Morris Water Maze Teste: Otimização para Mouse e Strain Testing Ambiente

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo de labirinto aquático de Morris (MWM) adaptado para uso com um modelo de camundongo comumente usado da doença de Alzheimer. O MWM é amplamente utilizado em modelos de camundongos transgênicos. A implementação de um procedimento sensível à tensão de fundo do modelo de camundongo é essencial para detectar diferenças de grupo.

Abstract

O labirinto aquático de Morris (MWM) é uma tarefa comumente usada para avaliar o aprendizado espacial dependente do hipocampo e a memória em modelos de doenças em camundongos transgênicos, incluindo distúrbios neurocognitivos, como a doença de Alzheimer. No entanto, a cepa de fundo do modelo de camundongo usado pode ter um efeito substancial no fenótipo comportamental observado, com algumas cepas exibindo capacidade de aprendizado superior em relação a outras. Para garantir que as diferenças entre camundongos transgênicos negativos e transgênicos positivos possam ser detectadas, a identificação de um procedimento de treinamento sensível à cepa de fundo é essencial. A falha em adaptar o protocolo MWM à tensão de fundo do modelo de camundongo pode levar a treinamento insuficiente ou excessivo, mascarando assim as diferenças de grupo nos testes de sonda. Aqui, um protocolo MWM adaptado para uso com o fundo F1 FVB / N x 129S6 é descrito. Esta é uma cepa de fundo frequentemente usada para estudar os efeitos dependentes da idade do mutante P301L tau (camundongos rTg (TauP301L) 4510) nos déficits de memória associados à doença de Alzheimer. Também é descrita uma estratégia para reotimizar, conforme ditado pelo ambiente de teste específico utilizado.

Introduction

Modelos de ratinhos transgénicos têm sido fundamentais para avaliar a patofisiologia da doença de Alzheimer (AD), assim como o potencial de intervenções terapêuticas. Tarefas cognitivas, tais como o labirinto de água de Morris (MWM), são comumente usados ​​com estes modelos para identificar as correlações moleculares de défices de memória e para avaliar a eficácia de drogas pré-clínicos. É essencial, no entanto, que o intervalo dinâmico da tarefa cognitiva ser grande o suficiente para detectar os efeitos do tratamento subtis. Com modelos do rato do AD, déficits cognitivos são tipicamente dependente da idade, e camundongos exibir declínios progressivos no desempenho (por exemplo, ^1). Uso de uma tarefa cognitiva sensível pode permitir a detecção de diferenças subtis no início da vida do animal, reduzindo assim os custos associados com os animais de envelhecimento. Por exemplo, a redução do número de ensaios de formação nos Barnes dependente do hipocampo labirinto 15-5 aumentado a dificuldade da tarefa, resultando na detection de déficits no modelo 3xTg em uma idade mais cedo do que anteriormente relatados ^2. A detecção precoce de défices não só oferece um tempo considerável e economia de custos, mas também aumenta a probabilidade de que as alterações moleculares subjacentes défices cognitivos podem ser identificados.

Um fator que influencia a sensibilidade de tarefas cognitivas é o fundo genético estirpe do modelo do rato. Por exemplo, ratinhos BALB / c, exibem um desempenho superior em tarefas de aprendizagem e memória em comparação com outras estirpes, tais como o C57BL / 6 ^3. A F1 FVB / N x 129S6 fundo é utilizado para dois dos modelos mais utilizados de AD, o Tg2576 e RTG (TauP301L) 4.510 modelos. Esta estirpe exibe superiores capacidade de aprendizagem na MWM em relação a outras estirpes, incluindo B6 / SJL ^4. Devido a esta capacidade de aprendizagem superior, o uso de uma única sonda após o treinamento extensivo pode mascarar diferenças entre os grupos resultantes de excesso de treinamento. Além disso, o sensitivity de ensaios de sondagem pode ser dependente da idade. Nós já haviam demonstrado que os ensaios anteriores da sonda, após o treinamento plataforma escondida limitado, são mais sensíveis às diferenças nas jovem Tg2576 em comparação com controles jovens da mesma ninhada de transgenes-negativos do que são ensaios sonda inserida após mais extensa formação ^5. Em contraste, os ensaios seguintes sonda extensa formação são mais sensíveis em mais velho (20-25 meses) ratinhos Tg2576 em comparação com ninhada são maiores de ensaios de sondas anteriores ^5. Por intercalando ensaios de sonda ao longo de formação, a probabilidade de que um ensaio sensível será identificado é aumentada, em particular se o teste é realizado longitudinal e a sensibilidade de um ensaio de sonda particular é dependente da idade. A Figura 1 mostra o desempenho superior de F1 FVB / N x camundongos 129S6 sob o protocolo otimizado para esta estirpe em comparação com os ratos do fundo B6 / SJL treinados sob um protocolo com a mais extensa formação.

