Quantificação de Proteção Neurovascular sequência repetitiva Hypoxic Pré-condicionamento e Transient Oriente oclusão da artéria cerebral em ratos

Summary

Este protocolo descreve o pré-condicionamento hipóxico repetitivo ou breves exposições à hipóxia sistêmica que reduzem os volumes de infarto e a ruptura da barreira hematoencefálica após oclusão transitória da artéria cerebral média em camundongos. Ele também detalha a quantificação dupla do volume do infarto e da ruptura da barreira hematoencefálica após o AVC para avaliar a eficácia da proteção neurovascular.

Abstract

Modelos animais experimentais de acidente vascular cerebral são ferramentas inestimáveis ​​para a compreensão do AVC e desenvolvendo estratégias de tratamento mais eficazes. Um protocolo de 2 semanas para o pré-condicionamento repetitivo hipóxica (RHP) induz a proteção a longo prazo contra a lesão do sistema nervoso central (SNC) em um rato modelo de acidente vascular cerebral isquêmico focal. RHP consiste em 9 exposições estocásticos a hipoxia, que variam em termos de duração (2 ou 4 h) e intensidade (8% e 11% de O _2). RHP reduz os volumes de enfarte, barreira sangue-cérebro (BBB) ​​uma ruptura, e a resposta inflamatória pós-derrame durante semanas após a última exposição a hipoxia, sugerindo uma indução de longo prazo de um fenótipo do SNC de protecção endógena. A metodologia para a quantificação dual de volume do enfarte e a certificação perturbação é eficaz na avaliação da protecção neurovascular em ratinhos com RHP ou outros neuroprotectores putativos. Camundongos adultos machos Swiss Webster foram pré-condicionados por RHP ou exposições de duração equivalente a 21% de O (ou seja, sala de ar). A oclusão da artéria 60 min transitória cerebral média (tMCAO) foi induzida duas semanas após a última exposição hipóxica. Tanto a oclusão e reperfusão foram confirmados por transcraniana dopplerfluxometria a laser. Vinte e duas horas após a reperfusão, Azul de Evans (EB) foi administrado por via intravenosa através de uma injecção na veia da cauda. 2 horas mais tarde, os animais foram sacrificados por overdose e secções do cérebro foram corados com isoflurano 2,3,5- cloreto de trifeniltetrazólio (TTC). Os volumes de enfarte foram então quantificadas. Em seguida, EB foi extraído do tecido ao longo de 48 horas para determinar BBB interrupção após tMCAO. Em resumo, RHP é um protocolo simples, que pode ser replicado, com um custo mínimo, para induzir protecção endógena neurovascular a longo prazo de uma lesão acidente vascular cerebral em ratos, com o potencial de translação para outros estados de doença pró-inflamatórias baseados em CNS e sistémicas.

Introduction

Como a principal causa de incapacidade em adultos e a quarta principal causa de morte, acidente vascular cerebral é um dos estados patológicos mais debilitantes que afectam a população adulta dos Estados Unidos. ¹ Os modelos animais de acidente vascular cerebral permitir a investigação experimental de novos métodos de reduzir a lesão isquémica e melhorar a recuperação pós-acidente vascular cerebral. Uma nova avenida para tal investigação translacional é pré-condicionamento. Pré-condicionamento é o uso intencional de um estímulo não prejudicial para reduzir a lesão a partir de uma subsequente e mais grave, ferimento. ² o pré-condicionamento hipóx....

Protocol

NOTA: Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da UT Southwestern Medical Center, que age de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde política (NIH) para uso animal experimental.

1. Pré-condicionamento repetitivo Hypoxic

1. Projete quatro medidores de vazão em reguladores de gás e anexar a câmaras de indução 15 L padrão com tubos de PVC para permitir que o gás comprimido a partir do oxigênio (O ₂₎ tanques a fluir para as câmaras através de uma porta de entrada. Veja Equipamentos e Materiais para mais detalhes sobre o design personalizado.
2. Divida ratos em dois ....

Results

Este estudo incluiu 25 ratinhos Swiss Webster machos que tinham 10 semanas de idade no início da randomização em RHP (n = 10) ou 21% _de O ₂ (n = 15) grupos. Duas semanas após a exposição final RHP, procedimentos cirúrgicos foram realizados, com grupos cegos e contrabalançadas entre os dias. Seguindo tMCAO, um rato morreu durante a recuperação pós-operatória e um rato foi excluído do estudo porque não cumpria o critério de reperfusão CBF. Ambos os ratos foram excluídos do grupo O ₂ de 21%.......

