Oxigênio-Glucose Privação e reoxigenação como um<em&gt; In Vitro</em&gt; Isquemia e reperfusão Lesão modelo para estudar Disfunção Barreira Hematoencefálica

Resumo

A lesão de isquemia-reperfusão (RI) está associada a uma alta taxa de morbidade e mortalidade. O objetivo do modelo in vitro de privação e reoxigenação de oxigênio-glicose (OGD-R) descrito aqui é avaliar os efeitos da lesão de isquemia e reperfusão em uma variedade de células, particularmente em células endoteliais da barreira hematoencefálica (BHE).

Resumo

Isquemia e reperfusão (IR) lesão é conhecido por contribuir significativamente para a morbidade e mortalidade associadas com acidentes vasculares cerebrais isquêmicos. Acidentes vasculares cerebrais isquêmicos são responsáveis ​​por 80% de todos os acidentes vasculares cerebrais. Uma causa comum de lesão de IR é o rápido ingresso de fluidos após uma oclusão crónica / aguda de sangue, os nutrientes, oxigénio ao tecido provocando a formação de radicais livres.

Acidente vascular cerebral isquémico é seguido pela barreira sangue-cérebro (BBB) ​​e disfunção vasogénico edema cerebral. Estruturalmente, as junções apertadas (TJS) entre as células endoteliais desempenham um papel importante na manutenção da integridade da barreira sangue-cérebro (BBB). IR lesão é uma lesão secundária precoce conduz a uma resposta não específica, inflamatória. Estresse oxidativo e inflamação metabólica seguinte desencadeia dano cerebral secundário, incluindo a certificação permeabilidade e perturbação da junção apertado integridade (TJ).

Nosso protocolo apresenta in vitro </ Em> exemplo de privação de oxigênio-glucose e reoxigenação (OGD-R) em células endoteliais cérebro de rato integridade TJ e formação de fibras de stress. Actualmente, vários experimental em modelos in vivo são utilizados para estudar os efeitos da lesão de IR; no entanto eles têm várias limitações, como os desafios técnicos na realização de cirurgias, gene influências moleculares dependentes e dificuldade em estudar as relações mecanicistas. No entanto, em modelos in vitro pode ajudar a superar muitas destas limitações. O protocolo apresentado pode ser usado para estudar os mecanismos moleculares e várias relações mecanísticos para proporcionar potenciais estratégias terapêuticas. No entanto, os resultados de estudos in vitro pode ser diferente da padrão em estudos in vivo e deve ser interpretado com cautela.

Introdução

A isquemia-reperfusão (IR) é encontrada lesão a ser a causa frequente de diversas complicações debilitantes e mortes associadas com acidente vascular cerebral, enfarte do miocárdio, trauma, doença vascular periférica e lesão cerebral traumática ^1,2. IR lesão em vasos cerebrais é uma lesão secundária precoce levando a inflamação e edema ^3. Uma das complicações graves que ocorrem como um resultado de stress oxidativo e metabólica seguinte inflamação é a perda de equilíbrio homeostático que conduz à formação de radicais livres, alterações na barreira sangue-cérebro (BBB) ​​junções apertadas (TJs) e permeabilidade microvascular ^4,5.

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Protocolo

1. Plantio de células endoteliais

1. Obter culturas primárias de RBMEC de adultos a partir de ratos Sprague Dawley (ou obtê-los comercialmente).
2. Cultivar RBMECs em 100 centímetros fibronectina (50 ug / ml) placas de petri revestidas usando o cérebro de rato meio de crescimento de células endoteliais. Mudar a forma de dois em dois dias, até que seja atingida a confluência.
3. Ao chegar a 80-90% de confluência, lavar suavemente as células em 5 ml de solução salina de fosfato tamponada (PBS), através de agitação. As células são, então, separado por expondo-os a um ml de solução quente de 0,25% tripsina ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), equ....

Resultados

Células cultivadas em pré-revestidas fibronectina lâminas de câmara Nunc II foram submetidos a OGD-R, colocando em um modelo de 110 câmara Biospherix ProOx. Após sujeitar as células a OGD-R, que foram processados ​​para ZO-1 coloração juncional utilizando a técnica de imunofluorescência, conforme mostrado na Figura 2 e montagem do citoesqueleto indicando a formação de fibras de stress de actina F usando etiqueta mancha rodamina faloidina como mostrado na Figura 3. As células de controlo.......

Discussão

OGD-R como um modelo in vitro para a lesão de isquemia-reperfusão tem sido bem estabelecido para o estudo de neurónios ^10,11. Existem também estudos que mostram o efeito de OGD em células endoteliais cerebrais e alterações na permeabilidade e TJ integridade ^9. No entanto, o nosso estudo mostra o efeito de OGD, bem como reoxigenação, que é uma representação mais próxima da lesão de reperfusão isquémica em condições in vivo que ocorrem após acidente vascular cerebral isquémico.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Proox modelo 110	Biospherix	Modelo 110
DMEM, sem glicose	Gibco, Life technologies	11966-025
Rodamina Faloidina	Life technologies	R415
ZO-1 Anticorpo Policlonal para Coelho	Life technologies	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8  bem estéril, vidro  slides	Anticorpo	com FITC da
FITC	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	Qualquer outro PBS disponível pode ser usado

secundário anti-coelho marcado Thermo scientific 177402