A MWM égeralmente pensado para fornecer medidas confiáveis ​​que são reproduzíveis através do tempo e laboratórios ^6. Por exemplo, o protocolo primário usado originalmente por nosso laboratório ^1,7 Minnesota foi implementado com sucesso com pequenas modificações na West Virginia University ^8. Da mesma forma, níveis equivalentes de insuficiência foram observados em RTG (TauP301L) 4510 ratinhos relativamente ao controlo da mesma ninhada se alojados sob condições isentas de agentes patogénicos ou convencionais ^9. No entanto, o ambiente de teste pode influenciar a sensibilidade da tarefa MWM. Fatores como a iluminação da sala, saídas de ar, gradientes de temperatura e ruídos, tudo contribui para estímulos ambientais ⁴ que em última instância pode influenciar o desempenho. Quando nosso laboratório Minnesota e biotério foram transferidos para um novo prédio, uma redução de até 38% no desempenho do tipo selvagem foi observado, reduzindo substancialmente o alcance dinâmico da tarefa ea capacidade de detectar déficits relacionados ao transgene. Esta mudança no performance ocorreu apesar projetar a sala de ensaios para ser do tamanho e configuração equivalente, e usando as mesmas indicações visuais aplicados. Um "re-optimização" do protocolo original foi necessária para aumentar a gama dinâmica da tarefa MWM no novo ambiente de teste.

Aqui o protocolo original adaptado para uso com o F1 FVB / N x 129S6 fundo ⁵ está descrito. Uma vez que alguns estudos sugerem que o stress está associada com o mau desempenho MWM ¹⁰ e de pré-tratamento pode aliviar este défice induzido pelo stress no desempenho ^11, um protocolo pré-tratamento foi concebido para aclimatar os ratos para a introdução e a remoção da piscina antes do teste MWM . Na sequência de pré-tratamento, os ratos submetidos a treinamento plataforma visível, em que uma plataforma elevada é marcado com uma bandeira. Formação plataforma visível é usado para identificar os ratos com problemas de desempenho relacionadas a anormalidades sensório-motoras. Usando critérios de exclusão descritos no protseção OCOL, os ratos-desempenho incompetente são removidos exames subseqüentes de ensaios de formação de plataforma e de sondas escondidas. Deficiências em ensaios de formação de plataforma e de sondas escondidas são interpretados como déficits cognitivos porque o desempenho sensório-motor é fatorado fora dos dados. Após a conclusão da formação plataforma visível, os ratinhos começam treino na plataforma escondida onde a plataforma está submersa em água e mantém-se na mesma posição em relação aos estímulos externos. Ensaios em que a plataforma é removida (ensaios de sonda) são intercaladas ao longo treino na plataforma escondida para avaliar a influência do treinamento adicional. Porque os ensaios de sonda ocorrer no início de cada dia, antes do treino adicional plataforma escondida, os ensaios de sonda medir a capacidade do animal para se lembrar a localização da plataforma depois de uma demora de 20 horas, considerado como uma medida da memória de referência ^12. Finalmente, maneiras em que este protocolo original foi re-otimizado quando mudanças no ambiente de testedesempenho do controle interrompido são descritos.

Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos de acordo com as normas de cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) e aprovado pelo IACUC do West Virginia University.

