Próxima Geração Sequencing para Detecção de acionável mutações em tumores sólidos e líquidos

Summary

Este manuscrito descreve protocolos clínicos para dois painéis de sequenciamento de próxima geração. Um painel interroga malignidades hematológicas, enquanto o outro painel tem como alvo genes comumente mutados em tumores sólidos. A classificação molecular de mutações condutoras em malignidades humanas oferece informações prognósticas e preditivas valiosas.

Abstract

À medida que nossa compreensão das mutações condutoras necessárias para a iniciação e progressão dos cânceres melhora, obtemos informações críticas sobre como os perfis moleculares específicos de um tumor podem prever a capacidade de resposta a agentes terapêuticos ou fornecer conhecimento sobre o prognóstico. Em nossa instituição, um programa de genotipagem de tumores foi estabelecido como parte dos cuidados clínicos de rotina, rastreando tumores hematológicos e sólidos para um amplo espectro de mutações usando dois painéis de sequenciamento de próxima geração (NGS): um painel personalizado de 33 malignidades hematológicas de genes para uso com sangue periférico e medula óssea e um painel de tumor sólido produzido comercialmente para uso com tecido embebido em parafina fixado em formalina que tem como alvo 47 genes comumente mutados no câncer. Nosso fluxo de trabalho inclui uma revisão patologista da biópsia para garantir que haja uma quantidade adequada de tumor para o ensaio, seguida de extração de DNA personalizada no espécime. O controle de qualidade da amostra inclui etapas de quantidade, qualidade e integridade e somente após o DNA extraído passar por essas métricas, uma biblioteca de amplicon é gerada e sequenciada. Os dados resultantes são analisados por meio de um pipeline interno de bioinformática e as variantes são revisadas e interpretadas quanto à patogenicidade. Aqui, fornecemos um instantâneo da utilidade de cada painel usando dois casos clínicos para fornecer informações sobre como um fluxo de trabalho NGS bem projetado pode contribuir para otimizar os resultados clínicos.

Introduction

sequenciamento de próxima geração (NGS) de espécimes clínicos de oncologia tornou-se mais amplamente disponível ao longo dos últimos anos, como o crescimento pontos literatura científica para a importância de identificar as mudanças genéticas segmentáveis ​​e marcadores moleculares preditivos / prognósticos. Painel multi-gene análises e estudos de sequenciamento exome inteiras em ambos os epiteliais ^1,2 e hematológica ³ malignidades ter solidificado o conceito de heterogeneidade do tumor e evolução clonal como a doença progride e recaídas. Além disso, ao contrário de tecnologias concorrentes como a reação em cadeia da polimerase (PCR) ou seqüenciamento Sanger, NGS pode detectar a maioria das alterações genômicas em todos os genes do cancro clinicamente relevantes em um único ensaio ^4.

O Centro de Diagnóstico personalizados inicialmente lançado com dois painéis clínicos NGS, um costume Painel hematológica (Heme-NGS Panel) e um off-the-shelf Cancer Panel para amostras FFPE (Solid-NGS painel) (veja

Figura 1:. Lista de Genes abordados nos painéis preparação Biblioteca é realizada usando o costume Painel hematológica (Painel Heme-NGS) de 33 genes ou o off-the-shelf Cancer Panel Amplicon (Solid-NGS) de 47 genes. Nem todos os genes ou exons são cobertos na totalidade, como alguns produtos de amplificação só pode cobrir certos hotspots. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ A>

O conteúdo do painel de heme-NGS foi derivado de várias fontes, mas gira em torno de 16 genes mutados na leucemia mielóide aguda (LMA), previamente descrito como demonstrando um elevado nível de utilidade clínica ^5. O Painel Solid-NGS é produzido comercialmente com as regiões-alvo com base em genes comumente mutado no cancro como relatado no Catálogo de somáticas Mutações em Câncer (COSMIC) do banco de dados ^6.

