando rastreio de alto rendimento, e miniaturizado, de processamento e paralelo multiplexado e detecção métodos. Microarrays vêm em vários tipos, inclusive de DNA microarrays, microarrays de proteína, microarrays peptídicos, microarrays de tecidos, microarrays de anticorpos, microarrays celulares e outros. A DNA microarray ébasicamente, um conjunto de manchas de DNA microscópicos fixo a uma superfície sólida, geralmente de vidro. Microarranjos de DNA são usadas para medir os níveis de expressão de um gene ou um conjunto de genes simultaneamente ao genótipo ou várias regiões de um genoma de ^2,3. Picomoles (10 ^-12 moles) de uma sonda estão presentes no interior de cada ponto de ADN que representa uma sequência de ADN específica, também conhecido como um repórter. As moléculas de mRNA rotulados das amostras são chamados «objectivos». Os fluoróforos são usados ​​para medir a hibridação sonda-alvo e detecção de alvos marcados com fluoróforo determina a abundância relativa de sequências de ácido nucleico no alvo. Um experimento de microarray pode realizar vários testes genéticos em paralelo, porque uma matriz pode conter dezenas de milhares de sondas. O layout de um experimento de microarray simples é mostrado na Figura 1. Recentemente, foi criada em nossas e de outros laboratórios que essas matrizes são reutilizáveis, o que torna esta técnica muito boa relação custo-effective.

Diferentes técnicas de isolamento e purificação de RNA foram desenvolvidos ao longo dos anos, incluindo C-TAB, SDS e métodos GT ^4-8. Além disso, vários kits comerciais também estão disponíveis. Para a expressão do gene de ARN de alta qualidade é muito importante. Portanto, os métodos de isolamento de ARN são modificados para obter uma quantidade máxima de ARN. Da mesma forma, os passos para a preparação de ADNc e rotulagem de cDNA são minimizados. Normalização de dados após rastreamento também é feito de forma eficiente, utilizando-casa construída em pacotes de software e ferramentas ^9.

O Streptococcus pneumoniae é um agente patogénico humano Gram-positiva que coloniza a nasofaringe e é a causa de infecções múltiplas, tais como pneumonia, sepsis e meningite otite média ^10. A bactéria pode utilizar uma ampla variedade de nutrientes necessários para o crescimento e sobrevivência ^11,12. Um número de estudos foram realizados sobre ometabolismo do nitrogênio pneumocócica e regulação enfatizando a importância de aminoácidos e seu papel na virulência ^13,14. Neste estudo, a resposta do transcriptoma de S. pneumoniae para alterar as concentrações de L-serina, um aminoácido presente em abundância no plasma sanguíneo humano, é descrito, utilizando microarrays de ADN. A resposta do transcriptoma de S. pneumoniae crescida em uma concentração mínima de L-serina (150 uM) foi comparada com a cultivada em uma concentração máxima (10 mM) de serina. Meio quimicamente definido (CDM ou meio mínimo) ¹⁵ foi utilizado para este estudo para controlar a concentração de serina. O foco deste estudo é fazer com que esta técnica user-friendly e de fornecer ferramentas diferentes para a normalização e análise de dados. Assim, foram desenvolvidas uma série de ferramentas para análise e interpretação dos dados. FIVA (Functional Information Viewer e Analyzer) fornece uma plataforma para processamento de informações contidas nos conjuntos de genes que têmpadrões de expressão gênica semelhantes e para a construção de perfis funcionais ^16. PROCURADOR é um outro pacote de software que facilita a identificação de funções putativas e anotações de genes ^17. Ao fazer uso de métodos de agrupamento, DIVULGAR fornece um algoritmo de detecção de local de ligação DNA. Cis -regulatory motivos de genes pode ser projetada usando este algoritmo ^18. Genome2D oferece uma plataforma baseada em Windows para visualização e análise de dados de transcriptoma, oferecendo diferentes gamas de cores para caracterizar as alterações nos níveis de expressão de genes em um mapa do genoma ^19. O webserver Pepper oferece, além do método de tudo-em-uma análise, uma caixa de ferramentas para mineração para regulons, promotores e ligação do factor de transcrição locais ^20. Anotação completa das regiões intergénicas num genoma bacteriano pode ser conseguida utilizando este pacote. Os biólogos podem se beneficiar muito de pimenta, pois oferece-lhes uma plataforma para a concepção de experiências de modo que a informação hipotética pode ser confirmada in vitro ^20. Estes pacotes de software de contribuir de forma significativa para a análise de microarray como a maior parte deles estão livremente disponíveis e fazer a normalização de dados e análise muito fiável.