1. Pré-tratamento

1. Set Up the Pool
   1. Prop a piscina de pré-tratamento de modo que é elevada a uma altura confortável.
   2. Coloque 2 L de água (21 ° C) na piscina pré-manipulação para um nível de cerca de 1 cm.
      Nota: Não adicionar corante.
2. Procedimento
   1. Traga os ratos provenientes do biotério para a sala de ensaios.
   2. Verifique se a identificação do sujeito (número de registro assunto, rabo tatuagem, clipe de orelha, etc.).
   3. Mark cauda do rato com um marcador permanente para distinguir os ratos dentro da gaiola que passaram por testes daqueles que ainda precisam ser testados pré-assistência. Marcar todos os ratos em cada gaiola com a mesma cor.
   4. Coloque um rato no copo de transferência para approximately 5 sec. Em seguida, despeje cuidadosamente o mouse para fora do copo na piscina pré-tratamento.
   5. Usando um temporizador, permitir que o rato permanecer na piscina durante 20 seg.
   6. Após 20 segundos, coloque delicadamente a colher (sem dobrando-lo) na frente do mouse. Resumidamente permitir que o mouse para explorar a colher, e se necessário, incentivar o mouse para pegar a colher, deslizando suavemente a colher sob o mouse, enquanto lentamente levantar. Tome cuidado para não assustar os ratos com a colher.
   7. Uma vez que o mouse está na colher, transportá-lo de volta para a jaula exploração.
   8. Repita estes procedimentos para cada rato na gaiola, uma vez por dia durante 10 dias. Em intervalos regulares (por exemplo, após cada animal), pegar fecal boli e roupa de cama da piscina usando uma rede.
   9. Lavar o copo de transferência com água em intervalos regulares (por exemplo, após a conclusão de uma gaiola de ratos).
   10. Quando essas etapas forem concluídas, lavar o copo de transferência com água várias vezes, despejar a água dea piscina, e lavar a piscina aproximadamente duas vezes com água.