Vários passos-chave caracterizar o fluxo de trabalho geral para NGS clínicos. Após o médico ordena o teste, um patologista determina a adequação do espécime após a análise da percentagem de tumor e volume da amostra. Em nossa instituição, exigimos pelo menos 10% do tumor devido à taxa de fundo de sequenciação de erro ( "ruído") da tecnologia e da eficiência da abordagem específica. Se o tecido é adequada para o teste, o ADN genómico é extraído. Este ADN é então sujeito a um controlo de qualidade múltipla (QC) etapas. Se o DNA passa QC, uma biblioteca de fragmento amplificado é gerado e sequenciado. Os dados resultantes são analisadas através de um gasoduto de bioinformática in-house. Após a análise bioinformática, as variantes são manualmente revisto e interpretado por patogenicidade antes da incorporação um relatório clínico. Abaixo descrevemos dois casos que passaram por esta rigorosa do fluxo de trabalho e, finalmente, levou a mudanças no manejo clínico.

Caso 1 - Leucemia Mielóide Aguda

A biópsia de medula óssea do doente A era de diagnóstico para a AML, sem maturação. Os estudos citogenéticos foram enviados sobre o espécime de medula óssea e demonstraram um cariótipo feminina normal. Houve 95% de blastos circulantes presentes, por isso, uma amostra de sangue periférico foi enviado para testes de diagnóstico personalizado no Painel de Heme-NGS.

A leucemia mielóide aguda (LMA) é uma doença maligna hematológica da linhagem mielóide de células brancas do sangue. a detecçãode mutações genéticas em AML tornou-se cada vez mais importante para o prognóstico e tratamento, com mutações genéticas recorrentes reconhecidos como importantes na patogênese e prognóstico ^7. Mutações no NPM1 e CEBPA têm sido associados com um risco prognóstico favorável, enquanto duplicações em tandem internas (ITD) em FLT3 têm sido associados com um resultado menos favorável ^8. Um crescente corpo de evidências suporta um papel patogênico para estas e outras mutações na AML ^9.

Caso 2 - Lung Adenocarcinoma

A biópsia de uma massa supraclavicular esquerdo de paciente B demonstrou adenocarcinoma pulmonar. material de biópsia a partir da (FFPE) em massa do linfonodo embebidos em parafina e fixado em formalina foi enviada para o teste genómico (painel sólido-NGS) como rolos / cachos com tumores maiores do que 50%, para identificar se uma mutação estava presente para a intervenção terapêutica alvo.

Lung cancer é a principal causa de mortalidade relacionada com o cancro nos Estados Unidos e é dividido em tipos principais, cancro dois pulmão de não pequenas células (NSCLC) e cancro do pulmão de pequenas células (CPPC). NSCLC pode ser ainda definido como qualquer um adenocarcinoma ou carcinoma de células escamosas, com base na histologia da lesão. Adenocarcinoma pulmonar é o subtipo mais comum de câncer de pulmão, visto em ambos os fumantes e não-fumantes, e é a forma mais comum de câncer de pulmão em não-fumantes ^10. Estudos moleculares de adenocarcinomas do pulmão foram identificadas mutações em vários oncogenes ^11. As mutações driver mais comuns identificados em fumantes são mutações no KRAS e BRAF. As mutações mais comuns em não-fumantes são mutações em EGFR, e rearranjos envolvendo os genes ALK, RET e ROS1. Tumores pulmonares foram descritos com um exão 20 de inserção em grelha no gene de ErbB2 (HER2 / neu). A anormalidade mais comum no HER2 / neu é uma amplificação de neste locus no cancro da mama para os quais uma terapia-alvo está disponível (trastuzumab: um anticorpo monoclonal humanizado contra HER2 / neu). O HER2 / neu exão 20 de inserção que é observado em 2-4% de pulmão adenocarcimomas ¹² demonstrou uma resposta parcial ao tratamento com combinação de HER2 / neu e inibidores de mTOR (neratinib e temsirolímus, respectivamente) ^13.

Protocol

Este protocolo compreende os passos salientes de dois testes de laboratório desenvolvidos validados para o perfil genômico de tumores sólidos e líquidos, respectivamente. O teste realizado no laboratório é feito em conformidade com as exigências dos clínicos Alterações Laboratory Improvement (CLIA) de 1988.

1. Extracção de DNA a partir de sangue periférico ou medula óssea

1. Determinar o quanto de sangue ou medula óssea a tomar com base na Tabela 1.

Amostra / WBC	Valor a ser tratado como 1 ml de sangue
Medula óssea	250 ul
WBC do sangue 12.000 - 50.000	1 mL
WBC do sangue 50.000 - 100.000	500 ul
WBC do sangue 100.000 - 200.000	200 ul
WBC Blood> 200.000	100 ul
* For Blood WBC <12.000, tomar 2 ml de sangue

Tabela 1:. Sangue / Medula Óssea Volume usar Gráfico Uma vez que a contagem de glóbulos brancos irão variar de amostra para amostra, é difícil especificar um volume específico de sangue para usar. Portanto, a quantidade de sangue a ser usado para o ensaio deve ser determinado ao olhar para a contagem de células brancas do sangue (WBC) antes de se iniciar o ensaio. Embora menos sangue é utilizado, ele deve ainda ser tratado como se os seus 1 ml uma vez que o volume de sangue utilizada é reduzida porque o número de células actual é maior do que o normal.