Discussion

Uma única exposição à hipóxia sistêmica (ou seja, 2 horas de 11% O ₂₎ em camundongos "transitoriamente" protege o cérebro de tMCAO, ²⁹ ou seja, a resposta epigenética ao desafio hipóxico pré-condicionamento é de curta duração, eo fenótipo linha de base é restaurada dentro dias. Apresentações repetitiva do estímulo pré-condicionamento hipóxico alargar drasticamente a duração do fenótipo neuroprotector. ⁶ Muitos estudos têm demonstrado que a frequência, amplitude e duraç.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medidores de vazão, reguladores	VetEquip, Inc	Pedido especial	Quatro medidores de vazão são conectados a um tubo de PVC flexível de 6,0 mm que se conecta à porta de entrada em cada câmara de indução com um conector fêmea de plástico. Esses medidores de vazão são aparafusados a uma barra de metal de 6,5" x 1" x 1". Esta barra de metal é aparafusada a um manômetro MI-246-P com uma saída DISS. Este manômetro e equipamento medidor de vazão pode ser conectado a cada novo cilindro de gás com uma chave inglesa.
21% O2 tanque	AirGas	OX USP200
11% O2 tanque	AirGas	Pedido
8% O2 tanque	Pedido		de AirGas
15 L câmaras de indução	VetEquip	941454
Moor Laber Dopper Flow	Moor Instruments	sonda de 0,8 mm de diâmetro moorVMS-LDF1-HP
Iluminador de Alta Intensidade	Microscópio Estéreo Zoom Nikon	NI-150
	NIkon	SMZ800	Outros microscópios cirúrgicos podem ser usados.
Kent Scientific Right Temperature CODA	Kent Scientific Corporation	Descontinuado	A substituição recomendada é o PhysioSuite com Monitoramento de Temperatura RightTemp e Controle Homeotérmico (Kent Scientific, #PS-RT).
Hovabator Incubator	Stromberg's	2362-E	Nosso modelo é o 2362N. 2362E é um modelo posterior e inclui um termostato eletrônico.
V010 Sistema de anestesia	VetEquip	901807	Inclui: mangueira de oxigênio de alta pressão de dez pés, estrutura, medidor de vazão, conjunto de descarga de oxigênio, vaporizador, circuito de respiração, câmara, narizes, tubulação de evacuação de gases residuais e dois filtros VapoGuard
250 ml de isoflurano	Butler Schein	NDC-11695
D-6 Vet Trim Animal Aparador Sem Fio	Andis	#23905	Lâminas de substituição estão disponíveis na Andis (#23995)
Betadine	Fisher Scientific	19-898-867
Q-tips	Vários vendedores	Número de catálogo não disponível
Almofadas de Gaze	Fisher Scientific	67622
Campo cirúrgico	Fisher Scientific	GM300
Suturas de Seda	Look/Div Surgical Specialties	SP115
Suturas de Nylon	Look/Div Surgical Specialties	SP185
Durmont #5 fórceps (2)	Ferramentas de Belas Ciências	11251-35	45°
Tesoura Cirúrgica	Ferramentas de Ciência Fina	14028-10
3 mm Vannas	Kent Scientific Corporation	INS600177	Hartman
Hemostats	Ferramentas Científicas Finas	13002-10
Filamentos de Oclusão Pedido	Especialidade	da Universidade de Washington	Os filamentos são revestidos com silicone na Universidade de Washington e fornecidos às instalações da UTSW por uma taxa.
Evans Blue	Sigma Aldritch	E2129-10G
	Sigma Aldritch	WHA1001150	150 mm, círculos, Grau 1
Barcos de Pesagem	Fisher Scientific	02-202-101	2.5" de diâmetro
0.9% Injeção de Cloreto de Sódio USP	Baxter Pharmaceutics	2B1321
Seringa de insulina de 0,3 cc com agulha de 29 gauge	Becton Dickinson Labware	309301
Flat bottom restrain	Braintree Scientific	FB  M	2.0" diâmetro
TTC	Sigma	T8877
10x PBS, pH 7.4	Fisher Scientific	BP399-20
Banho-maria	Vários vendedores	Número de catálogo não disponível	Os tubos de cintilação com TTC podem ser mantidos manualmente em água morna corrente como alternativa ao banho-maria.
Placa de isopor	Vários vendedores	Número de catálogo não disponível
Kit de Seringa Grande	PumpSystems Inc	P-SYRKIT-LG
Bomba de Perfusão	PumpSystems Inc	NE-300
Seringa de 60 cc	Fisher Scientific	NC9203256
conjunto de infusão alada de calibre 27	Kawasumi Laboratories, Inc	D3K1-25G 1
frasco de cintilação de 20 ml	Fisher Scientific	50-367-126
Espátula de aço inoxidável	Fisher Scientific	14-373-25A
Alto acrílico 1.0 mm cérebro de camundongo, coronal	CellPoint Científico	Número de catálogo não disponível
Lâminas de aço inoxidável de 0,21 mm, 25 pk	CellPoint Scientific	Número de catálogo não disponível	As lâminas de criostato reutilizáveis são uma alternativa barata.
4% de paraformaldeído	Santa Cruz Biotechnology	SC-281692
Lâminas de microscópio Superfrost	Fisher Scientific	12-550-15
HP Scanjet G4050	Vários vendedores	Número de catálogo não disponível	Outros scanners comerciais são adequados para esta etapa do protocolo.
ImagemJ	National Institute of Health	Número do catálogo não disponível
Balança Analítica	Mettler Toledo	XSE 205U
Forno Compacto de Precisão	Thermo Scientific
tubos de microcentrífuga de 1,7 ml (Eppendorfs)	Denville Scientific	C2170
Formamida	Fisher Scientific	BP228-100
Placas de 96 poços	Fisher Scientific	07-200-9
Epoch Microplate Spectrophotometer	BioTek	Número de catálogo não disponível