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Artigo de método

O isolamento e criopreservação de Neonatais Rato Cardiomyocytes

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DOI:

10.3791/52726

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9 de abril de 2015

 ,  , 
1Department of Molecular Biomedical Sciences and Center for Comparative Medicine and Translational Research, College of Veterinary Medicine, North Carolina State University, 2Joint Department of Biomedical Engineering, University of North Carolina at Chapel Hill, North Carolina State University, 3The Cyrus Tang Hematology Center, Soochow University

Neste artigo

Resumo

O isolamento de cardiomiócitos de ratos neonatais é um procedimento demorado e imprevisível. Este estudo descreve métodos de criopreservação e descongelamento de cardiomiócitos de ratos neonatais que permitem o uso mais eficiente das células. Os NRCMs descongelados podem ser usados para vários experimentos sem a necessidade de realizar isolamentos a cada vez.

Resumo

A cultura de células tornou-se cada vez mais importante na pesquisa cardíaca, mas devido à proliferação limitada de cardiomiócitos, a cultura de cardiomiócitos é difícil e demorada. As células mais comumente usadas são cardiomiócitos de ratos neonatais (NRCMs), que requerem isolamento toda vez que as células são necessárias. O nascimento dos ratos pode ser imprevisível. A criopreservação é proposta para permitir que as células sejam armazenadas até que sejam necessárias, mas os métodos de congelamento/descongelamento para cardiomiócitos primários são desafiadores devido à sensibilidade das células. Usando o crioprotetor adequado, dimetilsulfóxido (DMSO), a criopreservação foi alcançada. Extraindo-se lentamente o DMSO durante o descongelamento das células, as culturas foram obtidas com NRCMs viáveis. O fenótipo NRCM foi verificado usando coloração imunocitoquímica para actinina α-sarcomérica. Além disso, as células também mostraram contração espontânea após vários dias em cultura. A viabilidade celular após o descongelamento foi aceitável em 40-60%. Apesar disso, os métodos descritos permitem criopreservar e descongelar facilmente os NRCMs. Isso dá aos pesquisadores uma maior flexibilidade no planejamento de experimentos, além de reduzir o uso de animais.

Introdução

Cultura de células de cardiomiócitos é uma ferramenta crítica na pesquisa cardíaca moderna. Cardiomiócitos de ratos neonatais (NRCMs) são comumente utilizados uma vez que o isolamento e a cultura é mais fácil do que a de cardiomiócitos de rato adulto 1. O método NRCM ainda tem várias limitações, incluindo um procedimento de isolamento e a proliferação celular a longo limitada no prato. Existem numerosos protocolos para o isolamento de NRCMs com mais geralmente requerem 4-48 horas de trabalho 2-6. Além disso, as células são frequentemente isoladas a partir de 1 a filhotes de 2 dias de idade de ratos 2,4-7; o momento do nascimento pode ser imprevisível e conflito com outro trabalho no laboratório. Os isolamentos pode ser ineficiente e dispendiosa se apenas uma pequena quantidade de células são necessários para as experiências. A maioria dos esforços na melhoria do fluxo de trabalho o foco na redução do tempo de isolamento, mas isso não resolve os problemas de cronometrar o nascimento dos filhotes.

Como alternativas, muitos laboratórios utilizamcardiomiócitos derivados de células-tronco embrionárias (CES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). No entanto, o processo de reprogramação e / ou a diferenciação pode ser muito demorado e dispendioso, bem. Podem existir outros problemas quando se utiliza estas células como modelos in vitro de miócitos. Ambos ESC- e iPSC- cardiomiócitos derivados têm sido mostrados para apresentar diferenças de eletrofisiologia de cardiomiócitos primários 8-10.

NRCMs dissociadas são capazes de serem armazenados durante vários dias, usando refrigeração 11, no entanto, esta não permite a armazenagem a longo prazo. O nitrogénio líquido é tipicamente usado para preservar as células para um período de tempo maior, mas requer um crioprotector tal como sulfóxido de dimetilo (DMSO). Pesquisas anteriores mostraram que a concentração ideal entre 5-10% DMSO na mídia congelamento permite a criopreservação de NRCMs, mas mesmo assim a viabilidade permanece baixa 12. Embora DMSO ajuda a proteger as células durante a livreXing, que pode ser tóxico para células em concentrações acima de 1,5% 13. Estudos anteriores têm demonstrado que a remoção de DMSO lentamente a partir das células, pode melhorar a viabilidade celular 14.