2. Formação Plataforma Visible

1. Configuração do mouse Rastreamento Desempenho Software por exemplo Viewer (Veja a Tabela de Materiais).
   1. Calibrar o vídeo para corresponder às dimensões do labirinto sob a "Configuração" - "Filtros e Objectos" guia.
   2. Definir filtros para que o software pode diferenciar um rato do fundo.
      1. Ajuste a "sensibilidade" abaixo da área "filtro de fundo" para que o software de rastreamento identifica o animal.
      2. Clique na opção "aceitar" uma vez que o software de rastreamento identifica o animal. Escolha a opção "Editar" para apagão áreas fora da área do labirinto.
      3. Selecione a opção "Filtro animal" adequado e "min. tamanho do animal ".
2. Criando as Folhas de executar
   1. Criar uma folha corrida listando cada rato, cada local potencial, e um espaço para anotações contendo informações sobre o comportamento aberrante.
   2. Predetermine locais para o teste plataforma visível, que são as mesmas para cada grupo de ratinhos. Assim, para o primeiro ensaio, pré-determinar que a plataforma vai ser colocado no lado oposto ao onde o rato é colocado no labirinto, no lado direito perto da parede. Para o segundo ensaio, pré-determinar que a plataforma vai ser colocado num local diferente ao longo da parede de trás para cada rato e que este irá continuar para cada uma das seis ensaios.
3. Configurar o quarto
   1. Pendure cortinas ao redor da sala para que quaisquer pistas espaciais são obscurecidos.
4. Configurar o Tub.
   1. Coloque a banheira para que coincida com a configuração no software de monitoramento, assegurando o labirinto combina com a instalação de configuração em "Configuração" - aba "Zona Definition". Nota: hELPS para garantir a banheira é no local apropriado antes de preenchê-lo com água como a banheira não é facilmente realocados após o preenchimento.
   2. Encha a banheira com água da torneira, e usando um termômetro, garantir a temperatura da água é de aproximadamente 21 ° C. Certifique-se de que a água permanece dentro de um grau da temperatura ao longo do teste, como a água mais fria pode afetar o desempenho, especialmente quando utilizando camundongos com idade ^{de 8.}
      Nota: Não adicionar corante.
   3. Usando os locais predeterminados, colocar a plataforma, que tem uma bandeira montada que atinge uma altura de 13 cm e é de 4,5 cm por 4,5 cm de altura com uma negrito "S" em forma de caracteres em relevo sobre ela, no primeiro local da banheira, para que ele é de aproximadamente 1 polegada acima da superfície da água.
5. Procedimento
   1. Dê o primeiro mouse a partir da gaiola, verificar a identificação dos sujeitos, marcar a cauda usando um marcador permanente da cor correta, e coloque no copo.
   2. Delicadamente, coloque o mouse na banheira, iniciar o temporizador, e garantir que o software de monitoramento é o acompanhamento do animal. Permitir que o mouse até 2 min para localizar a plataforma. Uma vez que o rato localiza a plataforma, permitir que o rato 20 segundos sobre a plataforma.
   3. Se o animal encontra a plataforma e começa a saltar ou cair, colher o mouse e coloque o mouse sobre a plataforma. Se o mouse continua a saltar ou cair da plataforma, mantenha o mouse sobre a plataforma, de modo que o rato aprende que permanecendo na plataforma leva a fugir da banheira.
      Nota: O rato deve permanecer na plataforma durante um tempo combinado de 20 seg; assim, se o mouse salta fora após 5 segundos, a quantidade de tempo que resta na plataforma é de 15 segundos e não repõe a 20 seg.
   4. Se o animal não consegue encontrar a plataforma no período de 2 min, colher o rato e colocá-lo na plataforma por 20 s.
   5. Na sequência de 20 segundos na plataforma, retire o mouse a partir da plataforma como feito no treinamento pré-manipulação e coloque o mouse em the gaiola aquecida alinhado com toalhas de papel e aquecida até ~ 31 ° C através de uma almofada de aquecimento e lâmpada de calor durante 30 segundos. Efectuar a avaliação periódica da temperatura do corpo com um termómetro rectal para assegurar que certas estirpes de ratos ou ratinhos de uma certa idade não são diferencialmente suscetíveis à hipotermia induzida por exposição à água.
   6. Depois de 2 minutos para a jaula exploração com a lâmpada de aquecimento, transferir o mouse para a gaiola de exploração com apenas uma almofada de aquecimento, mas nenhum lâmpada de calor, para se recuperar entre ensaios. Eventualmente, coloque todos os ratos de uma gaiola única casa na mesma gaiola de retenção durante o ensaio.
   7. Limpe o labirinto de escombros com uma rede depois de cada rato foi concluído um estudo, para interromper pistas olfactivas.
6. Repita essas etapas para cada rato no grupo. Depois de cada rato foi concluída a primeira tentativa, mover a plataforma para o segundo local predeterminado.
   Nota: A plataforma permanecerá na mesma localização para cada ratinho durante um único ensaio e serámudou-se para os outros locais pré-determinados para os ensaios seguintes. Isto é feito para assegurar que os ratos 1) aprender existe uma plataforma para escapar, 2) nadar directamente para a plataforma visível, demonstrando assim competência visuais intacta, e 3) não têm défices motores.
7. Execute estes procedimentos para 6 ensaios para os primeiros 3 dias de testes. Assim, realizar a formação visível nos dias de teste 1, 2 e 3, com cerca de 10 minutos entre cada ensaio (Figura 2).
8. Durante o treinamento plataforma visível, use o software de monitoramento animal para medir a latência para alcançar a plataforma, rastrear o caminho ótico do animal, e nadar velocidade. Obter estas medições a partir do separador "labirinto de água" em "lista Experimental" e exportação diretamente para uma planilha Excel.
   Nota: O uso de um temporizador de mão também pode ser benéfico para assegurar a precisão do software de rastreamento.

