Ativação da micróglia e microgliose são respostas fundamentais para a neurodegeneração crónica. Aqui, apresentamos métodos para in vivo, visualização de longo prazo de CX3CR1-GFP + células microgliais da retina por oftalmoscopia confocal, e para limiar e análises morfométricas para identificar e quantificar a sua activação. Monitoramos alterações microgliais durante estágios iniciais de glaucoma relacionada com a idade.
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Artigo de método
In Vivo Dinâmica da Retinal microglia Ativação Durante Neurodegeneration: confocal oftalmoscópico Imagem e morfometria celular no mouse Glaucoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
A microglia, que são células do SNC neuroimunes residentes, transformar a sua morfologia e tamanho em resposta à lesão do SNC, a mudança para um estado activado com funções distintas e perfis de expressão de gene. Os papéis de ativação microglial na saúde, ferimentos e doenças ainda permanece incompreendida, devido à sua regulamentação dinâmico e complexo em resposta a mudanças no seu microambiente. Assim, é essencial monitorizar de forma não invasiva e analisar as alterações na activação da microglia ao longo do tempo no organismo intacto. Estudos in vivo de ativação microglial ter sido adiada por limitações técnicas ao comportamento microglial rastreamento sem alterar o ambiente CNS. Isso tem sido particularmente desafiador durante a neurodegeneração crónica, onde as mudanças de longo prazo devem ser rastreadas. A retina, um órgão do SNC passíveis de imagens ao vivo não-invasiva, oferece um sistema poderoso para visualizar e caracterizar as dinâmicas da activação da microglia durante a desordens crónicas.
a imagem in vivo de microglia da retina, utilizando oftalmoscopia confocal (cSLO) e CX3CR1 GFP ratos / + repórter, para visualizar microglia com resolução de celular. Além disso, nós descrevemos métodos para quantificar as mudanças mensais de ativação celular e densidade em grandes subconjuntos de células (200-300 células por retina). Confirmamos o uso da área Somal como uma métrica útil para o rastreio ao vivo da ativação microglial na retina através da aplicação de morfometria baseada no limiar automatizada de imagens in vivo. Nós usamos estes aquisição de imagem ao vivo e analisa estratégias para monitorar as mudanças dinâmicas na ativação microglial e microgliose durante as fases iniciais de neurodegeneração da retina em um mouse modelo de glaucoma crônico. Esta abordagem deve ser útil para investigar as contribuições de microglia para declínio neuronal e axonal em doenças crônicas do sistema nervoso central que afetam a retina eo nervo óptico.
Introdução
A microglia são células neuroimunes que reside exclusivamente no sistema nervoso central (SNC) dado que o desenvolvimento embrionário inicial e durante a vida adulta. Equipado com um complexo repertório de receptores, atividade microglial e heterogeneidade regional são regulamentados pela sua interacção bidireccional com os neurônios vizinhos, glia, barreira hemato-encefálica e infiltração de células neuroinflamatórias 1,2. Funções microgliais basais contribuem para a manutenção e reparação fisiológica, uma vez que provar seu território para perturbações na homeostase 3,4. Durante lesão ou doença do SNC, microglia são os primeiros a responder ao....
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Protocolo
Imagem in vivo é realizado em instalações isentos de agentes patogénicos usando protocolos aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso do animal Institucional na Universidade de Utah.
NOTA: Este protocolo de imagem é usado para ratinhos repórter em que a microglia da retina e monócitos / macrófagos que se infiltram expressar a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controlo do locus do receptor de fractalcina (CX3CR1).
1. In vivo de imagens de Retinal GFP + Microglia por laser confocal Ophthalmoscopy (cSLO)
- Ligue o sistema de aquecimento controlado por água, ajustado para estabilizar a temperatura rato entre 3....
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Resultados
Nossos recente estudos in vivo utilizado aquisição e análise de imagens ao vivo esses métodos para visualizar e controlar a cinética e padrões de ONH e mudanças microgliais da retina durante as fases iniciais do glaucoma crônico e sua relação com a tarde neurodegeneração 59. Aqui, ilustramos um protocolo de aquisição de imagem cSLO para visualizar as células microgliais através de uma grande área da retina central em jovens individuais heterozigotos CX3CR1-GFP DBA / 2J retina (Figura 5).
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Discussão
Monitorização vivo do número de células da microglia e activação morfológica durante uma doença neurodegenerativa requer a utilização de métodos de imagem não invasivos que permitem a visualização detalhada das características celulares. Depois de imagem, as células microgliais deve ser isolado (segmentado) para análises morfométricas pelo uso de múltiplos passos de limite para avaliar o tamanho Somal e / ou a complexidade do processo de leituras para a ativação da micróglia. Neste protocolo, descrevemos os métodos de a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Agradecemos ao Instituto de Computação Científica e Imagem da Universidade de Utah pelo uso do software FluoRender (R01GM09815). Este trabalho foi apoiado por doações da Fundação de Pesquisa de Glaucoma, Fundação Melsa M. e Frank Theodore Barr e do Instituto Nacional de Saúde dos EUA, (R01EY020878 e R01EY023621) para MLV, e (R01EY017182 e R01EY017950) para BKA.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos DBA/2J e CX3CR1-GFP/+ | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000671 e 00582 | Os camundongos são criados internamente, introduzindo novos criadores a cada 3 a 4 gerações para evitar a deriva genética. |
| 30½ Agulha G e seringa de ponta deslizante de tuberculina de 1 ml | BD, East Rutherford, NJ | 305106 e 309659 | |
| 2,2,2-tribromoetanol, álcool terc-amílico 99% e tampão fosfato comprimidos salinos | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T48402, 152463 e P4417 | A solução de Avertin (pH 7,3, filtrada estéril) deve ser uma solução recém-feita ou armazenada a 4 &graus; C por até 1 semana. |
| Terapia de calor T / Bomba | Gaymar Industries, Orchard Park, NY | TP-650 | |
| Aplicadores com ponta de algodão | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 23-400-100 | |
| Tropicamida 1% | Bausch & amp Lomb, Rochester, NY | Lentes de contato NDC 24208-585-64 | |
| PMMA, curva de base de 1,70, diâmetro total de 3,2 mm, centro de 0,40 mm de espessura | Cantor & Nissel Ltd., Northamptonshire, Reino Unido | G003709 | As lentes são enxaguadas com PBS estéril e armazenadas em caixas de polipropileno. |
| Oftalmoscópio a laser de varredura confocal HRA/Spectralis e software Eye Explorer | Heidelberg Engineering GmbH, Carlsbad, CA | Versão 1.7.1.0 | |
| PowerPoint | Microsoft, Redmond, WA | Versão 14.4.3 | |
| Adobe Photoshop | Adobe, San Jose, CA | Versão CS3 | |
| FluoRender | Scientific Computing and Imaging Institute, University of Utah | Versão 2.13 | Publicidade gratuita. http://www.sci.utah.edu/software/13-software/127-fluorender.html |
| NIS-Elements C | Nikon, Melville, NY | Versão 4.30.01 |
Referências
- Hanisch, U. K. Functional diversity of microglia - how heterogeneous are they to begin with. Front. Cell. Neurosci. 7 (65), 1-18 (2013).
- Kettenmann, H., Hanisch, U. K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of microglia. Physiol. Rev. 91 (2), 461-553 (2011).
- Davalos, D., et al.
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Reimpressões e permissões
