Usando o Eletrorretinograma na Avaliação da Função na Roedor Retina e os efeitos protetores do remoto Limb Pré-Condicionamento Isquêmico

Resumo

O eletrorretinograma (ERG) é um potencial elétrico gerado pela retina em resposta à luz. Este artigo descreve como usar o ERG para avaliar a função retiniana, em ratos adaptados ao escuro, e como ele pode ser usado para avaliar uma intervenção neuroprotetora, no presente caso o pré-condicionamento isquêmico remoto.

Resumo

O ERG é a soma de toda a atividade da retina. O ERG geralmente é registrado a partir da córnea, que atua como uma antena que coleta e soma os sinais da retina. O ERG é uma medida sensível de alterações na função retiniana que são pan-retinianas, mas é menos eficaz para detectar danos confinados a uma pequena área da retina. No presente trabalho descrevemos como registrar o ERG 'flash', que é o potencial gerado quando a retina é exposta a um breve flash de luz. Descrevemos métodos de anestesia, midríase e manejo da córnea durante o registro; como manter a retina escura adaptada; materiais e colocação do eletrodo; o alcance e a calibração da energia do estímulo; parâmetros de gravação e extração de dados. Também descrevemos um método de indução de isquemia em um membro e como usar o ERG para avaliar os efeitos dessa isquemia remota da retina na função retiniana após danos causados pela luz. Um protocolo de dois flashes é descrito que permite o isolamento do componente acionado por cone do ERG adaptado ao escuro e, portanto, a separação dos componentes de haste e cone. Por poder ser registrado com técnicas minimamente invasivas, o ERG tem sido amplamente utilizado em estudos de fisiologia, farmacologia e toxicologia da retina. Descrevemos um exemplo dessa utilidade, no qual o ERG é usado para avaliar a função da retina danificada pela luz, com e sem intervenção neuroprotetora; pré-condicionamento por isquemia remota.

Introdução

O ERG é um potencial eléctrico gerado pela retina em resposta a luz, e gravado a partir da superfície da córnea do olho. Quando as condições de gravação são geridos com cuidado, o ERG pode ser usada em uma variedade de maneiras de avaliar a função da retina. Aqui descrevemos como para gravar o 'flash ERG', o potencial gerado quando a retina é exposto a um breve flash, brilhante apresentada em um fundo Ganzfeld. O Ganzfeld dispersa a luz homogeneamente eo flash de luz atinge toda a retina aproximadamente uniformemente. Se a retina está adaptado escuro antes de gravar, e o de adaptação ao escuro é mantida como o animal é preparado para a gravação, o ERG obtido é gerado por ambos os bastonetes e cones fotorreceptores.

O flash ERG adaptação ao escuro tem uma forma de onda característica, que foi analisada em duas maneiras. Em primeiro lugar, precoce e tardio componentes da forma de onda do ERG foram distinguidos, e relacionados com a sequência de neurónioactivação ai na retina. O primeiro componente é um de curta latência negativo ido potencial, a uma onda (Figura 1). Isto é seguido por um potencial positivo Ir, chamado a onda b. A fase ascendente da onda b mostra oscilações, que são considerados um componente separado (potenciais oscilatórios ou PO). A onda um é considerado ser gerado por fotorreceptores, o b-ondas por células da camada nuclear interna, e as células PO por amacrine ^1.

Com base na força do estímulo, as respostas a pisca muito fraca denominado o limiar de resposta escotópica são possíveis. O limiar de resposta escotópica é entendida para ser gerada a partir das células ganglionares da retina ^2-4. Em segundo lugar, o flash ERG podem ser separados por adaptação à luz, ou por um protocolo de dois flashes descrito abaixo, em componentes rod- e orientada para o cone. Sob condições fotópicas, a uma onda não é detectável em ratazanas, pois a população cone é baixo, mas PO e uma onda b são⁵ claro. Nos primatas, cujas retinas têm populações superiores cone, tanto rod- e vias cone- gerar um detectável uma onda ^6.

Duas medidas úteis muitas vezes extraídos do flash ERG são as amplitudes de a- e b-ondas, medidos como na Figura 1, com as respostas de flash típicos mostrados na Figura 2. Quando a população de fotorreceptores é reduzido, por exemplo por exposição a prejudicialmente brilhante luz, todos os componentes do ERG são reduzidos. Intervenções neuroprotetores, como remota pré-condicionamento isquêmico (RIP), pode ser validado pela preservação das amplitudes do a- e b-ondas (Figura 3). Em resumo, a análise do ERG permite comparações entre saudável, luz e da retina danificado neuroprotected.

Protocolo

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais de University of Sydney.