Procurou-se melhorar a eficiência de ensaios baseados em células NRCM por criopreservação das células após o isolamento. Isto permite que as células a ser descongelado e utilizado quando necessário, reduzindo a frequência de isolamento e o consumo dos animais. Usando este método, que mostram que é possível criopreservar NRCMs e descongelar-los para uso numa altura posterior. Depois de descongelar as células manter uma viabilidade aceitável e produzir culturas NRCM que são positivas para sarcomérica α-actinina (α-SA) e contraem espontaneamente.

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Protocolo

O protocolo a seguir é projetado para o isolamento dos cardiomiócitos de uma ninhada de filhotes de ratos neonatos (10-14 filhotes). Se o tamanho da leitegada é significativamente diferente, o procedimento pode ter de ser escalado para compensar. Os filhotes devem ser em torno de 48 ± 6 horas de idade. Todos os procedimentos aqui foram aprovados pela North Carolina State University Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC).

1. Preparação cela de isolamento

NOTA: Execute as seguintes etapas no dia anterior isolamento.

  1. Autoclave os seguintes: grandes tesouras, tesouras pequenas, pequenas pinças afiadas, grandes fórceps. Use um ciclo de gravidade durante 60 minutos a um mínimo de 121 ° C e um tempo de secagem de 30 minutos.
  2. Colocar 40 ml de solução de tripsina a 0,1% em frigorífico para descongelar S / N. Sais Equilibrados Solução de Refrigerar Hank (HBSS) se já não estiver frio. Prepare um soro de bovino (FBS) solução de mídia estoque fetal 20%.
    1. Em 400 ml de Iscmeios Dulbecco modificado por ove (IMDM) adicionar 100 ml de FBS, 5 mL de L-glutamina (200 mM), 2,5 ml de gentamicina (10 mg mL -1), e 0,9 ml de 2-mercaptoetanol. Esterilizar usando filtro de vácuo. Meios Armazenar a 4 ° C durante até 3 semanas e esta é escalável para volumes maiores ou menores. Dilui-se 20% de FBS meios estoque 1: 1 com IMDM para produzir 10% de meio de FBS NRCM. Apenas fazer em pequenos lotes para evitar um aquecimento e resfriamento de mídia repetido.

2. cela de isolamento Dia 1

  1. Execute o seguinte trabalho em uma capa de cultura para evitar a contaminação das amostras. Para melhor momento iniciar este trabalho no período da tarde uma vez que existe um O / N incubação.
  2. Prepare espaço de trabalho dentro de uma capa de cultura estéril. Coloque pad banco na capa de cultura. Encha dois copos de 250 ml com 70% de etanol e coloque os instrumentos cirúrgicos por eles. Coloque pequeno balde de gelo no capô. Certifique-se de que é grande o suficiente para armazenar vários tubos e um prato de 150 milímetros. UV esterilizar o capô for 10 min. Colocar 40 ml de tripsina a 0,1% em gelo.
  3. Recuperar filhotes de ratos recém-nascidos da mãe. Para manter os animais quente até uso, coloque-os em um recipiente isolado, como um balde de gelo envolto em um bloco de banco para mantê-los aquecidos.
  4. Encha uma 150 milímetros prato de cultura com 25 ml de HBSS e colocar no gelo. Unwrap 2-3 compressas de gaze e coloque na área de trabalho. Segurando pup pela pele na parte de trás do pescoço, pulverizá-lo com etanol e 70%, em lugar do exaustor. NOTA: Para melhor manter a esterilidade, isto é pode ser feito por uma outra pessoa que, em seguida, coloca o filhote limpo no capô.
  5. Segurar o cachorro pela pele na parte de trás do pescoço. Em seguida, usando as grandes tesouras, em um rápido corte forte, eutanásia por decapitação. Blot o sangue com gaze. NOTA: Devido a variações nas exigências IACUC, pode ser mais apropriado para limpar o filhote com um etanol em vez de limpar aspersão. Certifique-se de verificar com a universidade IACUC como às suas diretrizes para essa etapa.
  6. Continuar a cortar face anterior da chest através da caixa torácica. Apertar a pele no pescoço para ajudar a abrir a caixa torácica até que o coração é visível. Usando as pequenas tesouras, remover o coração e o lugar em HBSS prato de cultura em gelo. Repita o procedimento para os outros filhotes.
  7. Remova qualquer tecido não-cardíaca a partir das amostras e agite a HBSS suavemente para lavar os corações. Transferir o tecido do coração para outro prato de cultura contendo HBSS e lavar o tecido. Corte o tecido mais até que as peças são 1-3 mm 3, e depois transferir para a solução de tripsina. Coloque solução de tripsina no balancim em 4 ° C geladeira O / N.