3. Formação Morris plataforma escondida Water Maze

1. Set Up quarto
   1. Pendurar cortinas na sala para obscurecer pistas espaciais no laboratório.
   2. Coloque sinais estrategicamente nas cortinas. Certifique-se de que as pistas são grandes e contêm cores contrastantes (ex .: preto e branco) para melhor visibilidade. Pendure sinais à distância e altura onde eles são visíveis para os ratos de dentro da banheira. Nota: As pistas são estáticas e não se movem durante o decurso do teste.
2. Configuração do Software mouse Rastreamento Desempenho
   1. Calibrar o vídeo para corresponder às dimensões do labirinto sob a "Configuração" - "Filtros e Objectos" guia.
   2. Definir os filtros de modo a que o software pode diferenciar a partir de ratinhos do fundo.
      1. Use os mesmos processos como descrito no teste de plataforma visível (passos 2.1.2.1-2.1.2.3) para definir-se os filtros para labirinto aquático de Morris treino na plataforma escondida.
   3. Criar quatro quadrantes iguais dentro do labirinto
      1. Cliquea opção "Ellipse" sob a guia "Zona Definition" em primeiro lugar, e criar um círculo que corresponda ao labirinto na tela. Nota: Nesta guia, o labirinto real configurado é exibido, por isso permite que a opção para corresponder à configuração do computador com a configuração actual labirinto.
      2. Clique na opção "Retângulo" e criar quatro quadrados iguais. Coloque esses quadrados na tela para criar quatro quadrantes iguais dentro do círculo recém-criado.
   4. Criar as plataformas no labirinto.
      1. Escolher a opção "elipse", e criar um círculo o tamanho da plataforma que irá ser utilizado. Nota: Colocar a plataforma no labirinto de antemão pode ser benéfica para criar uma elipse do tamanho exacto da plataforma.
      2. Coloque a localização da plataforma recentemente criada no centro do quadrante alvo. (Recomenda-se a nomear esta "alvo" objeto de distinguir as plataformas corretas do resto). Passo crítico: Na caixa de apenas below "Grid", selecione a opção "stop" em "gatilho" para a plataforma de destino. Isso fará com que o programa para parar uma vez que o mouse chega à plataforma.
      3. Crie outros três zonas de plataformas idênticas, e colocá-los nos locais exatos em outros quadrantes. Não selecione "parar" na opção "gatilho".
3. Criando as Folhas Run
   1. Criar uma folha corrida listando cada rato, cada ensaio, um espaço para anotar o tempo para alcançar a plataforma, e um espaço para observar o comportamento aberrante (Tabela 1).
   2. Pré-determinar o ponto de lançamento de cada rato de uma forma pseudo-aleatório. Use selecção pseudo-aleatórios de modo a que a distância até à plataforma é igual cada dia, cada um dos quatro locais é utilizado igualmente e o ângulo desde o início para a plataforma (isto é., A partir da esquerda ou para a direita) é equilibrada dentro e entre os dias.
      Nota: a localização da plataforma na corridafolha para assegurar a localização da plataforma não se move a partir da posição original. Certifique-se de que a plataforma está no centro de um dos quatro zonas que foram criados no software de rastreio.
      Nota: Se o teste longitudinal está sendo realizado em várias idades, mover a plataforma para um novo local para cada idade.
4. Configurar o labirinto
   1. Ajuste ou o labirinto de água ou a câmera de forma que existe uma correspondência entre o labirinto e da definição da configuração em "Configuração" - aba "Zona Definition".
   2. Rotular os quatro quadrantes invisíveis do labirinto (N, S, E, W). Verifique se estes dados coincidirem com a configuração do software de monitoramento para garantir ratos estão sendo liberados a partir dos pontos de partida corretos.
      Passo Crítico: Coloque estas etiquetas fora do labirinto e fora da vista de um animal de natação dado que as pistas dentro do labirinto constitui um não-hipocampal tarefa não espacial, dependentes.
   3. Encha o labirinto com torneira wateR (aproximadamente 21 ° C), de modo que a plataforma é de aproximadamente 5 mm abaixo da superfície da água.
   4. Coloque a plataforma na localização predeterminada.
      Nota: A localização da plataforma continuará a ser o mesmo para todos os ratos que estão sendo testados em todos os dias e provações.
   5. Use non-toxic tinta têmpera branca para fazer a água opaca. Faça isso para garantir que a parte superior da plataforma é invisível a partir do nível dos olhos dos animais enquanto nadava.
5. Procedimento
   1. Leve o mouse da gaiola, marcar a cauda usando um marcador permanente da cor correta, e coloque no copo.
   2. Suavemente para o rato dentro do labirinto, de modo a entrar de frente para a parede. Nota: Cada ratinho irá ser colocado no mesmo local de partida para um ensaio único.
   3. Na versão inicial do mouse, iniciar o temporizador e ficar em uma área onde o testador não é facilmente visível pelos ratos. Certifique-se de que o software de rastreamento de animais está seguindo corretamente o animal.
   4. Uma vez que o animal chega à plataforma, para permitir que ele permanecer na plataforma durante 15 seg.
      Nota: Isso permite que o animal para orientar a sua localização espacial dentro da sala.
   5. Depois de 15 segundos sobre a plataforma, remover o animal a partir do labirinto e retornar o rato para o compartimento aquecido.
   6. Se o rato encontra a plataforma e prossegue para saltar ou cair antes de 15 seg, colher o rato e colocá-lo de volta na plataforma para o restante do 15 seg para que o rato aprende a associar a plataforma com fuga.
   7. Se o mouse não localizar a plataforma dentro de 60 segundos, retire delicadamente o rato e colocá-lo na plataforma. Deixe-a permanecer na plataforma durante 15 segundos, em seguida, remover o animal com a colher e trazê-lo de volta para a jaula aquecida.
   8. Limpe o labirinto de escombros com uma rede de interromper pistas olfactivas.
   9. Repita estes procedimentos para os restantes ratinhos do grupo. Assim, para os dias de ensaio de 4 a 9, realizar quatro ensaios de trem plataforma escondidaing por dia, com cerca de 20 min entre cada tentativa.
   10. Alterar a localização pseduorandomly de partida para cada tentativa. Assim, durante o julgamento 1, solte todos os ratos do mesmo local de partida, em seguida, repita o procedimento a partir de uma posição de partida diferente para os ensaios seguintes. Todos os dias, variam os pontos de liberação para garantir animais não desenvolvem um não-hipocampal estratégia motora não-espacial, dependentes. Por exemplo, se os ratos são libertados a partir de N, S, E, W e pontos no dia um, não libertá-los na mesma ordem que no dia seguinte.
   11. Durante o treinamento plataforma escondida, use o software de monitoramento animal para medir a latência para alcançar a plataforma, a extensão de caminho do animal, bem como a percentagem de tempo ou distância do animal gasta em cada quadrante labirinto. Obter estas medições a partir da guia "labirinto de água" em "Lista de experiências" e podem ser exportados diretamente para uma planilha Excel.
       Nota: O uso de um temporizador lado garante a precisão do seguimentoProgramas.

