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Research Article
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Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.
Transtorno de uso de álcool (AUD) é um desafio de saúde grave. Apesar de uma grande componente hereditário para AUD, alguns genes têm sido implicados de forma inequívoca na sua etiologia. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é um modelo poderoso para explorar mecanismos genético-moleculares subjacentes comportamentos relacionados com o álcool e, portanto, é uma grande promessa para identificar e compreender a função dos genes que influenciam AUD. A utilização do modelo de Drosophila para estes tipos de estudos depende da disponibilidade de ensaios que medem a forma fiável respostas comportamentais ao etanol. Este relatório descreve um ensaio adequado para avaliar a sensibilidade de etanol e tolerância rápida em moscas. Sensibilidade etanol medido neste ensaio é influenciado pelo volume e concentração do etanol usado, uma variedade de manipulações genéticas previamente relatados, e também o período de tempo em que as moscas são alojados sem alimentos imediatamente antes do teste. Em contraste, s etanolensitivity medido neste ensaio não é afectado pela força de manipulação mosca, sexo das moscas, e a suplementação do meio de crescimento com antibióticos ou com levedura viva. Três métodos diferentes para quantificar a sensibilidade de etanol encontram-se descritos, todos levando a resultados essencialmente indistinguíveis sensibilidade etanol. A natureza escalável deste ensaio, combinada com a sua simplicidade global de set-up e custo relativamente baixo, tornam adequado para a análise genética de pequena escala e grande sensibilidade de etanol e tolerância rápida em Drosophila.
Transtorno de uso de álcool (AUD) é um enorme problema de saúde mundial (revisto em 1). Embora os mecanismos que conduzem o desenvolvimento de R são complexas, estas perturbações têm um importante componente genético (por exemplo, 2). O grande herdabilidade de AUD e as respostas comportamentais conservados em etanol através de muitas espécies (revisto em 3,4) têm gerado grande interesse na utilização de organismos-modelo genéticos para investigar o envolvimento de genes específicos em comportamentos relacionados com o álcool para uma melhor compreensão das bases moleculares de AUD. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, surgiu como um organismo modelo de liderança para explorar mecanismos genético-moleculares de comportamentos relacionados com o etanol (revisto em 3,4). Estudos em moscas têm destacado papel para várias vias de sinalização em respostas comportamentais ao etanol (revisto em 5). Curiosamente, alguns dos genes e vias que influenciam respons comportamentaises para etanol em moscas também têm sido implicados em comportamentos relacionados com etanol roedores e / ou R humano (por exemplo, 6-14). A conservação dos mecanismos de condução comportamentos relacionados com o etanol em toda a espécie, juntamente com o conjunto de ferramentas genéticas disponíveis no sistema modelo de Drosophila, ressaltam a utilidade do modelo mosca da fruta para investigar a genética de respostas comportamentais ao etanol.
Sensibilidade e tolerância 15,16 (revisto em 17) ao etanol em seres humanos está associada com o desenvolvimento de AUD. Ambas as respostas comportamentais ao etanol pode ser modelado em moscas através de uma variedade de ensaios laboratoriais (revisto em 3,4). Todos os ensaios de mosca conhecidos para os autores são baseados quer dependente do tempo induzida pelo etanol sedação / ou descoordenação recuperação dependente do tempo a partir de etanol sedação.
Em um artigo anterior do nosso grupo sobre a genética da sensibilidade etanol e rtolerância APID em Drosophila, um ensaio comportamental, baseada em etanol sedação induzida por vapor de moscas foi utilizado 18. Testes neste ensaio foi iniciado através da transferência de adulto vivo voa sem anestesia para esvaziar frascos alimentares, aprisionando as moscas em frascos com um tampão de acetato de celulose, adição de etanol para a parte superior (ou seja, o lado não-fly) do tampão de acetato de celulose, e selando o frasco contendo moscas, plugue de acetato de celulose e de etanol com uma rolha de silicone (ver esquema na figura S3, Referência 18). Vários frascos que representam diferentes grupos de moscas foram avaliados em paralelo, aumenta o rendimento do presente ensaio. Os frascos foram dadas um código anônimo e experimentadores ficaram cegos para grupo de tratamento para evitar viés não intencional na avaliação da sedação. Numa experiência normal, moscas em frascos foram bate-se suavemente a intervalos de 6 min e, após uma recuperação de 30 seg, o número de moscas sedados em cada frasco foi contado e Converted para moscas por cento ativos. Moscas absorvida vapor de etanol a partir do tampão de acetato de celulose de uma maneira dependente do tempo, causando aumentos progressivos em etanol interna 18 e sedação (cf referência 18 e Figura 1A e 1B neste relatório). Sedação neste ensaio foi definida operacionalmente como moscas (i) que está na ausência de curta ou (ii) que encontra-se em suas costas com ou sem bater as asas. Aqui, este ensaio de sedação etanol é descrita em detalhe, uma maior optimização operacional relevante para usá-lo é fornecido, e o ensaio é utilizado para tratar a contribuição de opções de suplementação de alimentos sobre a sensibilidade mosca sedação.