1. Os eléctrodos Factura

1. Construir o eléctrodo positivo (o qual entrará em contacto com a córnea) a partir de uma (5 cm) de comprimento curto de fio de platina de 1-2 mm de diâmetro. Moldá-lo em um loop de alguns mm de diâmetro. Conecte-se este ciclo com uma vantagem convencional, o tempo suficiente para chegar à fase de entrada do seu amplificador (ver Figura 4).
2. Construir o eléctrodo negativo (o que vai na boca do animal), utilizando um de Ag / AgCl sedimentar 1-2 mm de diâmetro, também ligada a uma guia convenção (ver Figura 4).
3. Como um eletrodo de referência (que entrará em garupa do animal), use uma agulha hipodérmica limpo (23 G), também ligado a uma vantagem de comprimento adequado (consulte a Figura 4).
4. O ideal é usar cabos de três chumbo fornecidos por fabricantes de instrumentos, para conectar os três eletrodos (U positivo94; córnea, negativo → boca, referência → traseiro) para o amplificador.

2. Conexão e Calibração do estímulo luminoso e ERG Set-up

1. Criar (ou localizar) um pequeno laboratório de gravação, o que pode ser feito escuro. Equipar com uma ou ambas de uma luz sobre-o-banco de vermelho ou uma cabeça-lâmpada vermelha.
2. Use um luxímetro para confirmar que a luz vermelha iluminância atingir os olhos do rato durante a instalação não exceda 1 lux.
   Nota: Um filtro de densidade neutro pode ser usado para reduzir o brilho da lâmpada e a fonte de luz da lâmpada deve especificamente emitem luz vermelha. Adaptação das Trevas vai ser comprometida se fontes de luz emitem comprimentos de onda (visíveis) mais baixos.
3. Lacrar todos a luz difusa que entra no laboratório de gravação (isso muitas vezes exige persistência com fita opaco) e preparar um filtro de densidade neutra (este pode ser comprado em folhas) grande o suficiente para caber mais, e assim fraca, qualquer tela de computador que você terá na laboratório.
   Nota: luz e Strayà luz de uma tela são suficientes para prejudicar a adaptação ao escuro do olho de rato.
4. Ligue o amplificador para hardware de aquisição de dados. Conecte-se, leads negativos e positivos de referência para o amplificador. Verifique se o computador ea unidade de alimentação Ganzfeld LED estão bem conectados a uma fonte de terra.
   Nota: Alguns laboratórios têm-se especializado pontos de aterramento, conectado a um terreno de construção; uma tubulação de água é uma alternativa eficaz.
5. Calibrar a fonte de luz LED com um radiómetro de investigação de qualidade. Corrigir o sensor do medidor na posição em que o olho do animal será localizado durante uma experiência.
6. Programe os LEDs Ganzfeld para executar um protocolo de campo total ERG com aumentos passo a passo em energia flash, duração do flash, flash e repetição tempo entre flashes, denominado intervalo interstimuls (ISI), configurações. Por exemplo um protocolo de campo total ver Tabela 1.
   Nota: O ERG de campo total flashes aumentará de flashes ofuscantes repetitivas para bdireito pisca em uma forma sábia passo. O programa de flash duplo surge na sequência do protocolo de campo total e permite o isolamento dos bastonetes e cones respostas.

3. Dia Antes do ERG Experimentação

1. Escuro adaptar ratos Sprague-Dawley, durante 12 h antes da gravação. É conveniente fazer isso no laboratório de gravação, uma vez que a luz difusa foi eliminada.

