Um Ensaio Behavioral Barato, escalável para medição Ethanol Sedação sensibilidade e tolerância rápida em<em&gt; Drosophila</em

Resumo

Ensaios simples para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em Drosophila facilitam o uso deste organismo modelo para investigar esses importantes comportamentos relacionados ao etanol. Aqui, um ensaio relativamente simples e escalável para medir a sensibilidade ao etanol e a tolerância rápida em moscas é descrito.

Resumo

Transtorno de uso de álcool (AUD) é um desafio de saúde grave. Apesar de uma grande componente hereditário para AUD, alguns genes têm sido implicados de forma inequívoca na sua etiologia. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, é um modelo poderoso para explorar mecanismos genético-moleculares subjacentes comportamentos relacionados com o álcool e, portanto, é uma grande promessa para identificar e compreender a função dos genes que influenciam AUD. A utilização do modelo de Drosophila para estes tipos de estudos depende da disponibilidade de ensaios que medem a forma fiável respostas comportamentais ao etanol. Este relatório descreve um ensaio adequado para avaliar a sensibilidade de etanol e tolerância rápida em moscas. Sensibilidade etanol medido neste ensaio é influenciado pelo volume e concentração do etanol usado, uma variedade de manipulações genéticas previamente relatados, e também o período de tempo em que as moscas são alojados sem alimentos imediatamente antes do teste. Em contraste, s etanolensitivity medido neste ensaio não é afectado pela força de manipulação mosca, sexo das moscas, e a suplementação do meio de crescimento com antibióticos ou com levedura viva. Três métodos diferentes para quantificar a sensibilidade de etanol encontram-se descritos, todos levando a resultados essencialmente indistinguíveis sensibilidade etanol. A natureza escalável deste ensaio, combinada com a sua simplicidade global de set-up e custo relativamente baixo, tornam adequado para a análise genética de pequena escala e grande sensibilidade de etanol e tolerância rápida em Drosophila.

Introdução

Transtorno de uso de álcool (AUD) é um enorme problema de saúde mundial (revisto em ^1). Embora os mecanismos que conduzem o desenvolvimento de R são complexas, estas perturbações têm um importante componente genético (por exemplo, ^2). O grande herdabilidade de AUD e as respostas comportamentais conservados em etanol através de muitas espécies (revisto em ^3,4) têm gerado grande interesse na utilização de organismos-modelo genéticos para investigar o envolvimento de genes específicos em comportamentos relacionados com o álcool para uma melhor compreensão das bases moleculares de AUD. A mosca da fruta, Drosophila melanogaster, surgiu como um organismo modelo de liderança para explorar mecanismos genético-moleculares de comportamentos relacionados com o etanol (revisto em ^3,4). Estudos em moscas têm destacado papel para várias vias de sinalização em respostas comportamentais ao etanol (revisto em ^5). Curiosamente, alguns dos genes e vias que influenciam respons comportamentaises para etanol em moscas também têm sido implicados em comportamentos relacionados com etanol roedores e / ou R humano (por exemplo, ^6-14). A conservação dos mecanismos de condução comportamentos relacionados com o etanol em toda a espécie, juntamente com o conjunto de ferramentas genéticas disponíveis no sistema modelo de Drosophila, ressaltam a utilidade do modelo mosca da fruta para investigar a genética de respostas comportamentais ao etanol.

Sensibilidade e tolerância ^15,16 (revisto em ¹⁷⁾ ao etanol em seres humanos está associada com o desenvolvimento de AUD. Ambas as respostas comportamentais ao etanol pode ser modelado em moscas através de uma variedade de ensaios laboratoriais (revisto em ^3,4). Todos os ensaios de mosca conhecidos para os autores são baseados quer dependente do tempo induzida pelo etanol sedação / ou descoordenação recuperação dependente do tempo a partir de etanol sedação.

