Aqui apresentamos um protocolo descrevendo ex oxigenado máquina de perfusão in situ de enxertos de doadores de fígado. Este artigo contém um passo a passo protocolo de adquirir e preparar o enxerto de fígado para a máquina de perfusão, preparar o líquido de perfusão, privilegiada a máquina de perfusão e executar oxigenado máquina de perfusão normotérmica do enxerto de fígado.
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Artigo de método
Ex Situ Normotérmica máquina de perfusão de fígados doados
Neste artigo
Resumo
Resumo
Em contraste com a preservação frio estática convencional (0-4 ° C), à saída da máquina de perfusão in situ pode proporcionar uma melhor preservação dos fígados de doadores. Perfusão contínua de órgãos proporciona a oportunidade para melhorar a qualidade de órgãos e permite a avaliação de viabilidade ex situ de fígados de doadores antes do transplante. Este artigo de vídeo fornece um protocolo passo-a-passo por ex situ máquina de perfusão normotérmica (37 ° C) de fígados de dadores humanos utilizando um dispositivo que fornece uma pressão e temperatura controlada pulsátil de perfusão da artéria hepática e perfusão contínua da veia porta. O fluido de perfusão é oxigenado pelo oxigenador de membrana de fibra duas ocas e a temperatura pode ser regulada entre 10 ° C e 37 ° C. Durante a perfusão, a actividade metabólica do fígado, bem como o grau de lesão pode ser avaliada através de análises bioquímicas de amostras colhidas a partir do fluido de perfusão. Máquina de perfusão é uma ferramenta muito promissorapara aumentar o número de fígados que são adequados para transplantação.
Introdução
O actual método de preservação de órgãos em transplante de fígado é lavar com e posterior armazenamento de fígados de doadores no frio (0-4 ° C) fluido de conservação (como University of Wisconsin solução ou solução de histidina-triptofano-Ketoglutarate). Este método é conhecido como armazenamento a frio estático (SCS). Embora a taxa metabólica de fígado a 0-4 ° C é muito baixo, existe ainda a procura de / min / g de tecido de fígado de 0,27 umol de oxigénio, o que não pode ser fornecida durante uma SCS. O método convencional de SCS, portanto, resulta em algum grau de lesão (adicional) de fígados de doadores. Embora este montante do prejuízo preservação não é um problema em fígados de doadores de boa qualidade, ele pode se tornar um fator crítico e limitando em fígados sub�timas que já sofreram algum grau de lesão no doador. Por esta razão, fígados com qualidade abaixo do ideal ou chamados critérios estendida doadoras (ECD) fígados são freqüentemente rejeitados para transplante como o rei de riscof falha precoce do enxerto é considerado demasiado elevado. Altas taxas de função retardada do enxerto, não-função primária, e estenose biliar não-anastomóticas (NAS) foram descritos nos receptores de fígados de doação após a morte circulatório (DCD), os doadores mais velhos ou beneficiários de enxertos esteatóticos 2. NAS são uma das principais causas de morbidade e mortalidade após transplante de fígado. NAS pode ocorrer em ambos os canais biliares extra-doador e intra-hepáticos e pode ser acompanhada pela lama biliar intraductal e formação de fundido de 3,4. Embora a etiologia da NAS é pensado para ser multifactorial, lesão de isquemia / reperfusão dos ductos biliares durante a preservação do enxerto e transplante tem sido identificada como um importante mecanismo subjacente 2,5. O transplante de um enxerto DCD foi identificada como um dos factores de risco mais fortes para o desenvolvimento do NAS. A combinação de um período de isquemia quente em um doador DCD, isquemia fria durante preservação de órgãos, e reperfusão subsequentelesão no receptor é pensado para ser responsável pela lesão irreversível das vias biliares, o que, em combinação com uma baixa capacidade de regeneração dos ductos biliares, resulta em cicatrização fibrótica e estreitamento das vias biliares, após o transplante de fígado 2,5. NAS têm sido relatados em até 30% dos pacientes que receberam um fígado DCD 6-8. Tornou-se claro que o método actual de SCS de enxertos para transplantação de fígado é insuficiente para fígados de DPI preinjured tais como aqueles a partir de doadores de DCD. Os métodos alternativos são necessários para aumentar e otimizar a utilização de fígados de DPI para transplante.