Isolamento celular Dia 2

NOTA: Enquanto a aspiração nas etapas seguintes, utilizar uma pipeta, em vez de uma linha de vácuo. O tecido se move com facilidade, e uma linha de vácuo vai entupir ou remover o tecido ainda contendo células. É melhor usar uma pipeta de aspiração em seu lugar. Se o tecido entra na pipeta, pipeta de volta para removê-lo.

  1. Faça três alíquotas de 10% NRCM Mídia: um com 25 ml e dois com 15 ml. Coloque um tubo de 25 ml de meios de comunicação em 37 ° C banho de água. Adicionar 4 ml HBSS para 5 diferentes 15 ml tubos cônicos e coloque tudo no gelo. Escreva em cada 15 ml tubo # 1-5.
  2. Adicionar 40 ml de HBSS para um tubo cónico de 50 ml. Adicionar 10 ml de HBSS a colagenase, pipeta para suspender, e combinar as soluções para criar 50 ml de 1 mg ml -1 solução de colagenase. Esterilizar usando 0,22 um filtro de vácuo, e armazenar à temperatura ambiente.
  3. Recuperar coração tubo de tecido / tripsina. Certifique-se de que a tripsina é clara, e o tecido aparece fofo. Permitir que o tecido para liquidar a esquina do tubo e aspirar o máximo de líquido possível.
  4. Adicionar 25 ml quente 10% mídia FBS NRCM ao tubo e agite com a mão. Cap e rodar em 37 ° C num banho de água durante 2 min. Aspirar líquido novamente. O tecido deve flutuar nesta etapa; em caso afirmativo, aspirado a partir do fundo do tubo.
  5. Adicionar 10 ml de colagenase. Gire em banho-maria por 2 min ou até que a solução está turva. Quickly aspirar o líquido. Adicionar 10 ml de colagenase fresco ao tubo contendo o tecido e rodar em banho de água durante 2 min. Pipeta para misturar, solução de transferência de tubo # 1, e colocar no gelo. Pode não ser possível retirar todo o líquido. Repita os passos de 3,2-3,6 para os outros três tubos de 15 ml cônicas. Transferir o líquido remanescente para tubo # 5.
  6. Centrifugar tubos de 15 ml a 410 rcf durante 8 min. Enquanto centrifugação, coloque 15 ml de 10% tubo de mídia FBS NRCM em banho-maria. Colocar 40 um filtro de células no topo de um tubo cónico de 50 ml e molhado com 2 ml de HBSS frio.
  7. Aspirar o sobrenadante a partir de células centrifugadas. Adicione 6 ml frio HBSS a cada tubo e ressuspender. As suspensões de células pipeta através do filtro em 50 ml cónico para remover qualquer tecido. Lavar os lados de cada tubo de 15 ml com 3 ml de HBSS frio e adicionar ao filtro. Centrifugar células a 410 rcf durante 10 min. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender pellet celular em 10 ml 10% de media FBS NRCM e transferência para T-75 frasco. Enxágüe cônico com media de 5 ml e adicionar à flperguntar.
  8. Incubar durante 1 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Coloque últimos 15 ml 10% tubo de mídia FBS NRCM em banho-maria. Conteúdo de T-75 para um novo frasco T-175 Transferir, enxaguar T-75 com 15 ml de meio e adicionar a T-175. Incubar durante 1 h.

4. Criopreservação

  1. Coloque mídia congelamento no gelo. Transferência de mídia a partir de células T-175 a 50 ml tubo cônico, e coletar 10 ml de suspensão celular para celular contagem utilizando Trypan azul. Centrifugar a 410 rcf durante 5 min. Enquanto a centrifugação, contagem de células usando um contador de células.
  2. Aspirar meios de cultura de células, e ressuspender em meio de congelação a uma concentração de 2-4.000.000 células por ml. Coloque 1 ml de suspensão de células em criotubo, então lugar frascos uma taxa controlada de refrigeração recipiente de congelamento, e coloque no freezer -80 ° C O / N. Dentro de 1-2 dias, transferem frascos em azoto líquido.