4. Ensaios de sonda

1. Configuração do Software mouse Rastreamento Desempenho
   1. Use os mesmos processos como no procedimento plataforma escondida do labirinto de água de Morris (passos 3.2.1-3.2.4.3) com uma excepção. Passo crítico: Para os ensaios de sondagem, assegurando que a opção "stop" para "gatilho" é desligada durante os ensaios de sondagem. Isso vai evitar que o programa parando quando um rato cruza a área da plataforma.
2. Criando as Folhas Run
   1. Criar uma folha corrida listando cada rato, cada ensaio, e um espaço para observar o comportamento aberrante. Pré-determinar o ponto de lançamento durante os ensaios de sonda de tal forma que eles se alternam entre os dois lados opostos da plataforma. Deste modo, pré-determinar os pontos de liberação de tal modo que os ratos não são libertados a partir dos dois lados, que são adjacentes à plataforma.
3. Procedimento
   1. Realização de ensaios de sondas semelhantes a formação plataforma escondida, com a excepção que nenhuma plataforma está no labirinto.
   2. Solte um rato a partir de um ponto de libertação predeterminado. Durante o julgamento de sonda, retire a plataforma eo rato tem 60 segundos para nadar no labirinto.
   3. Durante o teste, realizar quatro ensaios de sondagem. Alterar o ponto de lançamento dos ratos entre as tentativas de sonda. Assim, alterar o ponto de liberação do julgamento sonda de corrente de que o julgamento de sonda anterior.
   4. Durante os ensaios com sonda, utilizar o software de rastreio de animal para controlar o comprimento da trajectória do animal, a percentagem de tempo que o animal passa em cada quadrante do labirinto, e o número de vezes que um animal nada sobre a área previamente platformed. Obter estas medições a partir do separador "A análise dos dados" ea guia "labirinto de água" em "lista Experimental", e exportar diretamente para uma planilha Excel.
      Nota: O uso de um temporizador de mão também pode ser benéfico para assegurar a precisão do software de rastreamento.
   5. Realizar um ensaio sonda antes deformação plataforma escondida nos dias 6, 7, 8 e 10. (Figura 2). Depois destes ensaios de sondagem, realizar quatro ensaios de plataforma escondida treinando todos os dias. Assim, realizar uma primeira sonda, imediatamente seguido por formação plataforma escondida para todos os ratos utilizando os mesmos procedimentos como descrito no capítulo 3. Em contraste, não realizar um treinamento adicional plataforma escondida após o julgamento da sonda no dia 10.