Máquina de perfusão (MP) é um método de conservação de órgãos que podem proporcionar uma melhor preservação de órgãos de dadores, em comparação com SCS. MP pode ser especialmente relevante para a preservação dos enxertos de DPI. Uma vantagem importante da MP é a possibilidade de fornecer oxigénio ao enxerto durante o período de conservação. MP pode ser realizado a várias temperaturas,que tenham sido classificadas como hipotérmica (0-10 ° C), subnormothermic (10-36 ° C) e normotérmica (36-37 ° C) Ponto de fusão (NMP). Dependendo da temperatura utilizada para o MP, o tipo de líquido de perfusão tem de ser ajustado e com o aumento da temperatura mais oxigénio deve ser fornecido. A primeira aplicação clínica de MP no transplante de fígado humano foi baseado em perfusão hipotérmica sem oxigenação activa do fluido de perfusão 9,10. Em modelos animais, MP oxigenado hipotérmico (0-10 ° C) tem mostrado ter efeitos protectores contra a isquemia / reperfusão do fígado enxertos 11 e para proporcionar uma melhor preservação do plexo vascular peribiliary da bílis condutas 12. Subnormothermic MP oxigenada a 20 ° C ou 30 ° C também tem sido estudado em modelos animais e foi mostrado para fornecer recuperação anterior da função do enxerto de fígado de DCD, em comparação com 13,14 SCS. A viabilidade de subnormothermic MP oxigenado de fígados humanos foi rectemente relatada numa série de sete doadores descartados fígados humanos 15. NMP (37 ° C) permite a avaliação da viabilidade do enxerto e funcionalidade antes do transplante 16,17. Além disso, permite a MP reaquecimento gradual do enxerto antes da transplantação de fígado, o que foi demonstrado para facilitar a recuperação e reanimação do enxerto 18.
O dispositivo de perfusão utilizado no protocolo de corrente para máquina de perfusão hepática dupla permite a perfusão (através da veia porta e da artéria hepática) utilizando duas bombas centrífugas, que proporcionam um fluxo portal contínuo e um fluxo arterial pulsátil. O sistema é controlado por pressão, permitindo a auto-regulação do fluxo através do fígado, dependendo da resistência intra-hepática. Dois oxigenadores de membranas de fibras ocas para permitir a oxigenação do enxerto de fígado, bem como para a remoção de CO 2. A temperatura pode ser regulada com base no tipo pretendido de MP (temperat mínimo ure de 10 ° C). Fluxo, pressão e temperatura são exibidas no dispositivo em tempo real, permitindo um controlo contínuo do processo de perfusão. Um novo conjunto descartável estéril de tubos, reservatório e oxigenadores está disponível para a perfusão de cada enxerto (Figura 1).
O objetivo deste artigo de vídeo é fornecer um passo a passo para o protocolo ex situ máquina de perfusão normotérmica dos fígados de doadores humanos usando esta máquina de perfusão de fígado recém-desenvolvido.
Figura 1: (A) Um desenho esquemático, (B) uma foto da máquina de perfusão, (C) uma visão mais próxima do oxigenador, e (D) da bomba centrífuga usada para a perfusão normotérmica dos fígados de doadores humanos.obter = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica (Medisch Ethische Toetsingscommissie) do Centro Médico da Universidade de Groningen, na Holanda.
1. Preparação do líquido de perfusão
Nota: O volume total do fluido de perfusão preparado para perfusão normotérmica máquina de acordo com este protocolo é 2233 ml e a osmolaridade alvo do fluido de perfusão foi de 302 mOsmol / L.
- A partir dos componentes do fluido de perfusão descrito na Tabela 1, manter as células vermelhas do sangue humano embalado, plasma fresco congelado e albumina humana separada. Misturar o resto dos componentes de uma forma estéril e armazenar a solução em um saco estéril para o transporte para a sala de operações (OR). Faça isso em um ambiente estéril (o ideal é uma boa academia de Práticas de Fabricação) ou numa câmara de fluxo laminar em uma sala de cultura.