5. descongelamento de células

  1. Prato Brasão em fibronectina dissolvendo 250 ul60; de fibronectina (concentração de 1 mg ml-1) em 9,75 ml de água (concentração final de 0,025 mg mL -1). Adicionar solução suficiente para cobrir as placas de cultura e incuba-se a 37 ° C durante pelo menos 30 min.
    1. Em quatro de 15 ml tubos cônicos, fazer as misturas DMSO / mídia da seguinte forma adicionando DMSO a 20% de Mídia. Adicionar (5%) 9,5 ml de meio com 500 ul de DMSO. Adicionar (2,5%) 9,75 ml de meio com 250 ul de DMSO. Adicionar 10 ml de mídia (fazer duas delas).
  2. Aqueça as misturas de mídia acima mencionadas em 37 ° C banho de água. Remover as células a partir de azoto líquido e colocar em gelo seco. Quando misturas de mídia são quentes, descongelar as células em 37 ° C banho de água até pouco descongelado. Não deixe as células em banho-maria por muito tempo, pois isso pode causar danos às células.
  3. Transferir conteúdo do frasco criogênico a 5% tubo de DMSO / media. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular. Adicione o conteúdo do tubo de 2,5% DMSO / media para a célula pellet e resuspend. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular.
  4. Adicionar conteúdo de um tubo de 0% DMSO / media para a célula pellet e ressuspender. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular.
  5. Adicionar conteúdo da segunda 0% DMSO / media para pellet celular e ressuspender. Tome pequena amostra para contagem de células. Centrifugar a 410 rcf durante 8 min. Enquanto centrifugação células de contagem em um hemocitómetro utilizando Trypan Blue para rotular as células mortas. Quantidade de células Record, bem como a viabilidade.
  6. Aspirar o sobrenadante deixando sedimento celular. Ressuspender em 10% mídia NRCM (opcional: adicionar 100 bromodeoxiuridina? M (BrdU)) e células da placa em pratos revestidos com fibronectina.

Cultura 6. celular

  1. As células em placas a cerca de 100k células por cm2. Ajustar a densidade de revestimento com base na utilização prevista da cultura. Prepare a 2% de meio NRCM diluindo 20% em IMDM Meios numa proporção de 1:10. O que se segue é um esboço de uma cultura típica.
  2. No dia 1, lavar as células mortas afastado com IMDM morna, adicione 10% NRCM (opcional 100 M BrdU). No dia 2, lavar as células mortas afastado com IMDM morna, adicione 10% NRCM. Dia 3-adicionar 2% NRCM. No dia 4, adicionar 2% NRCM. No dia 5, assegurar que as células estão confluentes e batimento. Manter as células em cultura durante cerca de uma semana. Nesse ponto fibroblastos podem começar a superar significativamente as NRCMs.

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Resultados

Seguindo o isolamento dos cardiomiócitos de ratos neonatais, as células são congeladas até azoto líquido, e pode ser armazenado durante pelo menos vários meses. Tipicamente, durante o descongelamento, a viabilidade determinada por análise de Azul de Tripano será entre 40-60%. Embora este seja mais baixa do que outros tipos de células, com a sementeira e a cultura adequado as células irão proliferar (Figura 1). A fim de verificar a contractilidade, as células podem ser visualizados utilizando um microscó...

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Discussão

Este protocolo permite que os NRCMs a ser isolado, criopreservadas e descongeladas. A descongelação das células é uma parte essencial do processo. Uma série de diluições de DMSO é usado para remover lentamente DMSO a partir das células 14. É importante que a extracção de DMSO ser realizado mais rapidamente que as células são particularmente sensíveis a morrer imediatamente após a descongelação. Se as células mais ou menos são requeridos para a descongelação, os volumes das soluções em DMSO podem ser dimension...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por financiamento da American Heart Association 12BGIA12040477, do Programa de Excelência do Corpo Docente do Chanceler da NC State University e da National Natural Science Foundation of China H020381370216.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
IMDM (+25 mM HEPES + L-glutamina)Gibco12440-046Com adição de 25 mM HEPES e L-glutamina
L-glutaminaGibco25030-081
FBSHycloneSH30070.03
GentamicinaGibco15710-064
2-MercaptoetanolGibco21985-023
HBSS (+Ca + Mg)Corning21-020-CVCom adição de cálcio e magnésio, pH 7,1-7,4
Tripsina 0,25%Gibco25300-056
Tripsina 0,05%Gibco25300-054
Cryostor CS5BioLife Solutions205102Meios de congelamento
Frasco criogênicoCorning430659
ColagenaseSigmaC1889-50MG
40 μ Filtro de Vácuo EsterilizanteCell Strainer Greiner Bio-One542040
(0.22μ m)Corning431118
50 ml CônicoCorning430828
15 ml CônicoCorning430790
trypan azulCellgro25-900-CI
Mr Frosty Recipiente de CongelamentoThermoScientific5100-0001
Millicell EZ  SLIDESAnticorpode
&alfa;-sarcoméricaMillipore SigmaA7811
FibronectinaCorning356008
BromodeoxiuridinaBD Biosciences51-7581KZ
actinina PEZGS0416

Referências

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