5. As análises

1. Formação Plataforma visível
   1. Realizar medições repetidas ANOVAs separado por (a) comprimento da trajectória, (b), a latência para encontrar a plataforma, e (c) nadar velocidade, com transgene (ou outra variável, tal como o tratamento) como o entre-variável e sujeita dias ou como blocos de treino a variável intra-sujeito. Nota: Para projetos mais complexos, uma consulta com um estatístico pode ser útil. Ver ^8,13 para obter informações sobre tamanhos de grupo suficiente para alimentar adequadamente esta tarefa com os modelos comumente utilizados de Alzheimer7; s doença.
   2. Incompetência desempenho
      1. Identificar os ratos-de desempenho incompetente, incluindo ratos que demonstram incompetência visual ou motora, ou animais que não adquirem os componentes processuais do teste, e remover esses ratos de análises estatísticas subsequentes de plataforma escondida e desempenho da sonda.
         1. Calcule a média da latência e nadar velocidade para o último dia de treinamento plataforma visível para cada rato. Remover camundongos com meios 2 desvios-padrão acima da média do grupo, pois isso pode ser um indicativo de motor ou deficiência visual.
         2. Identificar e remover os ratos falha para orientar ou siga a colher de fuga, ou ratos que apresentam um comportamento aberrante, como natação saca-rolhas ou flutuante.
2. Formação Morris Water Maze plataforma escondida
   1. Conduta de medidas repetidas ANOVA em (a) comprimento da trajectória, (b), a latência para encontrar a plataforma escondida, (c) velocidade de natação, e (d) o tempo por cento ou a percentagemdistância em quadrante com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
3. Ensaios de sonda
   1. Velocidade de natação
      1. Realizar ANOVAs de medidas repetidas em velocidade de natação em todos os ensaios de sondagem com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
   2. Índice de travessia Plataforma
      1. Usando a configuração do julgamento sonda para cada rato, índice cruzamento plataforma (PCI) é calculado usando a seguinte fórmula: = PCI número de vezes que o rato cruza o local de destino - travessias médios da localização equivalente nos outros três quadrantes.
         Nota: Este é conduzida para determinar se o mouse está usando uma estratégia de pesquisa espacial, como indicado por mais cruzamentos sobre a localização plataforma treinado, ou uma estratégia não-espacial de thigmotaxic natação, como indicado por cruzamentos aproximadamente iguais ao longo de todos os quatro locais.
      2. Conduta repetidoMedidas ANOVAs no PCI com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito.
   3. Tempo por cento ou a percentagem distância no quadrante
      1. Calcula-se a percentagem de tempo ou a distância de cada rato passa nos quatro quadrantes do labirinto. Realizar medidas repetidas ANOVAS na porcentagem de tempo ou distância, com transgene como a variável e ensaios entre sujeitos como a variável intra-sujeito. Utilizar a percentagem de tempo para determinar se uma estratégia de pesquisa espacial está a ser utilizado; achados de tempo de aproximadamente 25% no quadrante alvo indicam os ratos estão realizando a nível acaso e não usando uma estratégia de pesquisa espacial.
   4. O / N esquecendo
      1. Compare a latência de travessia área de plataforma em julgamento a sonda para a latência para localizar a plataforma sobre o julgamento final do dia anterior. Nota: Se a latência da travessia da plataforma de ensaio a sonda é significativamente mais longo do que o tempo de latência para encontrar a Platform durante o último teste de plataforma escondida no dia anterior, em seguida, O / N esquecimento da localização da plataforma está a ocorrer.
4. Análise post hoc
   1. Siga RMANOVAs significativas com comparações post hoc de transgene em cada tentativa.