| Componentes | Quantidade |
| Glóbulos vermelhos embalados (hematócrito 60%) | 840 ml |
| O plasma fresco congelado | 930 ml |
| A albumina humana a 200 g / L (Albuman, Sanquin) | 100 ml |
| Nutrição parenteral de modificação (Clinimix N17G35E, Baxter International Inc.) | 7,35 ml |
| Multivitaminas para perfusão (Cernevit, Baxter International Inc.) | 7 ul |
| Oligoelementos concentrada para perfusão (Nutritrace, Laboratórios B. Braun) | 7,35 ml |
| Metronidazol para administração IV (5 mg / ml) (Flagyl, Sanofi-Aventis) | 40 ml |
| Cefazolin balão de 1.000 mg 5 ml pó para administração intravenosa (Servazolin, Sandoz) | 2 ml |
| Insulina de actuação rápida (100 UI / ml) (Actrapid®, Novo Nordisk) | 20 ml |
| Glubionato de cálcio, solução intravenosa 10%, 137,5 mg / ml (Sandoz) | 40 ml |
| H 2 O esterilizada | 51,3 ml |
| De NaCl 0,9% de solução de | 160 ml |
| Solução de bicarbonato de sódio 8,4% | 31 ml |
| Heparina 5000 IE / ml para administração intravenosa | 4 ml |
| Total | 2233 ml |
Tabela 1: Components do fluido de perfusão 16.
- Transferência humano embalado células vermelhas do sangue (840 ml), plasma congelado fresco (930 ml), albumina humana a 200 g / L (100 mL) e a soluo preparada no passo 1.1 para o ou pode ser administrada ao dispositivo de perfusão.
2. Priming do aparelho de perfusão
- Adicionar os componentes do líquido de perfusão, incluindo as células vermelhas do sangue humano embalado, plasma fresco congelado, a albumina humana e a solução preparada no passo 1.1 para a máquina através do conector em cima dos oxigenadores e remover todas as bolhas de ar do tubo.
- Ligue a bomba venosa e siga as instruções do fabricante na tela. Em seguida, ligue a bomba arterial e siga as instruções do fabricante na tela.
- Null O medidores de pressão contra a pressão atmosférica, seguindo as instruções na tela. Isto assegura que a pressão medida durante os perfusião é a pressão real no nível da veia porta e da artéria hepática.
- Iniciar a oxigenação usando carbogénio (95% O2 + 5% de CO 2), a uma taxa de fluxo de 4 L / min. O fluxo de ar será dividido entre os dois oxigenadores (2 L / min por oxigenador) e isso deve resultar em uma pO 2 de cerca de 60 kPa (ou 450 mmHg) no fluido de perfusão. Para perfusões mais longos, é aconselhável a utilização de fontes separadas de oxigénio e dióxido de carbono. Isto permite pequenos ajustes na razão O2 / CO2, que podem ser utilizados para ajustar o pH e pCO2 do líquido de perfusão.
- Tomar uma amostra de perfusão para a medição de gases no sangue 15-20 minutos após o dispositivo foi preparado e monitorar o pH e eletrólitos em conformidade.
NOTA: Certifique-se de descartar cerca de 3 ml de líquido de perfusão antes de tomar as amostras, como esse fluido é na tubulação periférico e não representa o fluido de perfusão no sistema. Adicionar um 8,4% de bicarbonato de sódio sOlution para capacidade de tamponamento, apontando para um pH fisiológico (7,35-7,45). Por exemplo, adicionar 25-35 ml de uma solução de bicarbonato de sódio a 8,4% e verificar os níveis de pH e bicarbonato no líquido de perfusão, tomando amostras de sangue para a medição de gás em intervalos regulares.
3. Aquisição e Preparação de fígados doados
Nota: Adquirir o órgão usando a técnica padrão de resfriamento no local e expulsar com a preservação do fluido frio (0-4 ° C) 19. Para facilitar a canulação da artéria, deixou um segmento da aorta supratruncal ligada à artéria hepática (Figura 2A).
- Lave os ductos biliares com o fluido de conservação (ou seja, da Universidade de Wisconsin solução). Ligadura do ducto cístico com uma sutura cirúrgica.
- Embalar e armazenar o órgão em um saco padrão órgão do doador estéril e caixa com gelo picado para o transporte subsequente para o centro da MP.
- Começoo procedimento tabela de volta imediatamente após a chegada do fígado do doador em sala cirúrgica.
- Retirar uma amostra de pelo menos 10 ml de fluido de conservação para os testes microbiológicos.
- Remover os anexos do diafragma para a área nua do fígado, bem como qualquer músculo cardíaco restante do punho superior da veia cava com tesouras cirúrgicas.
- Dissecção da artéria e veia portal usando dissecação tesouras e ramos laterais ligar utilizando suturas cirúrgicas ou hemoclips.