Em um artigo anterior do nosso grupo sobre a genética da sensibilidade etanol e rtolerância APID em Drosophila, um ensaio comportamental, baseada em etanol sedação induzida por vapor de moscas foi utilizado ^18. Testes neste ensaio foi iniciado através da transferência de adulto vivo voa sem anestesia para esvaziar frascos alimentares, aprisionando as moscas em frascos com um tampão de acetato de celulose, adição de etanol para a parte superior (ou seja, o lado não-fly) do tampão de acetato de celulose, e selando o frasco contendo moscas, plugue de acetato de celulose e de etanol com uma rolha de silicone (ver esquema na figura S3, Referência ^18). Vários frascos que representam diferentes grupos de moscas foram avaliados em paralelo, aumenta o rendimento do presente ensaio. Os frascos foram dadas um código anônimo e experimentadores ficaram cegos para grupo de tratamento para evitar viés não intencional na avaliação da sedação. Numa experiência normal, moscas em frascos foram bate-se suavemente a intervalos de 6 min e, após uma recuperação de 30 seg, o número de moscas sedados em cada frasco foi contado e Converted para moscas por cento ativos. Moscas absorvida vapor de etanol a partir do tampão de acetato de celulose de uma maneira dependente do tempo, causando aumentos progressivos em etanol interna ¹⁸ e sedação (cf referência ¹⁸ e Figura 1A e 1B neste relatório). Sedação neste ensaio foi definida operacionalmente como moscas (i) que está na ausência de curta ou (ii) que encontra-se em suas costas com ou sem bater as asas. Aqui, este ensaio de sedação etanol é descrita em detalhe, uma maior optimização operacional relevante para usá-lo é fornecido, e o ensaio é utilizado para tratar a contribuição de opções de suplementação de alimentos sobre a sensibilidade mosca sedação.

Protocolo

1. Day Before Assay

1. Recolha voa em frascos de alimentos frescos em grupos de 11 (do mesmo sexo), sob breve (1-5 min) CO _2.
2. Permitir moscas para recuperar S / N em frascos de alimentos num espaço de ambiente controlado (tipicamente 25 ° C, 60% de humidade relativa, 12 horas de luz / escuridão).
3. Preparar a solução de (s) diluindo etanol puro (100%) em etanol purificado (≥18 mohms) de água para a concentração (s) final adequada para a experiência planeada. Permitir que a solução (s) para voltar à TA O / N.
   Nota: Diluição de etanol é exotérmica.

