Desenvolvemos um modelo in vitro de dormência na medula óssea para células de câncer de mama sensíveis ao estrogênio. O objetivo deste protocolo é demonstrar o uso do modelo para o estudo da biologia molecular e celular da dormência e para a geração de hipóteses para testes subsequentes in vivo.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O estudo da dormência do câncer de mama na medula óssea é uma tarefa excepcionalmente difícil devido à complexidade das interações das células dormentes com seu microambiente, sua raridade e o excesso esmagador de células hematopoiéticas. Para esse fim, desenvolvemos um modelo clonogênico 2D in vitro de dormência de células de câncer de mama sensíveis ao estrogênio na medula óssea. O modelo consiste em alguns elementos-chave necessários para a dormência. Estes incluem 1) o uso de células de câncer de mama sensíveis ao estrogênio, que são o tipo que provavelmente permanecerá dormente por longos períodos, 2) incubação de células em densidade clonogênica, onde a interação estrutural de cada célula é principalmente com o substrato, 3) fibronectina, um elemento estrutural chave da medula e 4) FGF-2, um fator de crescimento abundantemente sintetizado por células estromais da medula óssea e fortemente depositado na matriz extracelular. As células incubadas com FGF-2 formam clones dormentes após 6 dias, que consistem em 12 ou menos células que têm uma aparência plana distinta, são significativamente maiores e mais espalhadas do que as células em crescimento e têm grandes proporções citoplasma/núcleo. Em contraste, as células incubadas sem FGF-2 formam principalmente colônias em crescimento que consistem em >30 células relativamente pequenas. Perturbações do sistema com anticorpos, inibidores, peptídeos ou ácidos nucléicos no dia 3 após a incubação podem afetar significativamente vários aspectos fenotípicos e moleculares das células dormentes aos 6 dias e podem ser usadas para avaliar os papéis de moléculas localizadas na membrana ou intracelulares, fatores ou vias de sinalização no estado dormente ou sobrevivência de células dormentes. Embora reconheça a natureza in vitro do ensaio, ele pode funcionar como uma ferramenta altamente útil para coletar informações significativas sobre os mecanismos moleculares necessários para o estabelecimento e sobrevivência de células dormentes. Esses dados podem ser usados para gerar hipóteses a serem testadas em modelos in vivo.
Introdução
Células de cancro da mama metastizar para a medula óssea antes de a doença é detectável 1, assim que os tumores se desenvolvem pequenos vasos sanguíneos 2,3. O processo metastático é rápida, mas ineficiente. Células entram os novos vasos sanguíneos rapidamente, a milhões por dia 4, mas poucos sobrevivem a viagem para órgãos distantes 5. No entanto, algumas micrometástases sobreviver no osso e pode ser encontrado como células individuais ou pequenos aglomerados de células nos aspirados de medula óssea de pacientes recentemente diagnosticados 1. Estas células resistem à quimioterapia adjuvante, que é administrado p....
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Protocolo
1. Ensaio clonogénico
- Preparar um único suspensões de células de linhas celulares do cancro da mama dependentes de estrogénio de células MCF-7 e T47D utilizando os passos descritos abaixo
- Aspirar o meio de cultura (DMEM / 10% inactivado pelo calor soro fetal de vitelo / glutamina e Pen / Strep) a partir de 10 cm do tecido placa de cultura, que é não confluentes mais de 50% com células T-47D MCF-7 ou. Lavar com PBS. Incubar com tripsina a 0,25% / EDTA 2,21 mM dissolvido em DMEM de alto teor de glucose a 37 ° C durante 1-4 min.
- Confira as células em um mínimo de intervalos sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma distribui....
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Resultados
As experiências foram conduzidas de recapitular o ensaio. O curso do tempo da experiência é mostrado na Figura 2A. As células são incubadas a densidade clonogénico no dia -1, é adicionado FGF-2 em meio fresco no dia 0 e as células são cultivadas até ao dia 6, quando eles são coradas e as colónias são contadas. Quaisquer perturbações do sistema são administrados no dia 3 em volumes de 100 uL a 10X a concentração final desejada. A Figura 2B mostra a aparência típica de crescimento e.......
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Discussão
O nosso modelo é composta por vários elementos chave de dormência na medula óssea. É composto de estrogénio células sensíveis, que são do tipo susceptíveis de permanecer dormentes na medula por períodos prolongados 10, que consiste de fibronectina, um elemento estrutural chave da medula, o FGF-2, um factor de crescimento abundantemente sintetizado pelo estroma da medula óssea e fortemente depositado na matriz extracelular da medula óssea 31,32 e incubação de células clonogénicas, em densidade, onde.......
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Divulgações
Compatível com o Departamento de Defesa Grants DAMD17-01-C-0343 e DAMD17-03-1-0524, a Comissão Estado de Nova Jersey em Cancer Research 02-1140-CCR-E0 ea Ruth Goldberg Estrin Memorial para Pesquisa do Câncer (RW)
Agradecimentos
Os autores não têm nada a revelar.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Células MCF-7 | ATCC | HTB-22 | |
| Células T47D | ATCC | HTB-123 | |
| BD BioCoat Fibronectina 24 Poços Transparente Fundo Plano TC-Tratado Multiwell Placa | Corning | 354411 | |
| BD BioCoat Fibronectina 60 mm Placas de Cultura | Corning | 354403 | |
| BD BioCoat Fibronectina 100 mm Placas de Cultura | Corning | 354451 | |
| BD BioCoat 22x22mm #1 Lamínula de Vidro com uma aplicação uniforme de fibronectina | humanaPlaca | de cultura de tecidos Corning 354088 | |
| 6 Poços | CellTreat | 229106 | |
| Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder | Corning Life Sciences | 50-013-PB | |
| Inativado por Calor, Soro Fetal Bovino | Fonte Internacional | FB02-500HI | |
| 0.25% Tripsina/2.21 mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Solução de Penicilina-Estreptomicina, 100X | Corning | 30-002-CI | |
| L-Glutamina, 100x, Líquido | Corning | 25-005-CI | |
| FGF Humano Recombinante | R& básico D Systems | 234-FSE-025 | |
| Inibidor de Akt (1L6-Hidroximetil-chiro-inositol-2-(R)-2-O-metil-3-O-octadecil-sn-glicerocarbonato) | CalBiochem | 124005 | |
| LY294002 | CalBiochem | 19-142 | Chenical PI3K inibidor |
| C3 transferase | O citoesqueleto | CTO3 | inibe RhoA, RhoB e RhoC, mas não GTPases relacionadas, como Cdc42 ou Rac1 |
| Y-27632 dicloridrato | Santa Cruz Biotechnology | 129830-28-2 | |
| BODIPY FL-Falacidina (verde) | Sondas Moleculares | B607 | Fluorocromo para coloração de actina fibrilar |
| BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (vermelho) | Sondas Moleculares | R415 | Fluorocromo para coloração de actina fibrilar |
| Anticorpo IgG anti-rato Alexa Fluor 488 Donkey, Reagente ReadyProbes | Probes Moleculares | R37114 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant com DAPI | Sondas Moleculares | P-36931 |
Referências
- Braun, S., et al. Cytokeratin-positive cells in the bone marrow and survival of patients with stage I, II, or III breast cancer. N Engl J Med. 342 (8), 525-533 (2000).
- Benoy, I. H., et al.
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Reimpressões e permissões