- Fechar a extremidade distal do segmento de aorta supratruncal usando uma sutura de monofilamento não absorvível (por exemplo, 3-0 Prolene). Inserir a cânula arterial para dentro da extremidade proximal da aorta supratruncal e seguro com suturas (Figura 2A). Utilizar a cânula fornecido no pacote descartável tal como é fornecido pelo fabricante do aparelho de perfusão.
- Insira a cânula venosa na veia porta e segura com suturas. Utilizar a cânula fornecida nas dispospacote capaz. A veia hepática permanece canulados.
- Lave o ducto biliar com a solução de preservação. Inserir um cateter de silicone para o ducto biliar e prenda com suturas.
NOTA: Não insira o cateter muito profundamente no ducto biliar, pois isso pode causar danos ao epitélio biliar. - Lave o fígado com solução de NaCl a 0,9% através da cânula da veia porta como se segue:
- Se o enxerto foi preservada na Universidade de Wisconsin solução como solução de conservação, expulsar o fígado com 2,000 mL de (C 0-4 °) de solução de NaCl a 0,9% frio seguido por 500 ml de água morna (37 ° C) 0,9% de NaCl solução.
- Se o enxerto tenha sido preservados em solução de histidina-triptofano-cetoglutarato como a solução de conservação, expulsar o fígado com 1,000 mL de (C 0-4 °) de solução de NaCl a 0,9% frio seguido por 500 ml de água morna (37 ° C) 0,9 solução% de NaCl. O efeito da descarga quente é para evitar uma queda significativa na temperatura dalíquido de perfusão.
- Execute o flush quente imediatamente antes de ligar o fígado para o dispositivo de perfusão.
NOTA: Mantenha sempre a duração entre rubor quente e início do NMP a menos de 1-2 min.
| Características do dador (n = 12) | Número (%) ou médio (IQR) |
| Idade (anos) | 61 (50-64) |
| Género masculino) | 8 (67%) |
| Tipo de doador DCD, Maastricht tipo III DBD | 10 (83%) 2 (17%) |
| Índice de massa corporal (IMC) | 27 (25-35) |
| Motivo de recusa DCD + idade> 60 anos DCD + IMC elevado DCD + várias razões * Esteatose severa | 5 (41%) 3 (25%) 2 (17%) /> 2 (17%) |
| Solução de preservação Solução UW Solução HTK | 6 (50%) 6 (50%) |
| Doador tempo de isquemia quente em DCD (min) | 14 (17-20) |
| Tempo de isquemia fria (min) | 389 (458-585) |
| Índice de risco de Doadores (DRI) | 2,35 (2,01-2,54) |
Tabela 2: Doadores características * história de doadores de abuso de drogas por via intravenosa por um doador do enxerto e prolongada sO 2 <30% após retirada de suporte de vida para outro enxerto.. Abreviaturas: DCD, doação após a morte circulatório; DBD, doação após morte encefálica; UW, da Universidade de Wisconsin; HTK, histidina-triptofano-cetoglutarato
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Figura 2: (A) Retratos de um enxerto de doador humano que foi preparado na mesa de volta e (B - D) foi posteriormente perfusão normotérmica. (A) A cânula arterial é inserido na aorta e surpratruncal da cânula venosa é inserida na veia porta. O ducto biliar é canulada com um cateter de silicone biliar. (B) O fígado é posicionada na câmara de órgãos com a sua face anterior virada para baixo e cânulas são ligadas aos tubos do aparelho de perfusão. (C) 30 min após o início da perfusão máquina normotérmica. (D) de 6 horas após o início da perfusão máquina normotérmica. Durante o funcionamento da câmara de órgão é coberto por uma cobertura transparente para manter um ambiente húmido estéril para o fígado (não representada nestas figuras)."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Normotérmica máquina de perfusão
- Posicionar o fígado na câmara de órgãos com a superfície anterior voltada para baixo. Ligar-se imediatamente o fígado para o aparelho de perfusão com iniciador ligando a cânula na veia portal para o portal de entrada do tubo do dispositivo de perfusão e da cânula arterial para o tubo de entrada arterial do dispositivo.
- Iniciar a perfusão de ambos os lados portal e arterial, seguindo as instruções do fabricante na tela. Defina a pressão arterial média em 70 mmHg ea pressão venosa portal média de 11 mmHg.
- Tome amostras de fluidos de perfusão a cada 30 minutos para a análise imediata dos parâmetros de gás de sangue (PO 2, PCO 2, SO 2, HCO 2 - e pH) e parâmetros bioquímicos (glicose, cálcio, lactato, potássio e sódio) usando um analisador de gases de sangue convencional . Certifique-se de descartar cerca de 3 ml de perfusãofluido antes da colheita das amostras, como este é fluido na tubagem periférica e não representa o líquido de perfusão no sistema.