2. Dia de Ensaio

1. Para cada frasco de moscas para ser testado, preparar (i) um frasco vazio alimentos limpo; ou seja, testes de frasco, (ii) uma nova ficha de acetato de celulose, (iii) uma rolha de silicone e (iv) 1 ml de solução de etanol (ver Tabela 3).
2. Prepare a sala de ensaio, ajustando a temperatura de 20-25 ° C e humidade relativa de 55-65%.
3. Já um outro trabalhadoratribuir um código único para cada grupo de frascos e registrar o código para mais tarde. Coloque frascos codificados com moscas na sala de testes para se aclimatar para poucos min.
4. Rotular frascos vazios de teste para coincidir com códigos em frascos de voar a partir de 2.3.
5. Construir um log de ​​teste impressa, digitando os códigos em colunas (uma coluna / frasco) em uma planilha semelhante à Tabela 1.
6. Usando o log de teste como um guia, organizar frascos de alimentos codificados com moscas e frascos vazios de testes em matrizes correspondentes na sala de testes.
   Nota: Um número máximo razoável de frascos de testar é 24 (ou seja, 6 conjuntos de 4 frascos cada).
7. Transferência voa de frascos de alimentos em pareados / rotulados frascos de ensaio vazio e coloque imediatamente plugs de acetato de celulose em frascos de ensaio até plugs de acetato de celulose são 2 cm abaixo dos topos dos frascos.
8. A partir de agora, lidar com cada linha de quatro frascos como um conjunto em escalonados intervalos de 1 min.
9. Para a avaliação do tempo 0, segure cada frasco individualmente wom polegar eo indicador, bater suavemente sobre a mesa três vezes para bater as moscas para o fundo do frasco, esperar 30 segundos e depois contar o número de moscas que são imóveis / morto. Grave o número de moscas mortas / imóveis para cada frasco no tempo 0 min no log de teste impresso.
10. Comece contador de tempo de forma contínua no tempo 0 e começar imediatamente a adição de 1 ml de etanol para plugs de acetato de celulose nos frascos para a primeira linha / set de 4 frascos. Adicionar 1 ml de etanol para as velas de acetato de celulose nos frascos a intervalos de 5 seg na ordem em que irá ser testada. Adicionar etanol para os tampões de acetato de celulose em um movimento circular de modo que o etanol é absorvido uniformemente ao longo dos tampões de acetato de celulose. Quando o etanol foi adicionado a todos os 4 frascos de ensaio no conjunto, insira um plug silicone em cada frasco para selá-lo.
11. Às vezes 1, 2, 3, 4 e 5 min, adicionar 1 ml de etanol para o segundo, terceiro, quarto, conjuntos, quinto e sexto de 4 frascos, respectivamente. Continue inserir rolhas de silicone apósadição de etanol para cada conjunto de 4 frascos.
12. Em vez de 6 min, testar o primeiro conjunto de quatro frascos de agarrar cada frasco com o polegar eo dedo indicador, batendo suavemente na mesa três vezes para bater as moscas para o fundo do frasco, de espera de 30 segundos e, em seguida, a contagem e registo do número total de moscas que estão sedados. Score voa tão sedado se (i) estar no chão do frasco, mas não andam ou (ii) se situam em suas costas com ou sem bater as asas.
13. Lidar com cada frasco dentro do conjunto em intervalos de 5 seg usando o cronograma na Tabela 2.
14. Às vezes, 7, 8, 9, 10 e 11 min, testar as segunda, terceira, quarta, quinta e sexta séries de frascos, respectivamente, como é feito com o primeiro set.
15. Em tempo de 12 min, testar o primeiro conjunto de 4 frascos novamente como descrito em 2.12 e continuar testando o segundo terceiro, quarto sets, quinto e sexto de frascos em 13, 14, 15, 16 e 17 min, respectivamente.
16. Continuar ensaio moscas como descrito em 2,12 até que todas as moscas são sedated.
17. Digite o número total de moscas em cada frasco no log de testes cópia impressa. Censor moscas imóveis / mortas no tempo 0 a partir do número total de moscas.
18. Calcular a percentagem de moscas ativas em cada tempo de ponto de avaliação e dados de enredo como% moscas ativas (eixo y) em função do tempo (eixo-x). Quantificar sedação etanol interpolando Sedação Tempo 50 valores (ST50, tempo para 50% sedação) de terceira ordem curva polinomial ou sigmoidal encaixa ou área de cálculo sob a curva.
19. Compilar dados de frascos decodificados e realizar análises estatísticas (por exemplo, one-way ANOVA com Bonferroni teste de comparação múltipla) conforme apropriado para o projeto experimental.

Resultados

Os dados em bruto a partir de etanol neste ensaio de sedação são os números de moscas que são sedados como uma função do tempo de exposição ao vapor de etanol. Os dados em bruto são convertidos para as moscas por cento ativos como uma função do tempo (dados primários, as Figuras 1A, B, D - F). Sensibilidade para sedação de etanol a partir dos dados primários podem ser quantificados como sedação 50 Tempo (ST50), o tempo necessário para que 50% das moscas de se tornar sedado aea ou sob a ...

Discussão

Ensaios simples que reproducibly quantificada fenótipos significativas são de grande valor para a análise do comportamento. O trabalho descrito aqui aborda vários aspectos práticos de um ensaio para medir a sensibilidade sedação etanol e tolerância rápida em Drosophila. Apesar de não ser um foco deste trabalho, análises de comportamento são facilitadas pela manutenção do ambiente e genético constante fundo para indivíduos de teste dentro de um estudo. Além disso, comparações devem tipicamente ser feita entre os...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
frascos para alimentos	VWR	89092-772	estreito
Flugs	Genesee/flystuff.com	49-102
rolha estreita de silicone	Fisher Scientific	09-704-1l	#4
etanol	Pharmaco-Aaper	111000200	200 prova