Protocolo

1. Preparação de Mídia e Cultura de Células

1. Crescer S. pneumoniae D39 estirpe selvagem ²¹ como descrito anteriormente ^11. Inocular células armazenadas a -80 ^{° C} em glicerol a 10% (com razão de 1/100 em tubos de 50 ml estéreis) em 50 ml de meio definido quimicamente (CDM), com um pH final de 6,4 ^15, mas omitir L-serina a partir do aminoácido mistura.
   Nota: Foram utilizados dois diferentes MDL; uma contendo uma concentração mínima de L-serina (150 uM) e o outro contendo uma concentração máxima de L-serina (10 mM). Esta concentração mínima é, basicamente, a concentração de L-serina em plasma de sangue humano e o objectivo é comparar a expressão de genes de S. pneumoniae estirpe D39 sob estas duas condições.

2. Isolamento de ARN total

1. Materiais
   1. Use fenol ácido, grau de ARN para o isolamento do ARN total.
   2. Macaloid:
      1. Suspender 2 gramas demacaloid em 100 ml de TE e ferver durante 5 min. Arrefecer até à TA e sonicado até macaloid gels.Centrifuge a solução a 2000 × g durante 5 min à temperatura ambiente, ressuspender em 50 ml de TE, pH 8 e armazenar a 4 ° C.
   3. Soluções:
      1. Trate todas as soluções com pyrocarbonate etílico (DEPC). Adicionar 100 ul DEPC / 100 ml de solução, incubar O / N a 37 ° C e à autoclavagem durante 15 minutos.
2. Metodologia
   1. Cresça 50 ml de S. cultura de células pneumoniae D39 em tubos de 50 ml a 37 ^o C (sem agitação) até a fase mid-exponencial (OD ~ 0,3). Culturas de centrifugação a 4 ° C em 10.000 × g durante 2 min. Descarte de mídia e congelar imediatamente os sedimentos celulares em nitrogênio líquido.
   2. Pré-mistura de 300 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e 300 ul de fenol (fenol ácido, grau de ARN). Use 500 ul da fase orgânica no passo 2.2.3.
   3. Prepare a seguinte mistura de antecedência em tubos com tampa de rosca livre RNA: 00,5 g de esferas de vidro, 50 ul de SDS a 10%, 500 ul de fenol / clorofórmio: IAA (tal como preparado no passo 2.2.2), camada macaloid (150-175 uL, não exacto, uma vez que é muito viscoso). Ressuspender as peletes de células em 400 ul de TE (DEPC) e adicionar as células ressuspensas em tubos com tampa de rosca.
   4. Para quebrar as células, colocar os tubos com tampa de rosca em um batedor de talão para 2x 60 pulsos "(" homogeneizar ") com 1 min de intervalo no gelo. Centrifugar as amostras durante 10 min a 10.000 x g (4 ° C).
   5. Transferir a fase superior para um tubo fresco, adicionar 500 ul de clorofórmio: IAA (24: 1) e centrifuga-se durante 5 min a 10.000 x g (4 ° C).
   6. Transferir 500 mL da fase superior para tubos frescos, adicione 2 volumes (1 ml) de lise / tampão de ligação e misture por pipetagem cima e para baixo. Isolar o RNA total usando o kit de isolamento de ARN e a seguir o protocolo recomendado fabricante.

3. Limpeza de RNA

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Para remover a contaminação de ADN do ARN total, adiciona-se 100 ul mistura DNAseI (90 ul de tampão de ADNase e 10 ul DNAseI) e incubar durante 20-30 min a 15-25 ºC.

Lavar limpos RNA usando o kit de RNAse. Obter 50 ul de volume de eluído.