4. Dia do ERG Experimentação

1. Organizar para que o animal delicadamente ser aquecido durante a gravação. Nós usamos uma plataforma de metal leve construído de modo que a cabeça do animal pode descansar no ponto correto no momento da entrada para o Ganzfeld. A plataforma tem embutido tubagem através da qual se bombeia a água pré-aquecida a 40 ° C num banho de água.
   Nota: A experiência mostra que este mantém a temperatura do núcleo do animal a 37 ° C.
2. Pesar o rato sob condições de pouca luz. Peso recorde e make up cetamina correta (60 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) dose. Contenha o rato gently e injetar anestésico por via intraperitoneal.
3. Nota momento da injecção. Uma vez que o animal está inconsciente (geralmente dentro de 5 min) verificar profundidade da anestesia levemente beliscar uma almofada do pé, para ver se uma resposta reflexa está presente. É melhor esperar até que esse reflexo é ausente ou fraco, antes de prosseguir.
4. Aplicar uma única gota de atropina e outro de proxmethacaine a córnea.
5. Corte um comprimento de 10 centímetros da linha preta. Faça um laço com um nó simples e deslizar o laço sobre o equador do olho. Aperte-o ligeiramente; o efeito é chamar o globo ocular ligeiramente para a frente, com o mínimo de pressão. Isso mantém a córnea resulta das pálpebras.
6. Aplicar olho carbómero gotas à superfície da córnea. Certifique-se de carbómero permanece sobre a superfície da córnea e não derramar sobre as pálpebras ou o rosto.
7. Coloque roupas de cama absorvente em cima da plataforma aquecida.
8. Posição rato na cama, com a cabeça no lugar recomendado na abertura do Ganzfeld.
9. Inserir intErnal sonda de temperatura no recto. Sonda de temperatura segura na posição gravando cabo de sonda para a cauda.
10. Insira o eletrodo de referência (a agulha 23 G) por via subcutânea na perna de trás, e se conectar ao amplificador.
11. Inserir o eléctrodo negativo (o sedimento de Ag / AgCl) de forma segura na boca. Para evitar que isso escorregar para fora da boca, apor o cabo de ligação a uma superfície estável.
12. Posicionar o eléctrodo positivo ao longo do centro da córnea. Usando um micromanipulador, garantir que o eletrodo toca a córnea suavemente.
13. Verifique a temperatura do corpo é a 37,0-37,5 ° C.
14. Uma vez que o animal está devidamente posicionado e eletrodos estão no lugar, armar toda a configuração (Ganzfeld e animal) com um material opaco (para preservar a adaptação ao escuro). Nós usamos um pano preto macio.
15. No software de aquisição fixado em uma taxa de amostragem de 2 KHz com um tempo de coleta de 100-1000 ms com 5 ms de amostragem pré-coleção. Defina os filtros passa banda para 1-1,000Hz e garantir que a amostragem é acionado para provar o período de ~ 250 ms após um flash.
16. Verifique a linha de base a gravação. Deve ser livre de ruídos estranhos, mas mostrar algum ruído amplificador e uma oscilação respiratória.
17. Se a linha de base mostra ruídos estranhos, começar solução de problemas. A maioria dos problemas são relacionados a derrapagem na posição do eletrodo, ou aterramento. Use uma gaiola de Faraday para garantir gravações são livres de ruídos estranhos.
18. Executar um flash de teste, 0,4 log scot cd.sm ^-2. Uma forma de onda ERG semelhante à Figura 2A deve aparecer. Em nossas respostas típicas de laboratório para um flash cd.sm scot 0,4 log ^-2 são (a onda: -474 ± 39 mV e b-ondas: 1512 ± 160 mV, n = 11).
19. Permitir animal escuro re-adaptar para 10 min. É conveniente utilizar estes 10 min para verificar novamente a linha de base.
20. Após a confirmação do sinal estável começar a gravar.
21. No fim da sessão de gravação, que vá corpo temperature foi mantida. Remover eletrodos. Reaplicar carb�ero polímero de córneas. Permitir que o animal se recuperar em uma almofada de calor até que esteja totalmente móvel e ativo, antes de retornar à habitação animal.

5. A isquemia remoto

1. Execute isquemia remoto em ambos os roedores acordado ou anestesiados.
2. Se o animal é anestesiado, colocá-lo em uma plataforma aquecida (acima) e coloque o manguito do esfigmomanômetro sobre a parte superior da traseira-membro, claro do joelho.
3. Se os animais estão acostumados a serem tratadas, é possível executar esse procedimento sem anestesia; isto requer duas pessoas. Uma pessoa restringe o animal delicadamente eo segundo aplica-se o manguito do esfigmomanômetro e opera o esfigmomanômetro.
4. Para animais acordados, use um pedaço de toalha de ~ 15 centímetros x 30-50 cm para embrulhar cuidadosamente o animal, com um hindlimb livre. Coloque o animal em sua parte traseira em (digamos) o antebraço esquerdo, com a cabeça enfiada entre o braço do suporte e torso, e lugara braçadeira como acabado de descrever.
5. Esvaziar a manga e assegurar a válvula de pressão de ar é fechada. Bombear o manguito até 160 mmHg em animais anestesiados, e 180 mmHg em animais acordados. Isso excede a pressão sistólica (geralmente 140 mmHg e 160 mmHg, respectivamente).
6. Manter essas pressões, conforme necessário, usando a bomba de mão.
7. Após o tempo previsto para a isquemia (nós usamos dois períodos de 5 min separados por 5 min de reperfusão), esvazie a pressão do balonete, desapertando a válvula de pressão de ar.
8. Confirmar o efeito de isquemia remoto com uma sonda de temperatura ligada a pele da pata. A temperatura da pele cai tipicamente 32-30 ° C, durante 5 minutos e recupera por reperfusão.