- Para tomar estas amostras de aspirar o fluido de perfusão utilizando uma seringa de 1 ml a partir dos conectores de amostragem, que fazem parte do conjunto de tubos descartáveis de o aparelho de perfusão. Para cada amostra de usar uma nova seringa e imediatamente remover quaisquer bolhas de ar da seringa após aspiração do líquido de perfusão. Em seguida, insira a seringa no analisador de gases no sangue e siga as instruções do fabricante fornecidas no manual do analisador.
- Recolha plasma a partir do fluido de perfusão, congelar e armazenar a -80 ° C para determinação da fosfatase alcalina (AlkP), gama-glutamil transferase (gama-GT), alanina aminotransferase (ALT), a ureia e bilirrubina total. Recolha plasma após 5 min de centrifugação do fluido de perfusão a 1.500 xg e 4 ° C.
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Resultados
12 fígados humanos que foram recusados para transplante devido a várias razões, foram utilizados após obtenção do consentimento informado para a investigação de famílias doadoras. Doadores características estão descritas na Tabela 2. Os fígados foram perfundidos doadores humanos normotérmica durante 6 horas, utilizando o protocolo descrito no presente documento. A qualidade dos enxertos de fígado foram avaliados através da monitorização da homogeneidade macroscópica de perfusão do fígado (Figu...
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Discussão
Este vídeo fornece um passo a passo para o protocolo máquina de perfusão normotérmica dos fígados de doadores humanos usando um dispositivo que permite a pressão controlada dupla perfusão através da veia artéria e porta hepática. Ao seguir este protocolo, as falhas técnicas da máquina de perfusão não ocorreu e todos os enxertos foram bem perfundidos e bem oxigenado. Os fígados perfundidos ex situ tinha hemodinamicamente estáveis e foram metabolicamente activo, tal como definido pela produção de bílis 16,...
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Divulgações
Os autores deste manuscrito não haver conflito de interesse de divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho de pesquisa foi financiada por doações fornecidos por Innovatief Actieprogramma Groningen (IAG-3), Jan Kornelis de Cock Stichting e Tekke Huizingafonds, todos na Holanda. Estamos agradecidos a todos os coordenadores de transplante holandeses para identificar os potenciais descartado fígados e obtenção de consentimento informado.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Assistência Hepática | Assistência Orgânica | OA. Li.Li.140 | Dispositivo de perfusão |
| Liver Assist pacote descartável | Organ Assist | OA. Li.DP.540 | Conjunto descartável e cânulas |
| Meredith No.8 | Vygon Nederlands B.V. | 1362082 | Cânula do ducto biliar Albumina |
| humana 200 g/L / ALBUMAN | Sanquin | 15522598 | 100 ml |
| Nutrição parenteral modificada | Baxter Nederland B.V. | N14G30E | de 7,35 ml |
| / CERNEVIT | Baxter International Inc. | 9800927 | 7 μ l |
| Oligoelementos concentrados para perfusão / NUTRITRACE | B. Braun Melsungen AG | 14811332 | 7,35 ml |
| Metronidazol 5 mg/ml | Baxter Nederland B.V. | 98181882 | 40 ml |
| de cefazolina / SERVAZOLIN | Sandoz B.V. | 15611337 | 2 ml |
| Insulina de ação rápida | vários fornecedores | 20 ml | |
| Glubionato de cálcio, solução intravenosa 10%, 137,5 mg/ml | Sandoz | 97038695 | 40 ml |
| Estéril H2O | Fresenius Kabi Nederland B.V. | 98084453 | 51,3 ml |
| NaCl 0,9% | Baxter Nederland B.V. | 15262510 | 160 ml |
| de heparina 5.000 IE/ml para administração intravenosa | LEO Pharma B.V. | 98026178 | 4 ml |
| de bicarbonato de sódio 8,4% | B. Braun Melsungen AG | 97973874 | A quantidade depende do pH |
| Concentrado de glóbulos vermelhos (em SAGM) | Banco de sangue (Sanquin) | N0012000 | 750 ml |
| Plasma fresco congelado | Banco de sangue (Sanquin) | N04030A0/N04030B0 | 900 ml |
Referências
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Reimpressões e permissões