4. Análise de ARN

1. Determinar a concentração de ARN num espectrofotómetro. Determinar a qualidade do RNA usando um ensaio do seguinte modo (Figura 2).
   1. Dilui-se 1 ul de amostra com 50 ul de água com DEPC para obter uma concentração de 20-200 ng / mL.
   2. Use 1 ul da amostra de RNA diluída para verificar a qualidade do Bioanalyzer de acordo com as instruções do fabricante.
2. Nota: uma proporção de 23S: 16S de cerca de 2,0 é considerado bom unidade RNA ¹ A260 corresponde a 40 ug / ml.. A quantidade recomendada para a rotulagem é de 10-20 mg.

5. Preparação cDNA e Rotulagem

ntent "> NOTA: O protocolo foi seguido o seguinte para a preparação de cDNA e rotulagem.

1. Recozimento
   1. Execute reação recozimento em 300 tubos de PCR ul, mantendo a concentração de RNA total de 10-15 mg para slides caseiros ou 5 mg para slides feitos à empresa. Misturar ARN com 2 ul nonameros aleatórios (1,6 ug / ul) e adicionar água livre de nuclease, se necessário, para manter o volume final da mistura de emparelhamento a 18 ul.
   2. Manter a mistura de hibridização a 70 ° C durante 5 min. Depois disso, a mistura arrefecer até à temperatura ambiente durante 10 min (recozimento) e, se necessário, rodar para baixo as reacções para a parte inferior do tubo. Inserir os tubos de reacção em gelo durante pelo menos 1 min.
2. Transcrição Reversa
   1. Preparar a mistura de transcriptase reversa da seguinte forma: a mistura de recozimento 18 mL, adicionar 12 mix ul Master (que consiste em 6 mL de buffer 5x First Strand, 3 ul 0,1 M DDT, 1,2 ul 25x-dUTP AA mix / nucleotídeos e 1,8 ul reverter transcriptase (1 ml para slides feitos à empresa). Manter a mistura de reacção durante 2-16 horas a 42 ° C.

6. Degradação de ARNm e purificação de ADNc

1. Para degradar o ARNm a partir da mistura de reacção, adicionar 3 mL de NaOH 2,5 M e lugar a 37 ° C durante cerca de 15 min. Seguidamente, adicionar 15 mL de 2M HEPES ácido livre para neutralizar o NaOH.
2. Purifica-se a mistura de cDNA por PCR usando colunas de limpeza e seguir o protocolo do fabricante.

7. Medição da Concentração de cDNA

1. Medir as concentrações de cDNA em um espectrofotómetro. Para continuar com a rotulagem, verificar que a concentração de cDNA é de pelo menos 60 ng / mL (lâminas caseiros) ou 20 ng / mL (lâminas feitas pela empresa).

8. Rotulagem de cDNA com Amine-reativa Dye e Purificação

1. Use corante amino-reactivo para rotular o cDNA. Misturar diretamente o cDNA com uma alíquota (5 ul) deamina reactiva do corante.
2. Incubar a mistura à temperatura ambiente, no escuro, durante 60 a 90 min e proceder directamente a purificação de ADNc marcado com corante. Purifica-se cDNA marcado com corante por PCR usando colunas de limpeza e seguindo o protocolo do fabricante. Elui-se ADNc em 50 ul de tampão de eluição.

9. Medição de cDNA etiquetado

1. Utilizar um espectrofotómetro para medir a incorporação de corantes reactivos com aminas para o cDNA. Verificar que a concentração de corantes reactivos a amina é de pelo menos 0,5 pmol / mL num volume total de 50 ul.

10. homogeneização das amostras Labelled cDNA

1. Para lâminas caseiros, use todo o cDNA marcado para hibridação com diferença não superior a 30% na concentração de cDNA. Para lâminas feitas pela empresa, use cDNA com não mais do que diferença de 2 vezes na concentração de cDNA.
   Nota: normalmente, é necessária cerca de 300 ng de cDNA para slides feitos à empresa, o que é muito pouco em comparação com o reqquantidade de cDNA uired para slides caseiros.

