Artigo de método
A medula espinhal de mamíferos adultos contém células-tronco neurais/progenitoras (NSPCs) que podem ser isoladas e expandidas em cultura. Este protocolo descreve a coleta, isolamento, cultura e passagem de NSPCs geradas a partir da região periventricular da medula espinhal adulta do rato e de doadores de transplante de órgãos humanos.
Rato adulto e medula espinhal células humanas neuronais estaminais / progenitoras (NSPCs) cultivadas em meio de crescimento enriquecido com fator permite a proliferação de multipotentes, e células-tronco neurais expansíveis auto-renovação. Em condições de soro, estes NSPCs multipotentes vai diferenciar, gerando neurônios, astrócitos e oligodendrócitos. O tecido colhido é enzimaticamente dissociada em uma solução de papaína-EDTA e depois dissociados mecanicamente e separado através de um gradiente de densidade descontínuo para produzir uma suspensão de célula única que é banhado em meio neurobasal suplementado com factor de crescimento epidérmico (EGF), factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ), e heparina. Rato adulto NSPCs medula espinhal são cultivadas como neurospheres livre flutuação e adulto humanos NSPCs da medula espinhal são cultivadas como culturas aderentes. Sob estas condições, adultos NSPCs medulares proliferam, expressam marcadores de células precursoras, e pode ser continuamente aumentada passagem. Estas células pode be estudada in vitro em resposta a vários estímulos, e factores exógenos pode ser usada para promover a restrição de linhagem para examinar a diferenciação de células estaminais neurais. Multipotentes NSPCs ou sua progénie também podem ser transplantadas em vários modelos animais para avaliar a reparação regenerativa.
NSPCs são células multipotentes comprometidos com a linhagem neural que podem se auto renovar e expandir rapidamente in vitro. Nós nos referimos a essas células como uma população mista de células estaminais / progenitoras neurais uma vez que eles exibem propriedades de células-tronco multipotentes auto-renovação e progenitores mais restritas. NSPCs são encontradas tanto no cérebro fetal e adulto e na medula espinal 1,2. No adulto, NSPCs são normalmente quiescentes e residir dentro nichos específicas, incluindo a zona subventricular alinhando os ventrículos laterais de 2-4, e a região periventricular torno do canal central da medula esp....
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Todos os procedimentos com animais são aprovados pelo Comitê Animal Care da University Health Network, Toronto ON Canadá, em conformidade com as políticas estabelecidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais preparados pelo Canadian Council on Animal Care. Para a colheita de tecido da medula espinhal humana, a aprovação foi obtida a partir da Investigação Conselho de Ética University Health Network e do Trillium Gift of-Life Foundation, que supervisiona a doação de órgãos em Ontário, Canadá.
1. Preparação da dissecção Buffers e Meios de Cultura
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Rato adulto células da medula espinhal crescidas em cultura em suspensão em meio EFH irá formar pequenas neurospheres (colônias de células indiferenciadas) dentro de uma semana de plaqueamento inicial. Em culturas primárias, a maioria das células plaqueadas morrerão de crescimento e factor de células estaminais que respondem irão proliferar e são seleccionados de EFH no meio. Por passagem 3, não haverá numerosas neuroesferas livre flutuação de cerca de 100 um de diâmetro (Figura 2A). As neuroesferas são.......
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Durante a dissecção da medula espinal do tecido cuidados devem ser tomados para não danificar a medula espinhal durante a realização da laminectomia. É mais fácil isolar o tecido periventricular quando os segmentos da medula espinal estão intactos. Os segmentos de tecido deve ser totalmente imersa em tampão de dissecação e as meninges que recobrem e substância branca pode ser cortada como tiras longitudinais com microtesoura. Alternativamente, uma pinça fina pode ser usada para descascar a substância branca de distância.......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Os autores gostariam de agradecer o apoio da Spinal Cord Injury Ontario, do Fundo de Pesquisa e Inovação Ontário-China, da Fundação do Hospital Geral e Ocidental de Toronto e da Fundação Incorporada de Serviços Médicos. Os autores agradecem ao Dr. Tasneem Zahir pelo aconselhamento especializado em cultura NSPC da medula espinhal humana, e aos Drs. Cindi Morshead e Iris Kulbatski por seus conselhos especializados no isolamento do NSPC da medula espinhal de ratos.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Tampão de dissecação |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Tampão de dissecação |
| D-glicose | Sigma | # G-6152 | Prepare solução estoque de glicose a 30% para tampão de dissecação e mistura hormonal |
| Penicilina-Estreptomicina | Life Technologies | #15140-148 | Tampão de dissecção e meio de cultura |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Meio |
| de cultura L-glutamina, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Meio de cultura |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Meio de cultura |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Mistura hormonal |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Mistura hormonal |
| NaHCO 3< / sub > | Sigma | # S-5761 | Prepare 7,5% NaHCO < sub > 3 < / sub> solução de estoque para mistura hormonal |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES solução de estoque para mistura hormonal |
| Insulina | Sigma | #I-5500 | Mistura hormonal |
| Apo-transferrina | Sigma | #T-2252 | Mistura hormonal |
| Putrescina | Sigma | # P7505 | Hormônio mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Mix hormonal |
| Progesterona | Sigma | #P-6149 | Mix hormonal |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μ g/ml de existências em B27 e alíquota; EFH médio |
| EGF, Sigma recombinante humano#E9644 | Prepare 100 μ g/ml de existências em B27 e alíquota; EFH medium | ||
| bFGF, Sigma humano recombinante | #F0291 | Prepare 100 μ g/ml de existências em B27 e alíquota; EFH médio | |
| Heparina, 10.000 U | Sigma | #H3149 | Preparar estoques de 27,3 mg/ml em mistura hormonal e alíquota; |
| Kit de dissociação de papaína | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contém EBSS, papaína, DNase, inibidor de protease ovomucoide com |
| BSA Pentobarbital de Sódio | Bimeda - NBA; MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Ponta padrão serrilhada; micro-ponta também disponível |
| Fórceps fino: Dumont # 4 | Ferramentas de ciências finas | # 11241-30 | |
| Microtesouras | Ferramentas de ciências finas | # 15024-10 | Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| Placas de Petri de 10 mm | Nunc | 1501 | |
| T25 Frascos de cultura | Nunc | 156367 | |
| 40 μ m filtro de células de nylon | VWR | CA21008-949 | |
| placas de 6 poços | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, fator de crescimento reduzido (100x) | Corning | 354230 | Descongele de acordo com as instruções e congele alíquotas; use diluído na proporção de 40 μ l Matrigel: 1 ml SFM |
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