1. Day Before Assay
2. Dia de Ensaio
Os dados em bruto a partir de etanol neste ensaio de sedação são os números de moscas que são sedados como uma função do tempo de exposição ao vapor de etanol. Os dados em bruto são convertidos para as moscas por cento ativos como uma função do tempo (dados primários, as Figuras 1A, B, D - F). Sensibilidade para sedação de etanol a partir dos dados primários podem ser quantificados como sedação 50 Tempo (ST50), o tempo necessário para que 50% das moscas de se tornar sedado aea ou sob a curva (AUC), por meio de interpolação a partir da curva encaixa. Relatado anteriormente 18 de terceira ordem curvas polinomiais ajustar os dados primários bem como esperado (média R 2 = 0,934, n = 24, Figura 1A), embora as curvas sigmoidais ajustar os dados primários pouco melhores (média R 2 = 0,997, n = 24; Figura 1B). Como uma alternativa para a determinação da curva de valores ST50 encaixa, sensibilidade sedação etanol a partir dos dados primários também podem ser quantificados como áreasob a curva (AUC,% moscas activas x tempo) (Figura 1C). Os resultados destes três métodos de quantificação se correlacionam muito bem com os outros (Pearson r ≥0.998 2, n = 24) e são essencialmente indistinguíveis (Figura 1C), embora as unidades são necessariamente diferente para ST50 (min) e AUC (% activa voa x tempo). Detalhes sobre todos os cálculos, planilhas utilizadas, etc estão disponíveis a partir do autor correspondente. Note-se que os valores mais altos e mais baixos de ST50 (ou AUC) embotada e indicam o aumento da sensibilidade ao etanol sedação, respectivamente. Por coerência com o relatório anterior, 18, os valores ST50 derivadas de terceira ordem curva polinomial ataques foram usados por todo o restante deste study.Importantly, o ensaio detecta os efeitos da RNAi contra Cnx14D (Figura 1D) e mutações em scb (Figura 1E) , aru e hppy (Figura 1F), NPFR1 (dados não mostrados) sobre a sensibilidade de etanol como relatado em 18 e os artigos originalmente descrevendo os efeitos de tais manipulações genéticas 7,19-22.
Durante a utilização rotineira desse ensaio, tocando de frascos com tampões de acetato de celulose humedecidos com 2 mL de etanol fez com que o acetato de celulose de ignição para viajar para o fundo de alguns frascos em algumas experiências individuais (não mostrado), mudando, assim, potencialmente livre das moscas espaço e a concentração de vapor de etanol. Além disso, cerca de 0,25 ml de etanol atingiu o fundo (ou seja, lado mosca) dos tampões de acetato de celulose em que foram humedecidos com 2 mL de etanol (Figura 2A), levantando a possibilidade de que opera nestes ensaios foram expostas ao etanol líquido para além ao etanol vapor. Diminuindo o volume de etanol em tampão acetato de celulose a partir de 2 ml a 1 ml eliminou a migração para o fundo das cellulostampões de acetato e, durante o ensaio, mesmo depois de batida vigorosa (não mostradas) e também eliminados quantidades mensuráveis de solução de etanol sobre as partes inferiores dos tampões de acetato de celulose (Figura 2A). Sedação de moscas foi sensível ao volume de etanol utilizado mesmo com volumes inferiores a 1 ml (Figura 1A - C). Utilizando 1 ml de etanol, por conseguinte, ajuda a manter um espaço aberto constante para moscas durante o ensaio e assegura que o etanol não é líquido a ser ingerido. As moscas são, por conseguinte, presumivelmente exposta a etanol unicamente como um vapor neste ensaio. Um ml de etanol 85% (ou seja, o vapor a partir de 1 ml de 85% (vol / vol) de etanol) e 1-5 dias de idade w [A] moscas foram usadas em todos os estudos subsequentes aqui relatados, a menos que indicado de outra forma.
