As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação. A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
As células T CD4+ inexperientes (ingênuas) de antígeno sofrem expansão e diferenciação para subconjuntos efetores no momento do reconhecimento do antígeno cognato do receptor de células T (TCR) apresentado no MHC classe II. Os sinais de citocinas presentes no ambiente no momento da ativação do TCR são um fator importante na determinação do destino efetor de uma célula T CD4+ virgens. Embora o ambiente de citocinas durante a ativação de células T virgens possa ser complexo e envolver sinais redundantes e opostos in vivo, a adição de várias combinações de citocinas durante a ativação de células T CD4+ virgens in vitro pode promover prontamente o estabelecimento de linhagens T auxiliares efetoras com expressão de citocinas e fatores de transcrição. Tais experimentos de diferenciação são comumente usados como um primeiro passo para a avaliação de alvos que se acredita promoverem ou inibirem o desenvolvimento de certos subconjuntos de auxiliares de T CD4+. A adição de mediadores, como agonistas de sinalização, antagonistas ou outras citocinas, durante o processo de diferenciação também pode ser usada para estudar a influência de um alvo específico na diferenciação de células T. Aqui, descrevemos um protocolo básico para o isolamento de células T virgens de camundongos e as etapas subsequentes necessárias para polarizar células virgens para várias linhagens efetoras T auxiliares in vitro.
Introdução
O conceito de linhagens distintas ou subconjuntos de CD4 + T helper (Th) tem sido em torno desde a última parte do século 20 1. O reconhecimento de antigénio correspondente na presença de sinais co-estimuladores resultados em diversas fases da proliferação celular e da eventual diferenciação em células Th efectoras. O tipo de célula Th gerada durante este processo é dependente do ambiente citoquina presente durante a activação 2. Inicialmente, as células Th simples foram pensados para polarizar em duas linhagens distintas seguintes receptor de células T (TCR) de activação, ligação co-estimulador CD28, e sinalização de cit....
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Protocolo
Todos os procedimentos experimentais são realizados usando protocolos aprovados pelo escritório de Saúde e Segurança Ambiental da Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência. Murganhos C57BL / 6 (adquirido a partir de NCI) utilizado para este protocolo foram alojados sob condições isentas de patogénios específicos, e todas as experiências com animais foram realizadas usando protocolos aprovados pelo Comité de Cuidados e Uso de Animais Institucional (IACUC) no Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Science.
1. Preparação de Instrumentos, suprimentos e Reagentes
- O revestimento de 48 poços ou de 24 poços, placas com....
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Resultados
O ponto de tempo para a análise de diferenciação pode variar dependendo da condição a ser testado Th, bem como a força de activação do receptor de células T. Depois de 2-3 dias de diferenciação, as células podem ser visualizados por microscopia óptica para determinar a extensão da proliferação de células T. Wells expositoras extensa proliferação e aglomeração de células provavelmente estará pronto para análise no dia 4. condições de diferenciação contando com a adição de IL-2, tais como Th1 e Th2, provavelmente irá esgo.......
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Discussão
Enquanto o baço contém células Th simples, a proporção da população nos nódulos linfáticos é muito maior. Falha em identificar corretamente e remover os linfonodos neste protocolo irá resultar em um fraco rendimento de células naïve. Isto pode ser especialmente difícil nos ratos mais velhos ou ratinhos macho que têm mais tecido gordo. Como mostrado na Figura 1, a fixação adequada e de membros de pinagem animais e pele irá permitir a fácil visualização dos nódulos linfáticos exterior acessíveis. Uma vez .......
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Divulgações
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do laboratório de Reynolds em Rosalind Franklin Universidade de Medicina e Ciência, e o laboratório Chen Dong da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, para a otimização do presente protocolo. Este trabalho foi financiado por uma doação para JMR do National Institutes of Health (K22AI104941).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| RPMI completo: | Aqueça em banho-maria de 37 oC antes de usar | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10% FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoetanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamina | Life Technologies | 25030081 | |
| malha de nylon de 120 mícrons | Amazon | CMN-0120-10YD | Corte em quadrados de 2 cm2 e autoclave |
| Alternativa: filtros de células de 100 mícrons | Fisher | 08-771-19 | Alternativa para cortar malha de nylon |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Aqueça em banho-maria a 37 oC antes |
| de usar a solução de enxágue autoMACS | Miltenyi | 130-091-222 | Aqueça em banho-maria a 37 oC antes |
| de usar grânulos CD4 | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK tampão de lise | Life Technologies | A10492-01 | |
| Citocinas: | |||
| Humano (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Camundongo recombinante (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Anticorpos: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Uso a 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Uso a 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Uso a 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Uso a 1:500 |
| Acetato de 12-miristato 13 (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare um estoque a 0,1 mg/ml em DMSO e congele alíquotas a -20 o< / sup > C |
| Ionomicina | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare um estoque a 0,5 mg / ml em DMSO e congele alíquotas a -20 o< / sup > C |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use a 1: 1000 |
Referências
- Mosmann, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. A., Coffman, R. L. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 136 (7), 2348-2357 (1986).
- Dong, C., Flavell, R. A.
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