6. Danos Luz

1. Certifique-se de que os ratos estão em uma noite de adaptação ao escuro, antes do procedimento danos leves.
2. No momento adequado seguinte isquemia (em nossos experimentos sem atraso), cada animal é colocado isoladamente em um caixas de acrílico, with água e alimentos em recipientes à base de chão.
   Nota: O dano induzido por luz só pode ser realizado em animais albinos.
3. Ligue uma luz branca pré-calibrado 1.000 lux em um horário padrão (geralmente 09:00) e manter esta condição durante 24 horas.

7. ERG Extração de Dados e Análise

1. Adquirir formas de onda médios do ERG. Se necessário, corrigir para uma linha de base diferente de zero, por subtracção.
2. Medir a amplitude da onda-um (apresentada em meados de altas intensidades de estímulo), como a diferença de tensão entre a linha de base e a primeira (<30 ms latência) da calha (Figura 1).
3. Medir a amplitude da onda b como a diferença de tensão entre o pico da onda e um-a positiva da onda seguinte, que ocorre tipicamente a uma latência de 80-100 mseg (Figura 1).
4. Isolar potenciais oscilatórios usando uma transformada de Fourier para filtrar dados 60-235 Hz, com uma banda de transição 90 Hz ^{7. Se necessário, o sinal de potencial oscilatório isolado pode então ser subtraída da forma de onda não filtrada para confirmar a identidade da calha de uma onda.}
5. O tempo implícita (latência) dos a- e b-picos de onda também pode ser uma medida útil (Figura 1). Use os flashes individuais para isolar a resposta rod. Subtrair a resposta de cones (flash 2) a partir da resposta mista (flash 1) para isolar a resposta da haste (Figura 2).
6. Normalizar a intensidade da luz indivíduo uma onda e amplitudes da onda-b (pós-tratamento / pós-tratamento-base) ou a média para os grupos de tratamento. Curvas intensidade-resposta traçar as amplitudes de grupo e erro contra energia flash.

Resultados

O protocolo pode ser utilizado para medir a função visual da retina de roedores in vivo. A uma onda, uma medida da função de fotorreceptores, e da onda b, uma medida da função retina interna, são anotados na Figura 1.

Os dominados-rod ERG sinal aumenta com o aumento do estímulo de luz, como mostrado na Figura 2A. A onda de um torna-se aparente a ~ 0,4 log Scot cd.sm ^-2 e a amplitude de um dos aumentos de onda até à saturação a 2,5 log Sco...

Discussão

O flash método ERG de adaptação ao escuro descrito acima é um método confiável para avaliar a função da retina em ratos. Tanto a uma onda e onda-b foram reduzidas em danos leves. Remoto pré-condicionamento isquêmico mitigado reduções de luz induzida por danos no um-ondas e b-ondas. Esta preservação da função da retina sugere que o pré-condicionamento isquêmico remoto tem induzido neuroproteção, assemelhando-se outras formas de pré-condicionamento de proteção, tais como hipóxia, isquemia e exercício ^8-10. O si...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Computador
PL	35044	AD do hardware do acquirion de 4 canaletas	Aquisição do amplificador animal do AE
dos	instrumentos	do AE do bio amplificador do AE 136	do ERG para
o AD, dos	instrumentos		software da coleção do sinal
fotométricas	de Ganzfield	FS-250A	estímulo claro
Sistema operacional Ganzfield	Soluções
Pesquisa Radiômetro	International light technologies	ILT-1700	calibrar série de luz
Lux medidor		LX-1010B	verificar luz vermelha illumanação
Excel	Microsoft
Fios condutores	AD Instruments		Connect positivo, negativo eletrodos de aterramento para amplificador
Fios condutores - jacaré	AD Instruments		aterramento ganzfield e aquisição de hardware para computador
Fio de platina 95%	A& Eletrodo positivo de
E Eletrodo bucal Ag / AgCl Pellet	SDR	E205	elétron negativo
26 G agulha	BD		elétron retificado
Bomba
banho-maria
Sistema de manta homeotérmica com sonda flexível	Harvard Appartus	507222F
Atropina 1% c/v	Bausch & Lomb		midríase tópica
Proxmeticaína 0,5% p/v	Bausch &	Anestésico tópico
Lágrimas de visco colírio Polímero	carbômero	Novartis
Rosca			retrair pálpebra
Pinças
Adesivo reutilizável	Blu tac		Farol vermelho escuro. Eletrodos de afixação
Cama
Ketamil - cetamina 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		dissociativo
Xylium - Xylazine 100 mg/ml - 50 ml	Troy Laboratories Pty Ltd		relaxante muscular
Balança