11. A hibridação e de lavagem

1. Use os seguintes reagentes: água desmineralizada, etanol 99%, Tímido tampão (caseiro; com levedura RNA 40 mL). Prepare máximo de 1 ml de tímido.
2. Aparelhos e soluções de preparação
   1. Ligue concentradores de vácuo e aquecedor, pelo menos, 1 hora antes da secagem. Ligue forno de hibridização, com set point ajustado à temperatura de hibridização correta (por microarranjos de DNA de S. pneumoniae, use 45 ° C). Da mesma forma, o pré-aquecimento cassete hibridação e forno durante 30-60 minutos.
   2. Pré-aqueça tampão TÍMIDO a 68 C durante pelo menos 30 min.
3. A preparação da amostra (cADN)
   1. Combine quantidades iguais de cDNAs marcados (max 30% de diferença). Seca-se a amostra utilizando os concentradores de vácuo a temperatura elevada (aprox. 40 min) até que o volume é menor do que 7 ul.
4. Lifter-derrapante
   1. Use levantador deslizamentos limpas.Nota: ± 30 ul podem ser carregados sobre a lâmina.
   2. Limpe o levantador deslizamentos com sabão, a abundância de água da torneira e 100% de etanol. Nota: deslizamentos levantador sujos dar alta fundo.
   3. Air secar o levantador deslizamentos com pistola de ar para soprar as partículas de poeira. Coloque um elevador-derrapante limpo no slide com o revestimento de teflon branco nos lados virados para baixo.
5. A adição de tampão de hibridação (em cDNA marcado)
   1. Dissolve-se as amostras de corantes secos em 7 ul _{de H2O} e incubar a 94 ° C durante 2 min.
   2. Imediatamente, adicione 35 mL de tampão pré-aquecido TÍMIDO (68 ° C), misture delicadamente e girar a uma velocidade máxima de 1 min para se livrar de precipitados. Pré-aqueça a sonda a 68 C por aproximadamente 5 min até o carregamento.
6. Deslize-levantador slip-montagem e pré-aquecimento.
   1. Coloque o suporte de hibridação de slides em um calor-block a 50 ° C. Colocar as lâminas de microarranjos de DNA com o levantador-slip on titular hibridação de slides aquecida e preaquecer o slide com levantador-derrapante para um minuto. Executar os seguintes passos tão rapidamente quanto possível.
   2. Adicionar 40 ul da amostra alvo com a extremidade da lâmina. Permita que o fluido flua entre as superfícies de vidro por força de capilaridade. Execute todas pipetagem devagar e com cuidado.
   3. Mantenha as lâminas com levantador-slip horizontal em todos os momentos e mover-se lentamente para se certificar de que o levantador-slip não se mexeu.
   4. Tirar a cassete de hibridação pré-aquecido para fora do forno de hibridação e fechar a máquina. Papel-filtro lugar embebido com 3 ml 2x SSC (citrato de soro fisiológico normal) na cassete hibridação.
   5. Delicadamente, coloque o suporte de slides a hibridação com slides da cassete de hibridização. Feche a gaveta de hibridação e colocar no forno de hibridização novamente (por cerca de 16-18 horas).
7. Lavagem de slides
   1. Prepare frescos lavagens buffers I, II e III (750 ml por etapa de lavagem). Para 500 ml lavar-buffer I, usar 2 x SSC / SDS 0,5%. Para 500 ml de lavar-lustreer II, usar 1 x SSC / SDS a 0,25%. Para 500 ml de tampão de lavagem-III, usar 1 x SSC / SDS a 0,1% (opcional)
   2. Coloque as lavagens buffers a 30 ° C (para ter certeza de SDS é dissolvido).
   3. Submergir as lâminas tão rapidamente quanto possível, mas muito suavemente, num tubo Falcon de 50 mL cheio com tampão de lavagem até que o vidro repousa sobre o fundo cónico do tubo.
   4. Depois de alguns segundos, quando as pias levantador-derrapante para o fundo do tubo, retire o slide com uma pinça sem riscar a matriz e colocar no rack da estação de lavagem. Continuar com a lavagem sem intervalo de tempo.
   5. Lavam-se as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-I (numa estação de lavagem). Dê-lhe uma segunda lavagem por 20-30 min em 500 ml de lavar-buffer II (em uma estação de lavagem). Da mesma forma, lavar as lâminas durante 5 min em 500 ml de tampão de lavagem-III (opcional) (numa estação de lavagem).
   6. Secam-se as lâminas durante 2 min a 2000 rpm.