6. Exemplo de Re-otimização para um novo ambiente de Teste

1. Pré-manuseio. Realizar pré-tratamento na sala de habitação. Coloque as gaiolas sem tampas em um carrinho de transporte durante toda a sessão.
   Nota: Objetivos para modificação do processo de pré-tratamento devem apresentar de forma mais gradual manipulações manipulador e exposição para os dispositivos de transporte (copo e colher) e aumentar os ratos de tempo estão na gaiola sem tampas microisolator e fora de sua gaiola em uma campo aberto e mais brilhantes condições de luz.
   1. Dias 1 e 2
      1. Permitir que os ratos se adapte à mãos sendo na gaiola, seguido de tocar suave, Seguido por que está sendo levantada para inspeção tatuagem e marcação da cauda. Começando no dia 2 de pré-tratamento, coloque o material do assentamento suplementar na gaiola para fornecer material adicional para a construção do ninho e abrigo, enquanto as tampas foram removidas ^9.
   2. Dias 3 e 4
      1. Colocar o copo de transporte, colher, e bandeira da plataforma visível na caixa de pré-tratamento e permitir que os ratos para explorar dois ensaios a 2 min por julgamento.
      2. Não use água neste protocolo durante o pré-tratamento. Em vez disso, certifique-se a caixa contém roupa de cama limpa o suficiente para cobrir o chão e é perfumado com uma pequena quantidade de palha suja feminino e masculino se ambos os sexos estão sendo testados. Mude a cama todos os dias.
   3. Dia 5
      1. Camundongos lugar na caixa de pré-tratamento contendo maca pouco suja ea bandeira plataforma visível para 3 ensaios, durante 20 segundos cada. Utilizar a proveta e a colher para transportar os ratos para e a partir da caixa.
2. Formação Plataforma visível
   1. Definir a temperatura da água a 27 ° C (normalmente utilizado para o ambiente de teste de Minnesota).
   2. Retornar os ratos para a gaiola ao adquirir a plataforma cued.
   3. Permitir ratinhos até 60 seg para adquirir a plataforma visível.
   4. Realizar sessões de treinamento consistindo de três ensaios por dia durante 5 dias.
3. Formação plataforma escondida
   1. Modificar pistas visuais. Exceto por uma grande cortina para ocultar o manipulador, eliminar ou tornar mais estreitos outras cortinas ao redor da piscina de modo a ter um quarto mais aberto. Coloque objetos adicionais sobre o quarto (por exemplo, prateleiras expostos, poster de tecido preto com um símbolo branco, uma bola de praia preto e branco, grandes chaminés negras, cadernos, e um bicho de pelúcia preto), resultando em uma cue- visuais equilibrado, mas mais variada definido do que utilizado anteriormente.
   2. Comece escondido treinamento plataforma de 72 horas após a conclusão da traini plataforma visívelng, com um intervalo de cerca de 30 min entre os testes.
   3. Realizar sessões de formação que consistem em 2 ensaios por 8 dias.
4. Ensaios de sonda
   1. Realizar ensaios de sonda 72 horas após julgamentos de formação escondidos 8, 12, e 16.Include um intervalo de 3 dias entre ensaios 8-9 e 12-13 de treinamento.
   2. Defina o tempo de duração da sonda durante 30 segundos.

Results

Nós temos utilizado o labirinto de água de Morris para estudar os efeitos de beta-amilóide (Tg2576 ratinhos) e P301L mutante tau (RTG (TauP301L) 4510 ratinhos) na memória de referência espacial (por exemplo, ^1,5,7,8). A Figura 3 é o resultado representativo consta em nosso estudo examinando o efeito do adulto-início expressão P301L tau no aprendizado e memória ^8, utilizando testes de Meio Ambiente A. Para avaliar as capacidades motoras e visuais, os ratos foram comparados ...

Discussion

A tarefa MWM é amplamente utilizado para avaliar a aprendizagem espacial ea memória. No entanto, a robustez desta tarefa pode ser influenciada por muitos factores e requer optimização tanto para estirpe fundo e ambiente de teste. Como mostrado na Figura 4, o mesmo protocolo de treino e aplicados sinais visuais usados ​​em dois quartos de teste diferentes (de tamanho e de disposição equivalente) produziram significativamente diferente desempenho da sonda. Uma vez que muitas características da sala de tes...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Visualizador Software de rastreamento	Biobserve		Este software específico não é um requisito - existem outros sistemas de rastreamento disponíveis
Pré-manuseio da piscina			Dimensões aproximadamente 1 pé de largura x 2 pés de comprimento x 1,5 pés de profundidade
Copo			1 L
Colher
Rede pequena
Tinta
		têmpera branca não tóxica	Qualquer tinta colorida pode ser usada; no entanto, a maioria dos programas de software de rastreamento exige que a tinta contraste com a cor do animal.
Plataforma			A cor deve contrastar com a do labirinto
Haste
Cortinas
Banheira			Geralmente de cor branca; aproximadamente 4 pés de diâmetro
Plataforma			Pintada da mesma cor que a água