Em experimentos com 24 frascos, as moscas são bateu suavemente aos 6 minutos de intervalo para permitir que o experimentador para avaliar (ou seja, passando por ela) todos os frascos em um schedul razoável, prescritoe. ST50s de estudos com moscas de controlo utilizando menos frascos e intervalos de 5 min, foram comparáveis para ST50s a partir de estudos com intervalos de 6 min (dados não mostrados). Moscas são avaliados para a sedação 30 segundos depois de tocar para permitir que o tempo experimentador para tocar um conjunto de quatro frascos em sequência antes de determinar o estado de sedação dos moscas em cada frasco. Para determinar se as diferenças na tocando vigor ou tempo de recuperação depois de tocar a sensibilidade sedação etanol impacto, os valores ST50 em moscas de controle masculino e feminino foram medidos durante a ser aproveitado normalmente (regular) ou muito fortemente (Hard) e depois de um padrão de 30 segundos ou mais tempo de 60 seg recuperação. Vigor Tapping (Figura 2B) e o tempo de recuperação (Figura 2C) não teve nenhum efeito mensurável sobre os valores de controlo ST50 em machos ou fêmeas.
Os antibióticos podem ser usados para suprimir o crescimento bacteriano em meio de alimentar da mosca. Para determinar se a suplementação do meio de alimentos com antibióticos afeta etanol sensibilidade sedação,ST50 valores foram medidos em moscas criados para uma geração, na presença ou ausência de três antibióticos (ampicilina, 100 ug / ml; tetraciclina, 20 ug / ml; cloranfenicol, 125 ug / ml). Elevando moscas sobre estes três antibióticos não teve nenhum efeito sobre a sensibilidade à sedação etanol (Figura 2D).
As moscas são transferidos para frascos vazios-alimentares e, portanto, são privados de comida e água durante ~ 5 min imediatamente antes de ser exposto a vapor de etanol no ensaio de sedação. Para determinar se a quantidade de tempo moscas são mantidas em frascos vazios do alimento antes de se iniciar a sensibilidade sedação etanol impactos de ensaio, as moscas foram deixados em jejum durante 6 horas (pelo menos 70 vezes superior do normal) e, em seguida, foram medidos valores ST50. A fome durante 6 horas diminuiu significativamente ST50s em ambas as moscas de controle masculino e feminino (Figura 2E). Embora o efeito de fome em ST50 era relativamente pequeno (9-14% nestas experiências), a quantidade de tempo voa spend em frascos vazios antes de ser exposto a vapor de etanol no ensaio deve ser realizado uniforme em grupos dentro de um experimento e também entre os experimentos.
Laboratório alimentar da mosca pode ser suplementado com levedura viva (por exemplo, 18,20,23,24) para promover a produção de descendência. Por exemplo, frascos de alimento suplementado com levedura viva (Saccharomyces cerevisiae) produzido adultos mais cedo do que aqueles com levedura morta pelo calor ou sem fermento vivo (comparar d10-d11, barras brancas, Figura 3A), embora o número total de progenia produzidos durante 20 dias era indistinguível em frascos suplementado com levedura viva e morta pelo calor (Figura 3A). Para endereçar a possibilidade de viver levedura produzem quantidades significativas de etanol no alimento mosca, os efeitos de levedura viva em (i) em etanol a forma de alimentos, (ii) etanol em moscas, e (iii) a sensibilidade à sedação etanol em moscas foram medidos. Médio Food suplementado com sub leveduras vivas contidoquantidades subs- de etanol, em comparação com os produtos alimentares suplementados com mortas pelo calor ou não de levedura (Figura 3B). No entanto, as moscas de controle cultivadas em meio suplementado com ao vivo, morto ou sem fermento teve indistintamente baixas concentrações de etanol interna (Figura 3C). Além disso, a sensibilidade sedação etanol era indistinguível em moscas de controle cultivadas em meio suplementado com levedura viva ou morta pelo calor (Figura 3D).