12. Análise de Microarray

1. Digitalizar imagenscom os respectivos comprimentos de onda em scanner e salvar em uma pasta "Jove Project".
2. Use software para analisar os arquivos digitalizados, inicialmente, como descrito anteriormente 22. Depois de executar este programa, selecione a guia "Abrir imagem" para carregar o arquivo de imagem vermelho (-.550) como "Vermelho" e arquivo de imagem verde (-.635) como "Green". Faça o upload do arquivo gal (.gal) com lista de matriz S. pneumoniae no arquivo de imagem, selecionando "lista de matriz Load" guia 22.
   Nota: esta lista de matriz constituído por 48 redes, em cada grade havia 16 linhas e 15 colunas. Cada ponto na grade representa um único gene e informações pontuais incluindo nome gene é adicionado através de um arquivo de descrição de local. Os números no local são dadas a partir da esquerda para a direita e de cima para baixo.
3. Depois de encontrar cuidadosamente as grades, selecione a guia "Find Array, encontrar blocos, Alinhe Features" para alinhar os pontos. Depois de alinhar todos os recursos, analisar a imagem, selecionando o "Analisando" tab. Criar um novo arquivo de ter resultados, histograma e gráfico de dispersão. Salve este arquivo a partir do separador "resultados salvar como" como um arquivo .gpr para análise posterior.
4. Realize uma maior normalização e tratamento de dados com in-house desenvolvido pacote de software Microprep como descrito ^9.
5. Use repetições biológicas independentes para dados microarray de DNA que são trocados-dye. Realizar implementação CyberT de uma variante de t-test1 e calcular as taxas de descoberta de falsas (FDR), como descrito ^9.
6. Para genes expressos diferencialmente, ter p <0,001 e FDR <0,05 como um padrão.
7. Faça o upload de dados de microarrays de DNA na página submissão NCBI para obter um GEO (Gene Expression Omnibus) o número de acesso.

Resultados

ARN, o isolamento e análise de cDNA

L-serina é um dos aminoácidos essenciais e a sua concentração no plasma sanguíneo humano varia de 60-150 uM em crianças e adultos. O seu papel na biossíntese de purinas e pirimidinas destaca a sua importância no metabolismo e é um precursor de várias aminoácidos (glicina, cisteína e triptofano). Para estudar o impacto da L-serina em todo o transcriptoma de S. pneumoniae D39 estirpe de tipo selvagem, a análise de microarray da esti...

Discussão

Nós descrevemos um protocolo de fácil utilização que pode ser aplicado para realizar a análise de toda transcriptoma de bactérias. O ponto-chave sobre esta técnica particular é que a condição sob a qual as células são colhidas irão variar. Após a colheita de células e o isolamento de ARN, esta técnica torna-se igual para todos os tipos de amostras bacterianas e segue passos exactamente idênticas e, por conseguinte, pode ser aplicado a qualquer tipo de cultura bacteriana. O protocolo é muito simples e conveniente e começ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido fenol	SigmaAldrich	P4682
Kit de isolamento de RNA Roche	Applied Science	11828665001
Contas de		105015
Chloroform	Boom	92013505.1000.
IAA		106630
Nanodrop		Nanodrop ND-100
Agilent BioAnalyser	Agilent	G2940CA
Superscript III	Life technologies Invitrogen	18080044
AA-dUTP	Life technologies Invitrogen	AM8439
DDT	Life technologies Invitrogen
Primeiro buffer de fio	Life technologies Invitrogen	18080044
NaOH	SigmaAldrich	S8045-1KG
HEPES	SigmaAldrich	H4034-500G
DyLight-550	Thermoscientiffic	62262
DyLight-650	Thermoscientiffic	62265
SHY Buffer	Cooler Speedvac SigmaAldrich	H7033-125ML
	Concentrador Eppendorf	RUGNE3140	Speedvac mais
Forno de Hibridização	Grant Boekel	Iso-20
Lifter-slips	Erie Scientific	25x60I-M-5439
Wipe	KIMTECH
SDS	SigmaAldrich	L3771-100g
SSC	SigmaAldrich	W302600-1KG-K
Genpix autoloader 4200A1	MSD tecnologias		Scanner
microarray bicarbonato de sódio	SigmaAldrich	104766