Figura 1. opções de análise de dados do ensaio de sedação (AC). Controlo w [A] fêmeas (w 1118 isogénica, Bloomington Indiana da Drosophila Centro estoque # 5905) foram expostas ao vapor dos volumes indicados de 85% (vol / vol) de etanol. De dados (A) de curso de tempo de Sedação encaixar com terceira polinômios de ordem. (B)Dados do curso de tempo de sedação se encaixam com curvas sigmoidais. (C) Ethanol sedação sensibilidade quantificada como (eixo Y) deixou ST50 valores interpolados de polinômios de terceira ordem e curvas sigmoidais ou (eixo Y à direita) área sob a curva (AUC,% moscas Active X tempo). Volume de etanol, mas não o método de análise, a sensibilidade etanol impactado (two-way ANOVA, efeito do volume, p <0,0001; efeito do método de análise, ns; n = 8 / grupo; dados de AUC transformados 1/100 para ter em conta a diferença de dados de magnitude dos valores). (DF) de curso-tempo representativas de. (D) Expressão de Cnx14D ARNi no sistema nervoso (elav-Gal4 / v5597) embotados etanol sensibilidade em relação aos controlos (v5597 / + e elav-Gal4 / + ). (E e F) Mutação de s cb (scb Vol2) e aru (aru 8,128) maior sensibilidade sedação etanol e mutação do hppy (hppyKG5537) embotados sensibilidade sedação etanol relação aos controles. Os dados da EF foram previamente reportado como valoriza ST50 18.
Figura 2. Avaliação dos parâmetros operacionais no ensaio de sedação. (A) quantidade de etanol na parte inferior 2 mm de plugs de acetato de celulose. O volume de etanol adicionado para os topos dos tampões de acetato de celulose tinha um efeito significativo sobre o volume de etanol, que se mudou para o fundo 2 mm de tampões de acetato de celulose durante um mock 60 min experimento (one-way ANOVA, p <0,0001; * Bonferroni teste de comparação múltipla, 2 ml vs 0 e 1 ml, p <0,05 n = 4). O etanol foi quantificado como uma mudança na massa dos plugues de acetato de celulose. (B) Nem vigor de tocar os frascos durante os testes (Ordinário, Hard), nem sexo das moscas testado ST50s afetados (de dois way ANOVA; efeito de tocar, ns; efeito do sexo, ns; n = 12) (C) Nem tempo de recuperação depois de tocar nem sexo teve efeito significativo sobre ST50s (two-way ANOVA;. efeito do tempo de recuperação, ns; efeito do sexo, ns; n = 6) (D) A inclusão de antibióticos. (ATC; ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol) no meio de crescimento não teve nenhum efeito global sobre ST50s, mas não havia um efeito do sexo sobre ST50 (two-way ANOVA; efeito da ATC, ns; efeito do sexo, p = 0,001; interação , ns;. n = 6) (E) Efeito de fome sobre a sensibilidade à sedação etanol. ST50s foram significativamente menores em moscas privadas de comida e água durante 6 horas (Starved) em relação ao normalmente alimentados (Fed) voa; ST50s em machos e fêmeas eram indistinguíveis geral (two-way ANOVA; efeito de fome, p <0,0001; efeito do sexo, ns; n = 12; * Bonferroni testes de comparações múltiplas, efeito de fome em machos e fêmeas, p <0,05) .
| vial → | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| código → | ||||||||
| Total # → | ||||||||
| 0 min | ||||||||
| 6 min | ||||||||
| 12 min | ||||||||
| 18 min | ||||||||
| 24 min | ||||||||
| 30 min | ||||||||
| 36 min | ||||||||
| 42 min | ||||||||
| 48 min | ||||||||
| 54 min | ||||||||
| 60 min |
Tabela 1: log de teste normais. Veja protocolo passo 2.5.
| Frasco pequeno | Torneira | Avaliar |
| 1 | 6 min 0 seg | 6 min 30 seg |
| 2 | 6 min 5 seg | 6 min 35 seg |
| 3 | 6 min 10 seg | 6 min 40 seg |
| 4 | 6 min 15 seg | 6 min 45 seg |
Tabela 2:. Batida típica e cronograma de testes Veja protocolo passo 2.13.
| Nome de materiais / equipamentos | Companhia | Número de Catálogo | Comentários / Descrição |
| frascos de alimentos | VWR | 89092-772 | estreito |
| Flugs | Genesee / ROTuff.com | 49-102 | estreito |
| rolha de silicone | Fisher Scientific | 09-704-1l | # 4 |
| etanol | Fármaco-Aaper | 111000200 | 200 proof |
Tabela 3: Materiais.
Os autores não têm nada a divulgar.
Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.
Esses estudos foram apoiados por doações do National Institutes of Health, National Institute for Alcoholism and Alcohol Abuse to M.G. (P20AA017828, R01AA020634, P50 AA022537). Os autores agradecem a Jill Bettinger pelas discussões úteis e a Jacqueline DeLoyht pela assistência técnica.
| frascos para alimentos | VWR | 89092-772 | estreito |
| Flugs | Genesee/flystuff.com | 49-102 | |
| rolha estreita de silicone | Fisher Scientific | 09-704-1l | #4 |
| etanol | Pharmaco-Aaper | 111000200 | 200 prova |