2. Seguir o protocolo do kit disponível comercialmente para isolar o ADN genómico.

2. Extracção de DNA a partir de (FFPE) de tecido fixadas em formalina incluídos em parafina

1. Baseado emregião do tumor o patologista circulou no slide H & E, alinhar as lâminas não coradas com o guia H & E slide e delinear uma área similar para a extração. Por macro-dissecção, processo de apenas um espécime / set do paciente de lâminas de cada vez.
2. Aquecer as lâminas sobre um bloco de calor C 45 ° para derreter um pouco a parafina. Cuidadosamente raspar o tecido dentro das linhas que são marcados no slide, usando um novo bisturi para cada amostra a ser extraído. Coloque as raspas de cera para dentro do tubo devidamente rotulados 1,5 ml. Tenha cuidado, porque a cera raspado é muito eletrostática e pode saltar para fora do tubo.
3. Adicionar 320 ul de solução para cada desparafinização cinco a seis secções de 5 um (25 - 30 | iM no total). Por exemplo, se um tubo contendo 3 secções de 10 um rolo / onda vai ser processada, em seguida, utilizar 320 ul, mas se foram obtidos 5 secções com a mesma espessura, em seguida, utiliza 640 ul.
4. Vortex vigorosamente durante pelo menos 10 segundos e executar aquia rotação numa microcentrífuga para remover o tecido / cera a partir dos lados e no tampão e para dentro da solução. Incubar a 56 ° C durante 3 minutos, e, em seguida incubar à temperatura ambiente durante 5 -. 10 min.
5. A seguir à incubação à TA, adicionar 180 ul de tampão de ATL para cada 320 ul de desparafinação solução adicionada. Picar o tecido dez vezes, utilizando uma mini-pilão estéril, utilizando um pilão nova para cada espécime. Assegurar que não há tecido preso ao pilão, pois ele pode ser muito pegajosa. Vortex a suspensão vigorosamente durante 3 segundos, depois centrifugar à velocidade máxima durante 1 min.
6. Adicionam-se 10 ul de proteinase K para a fase inferior clara. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo para garantir o tecido é novamente suspenso. NÃO vortex. Incubar a 56 ° C durante a noite com agitação a 400-500 rpm.
7. Na manhã seguinte, verificar se o tecido está completamente dissolvido (isto tenha ocorrido se a solução clara é inferior). Se a solução inferior não é clara, então vortex vigorosamente durante 3 segundos e centrifugar a velocidade máxima foR 1 min. Adicionar um adicional de 5 - 10 ul de proteinase K e incubar a 56 ° C durante um adicional de 30 - 60 min.
8. Incubar a 90 ° C durante 1 h para ajudar a reverter o formaldeído reticulação. Deixar as amostras a arrefecer até à temperatura ambiente durante 5 - 10 min e, em seguida, brevemente centrifugar cada tubo para consolidar o líquido.
9. Transferir a fase inferior clara dentro de um tubo rotulado a 1,5 ml. Se houver vários tubos provenientes das mesmas amostras de pacientes (por exemplo, o caso se vários rolos estão a ser usado), recombinar-se as fases inferiores em um tubo neste ponto. Nota: A transferência de pequenas quantidades da solução desparafinização não deve interferir com o processo de purificação, mas existe o risco de se uma grande quantidade é transferido.
10. Adicionar 2 ul de ARNase A solução. Vortex suavemente ou inverter 25 vezes e giro rápido em uma microcentrífuga. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
11. Adicionar 200 ul da solução de precipitação de proteína. Se fazer um ou dois rolos, utilize 200 mL. Se fazendo de três roloss de uma vez, em seguida, usar 400 ul. Vortex vigorosamente a alta velocidade durante 30 segundos para misturar uniformemente os tampões de lise. Incubar em gelo durante 5 min ou as amostras podem permanecer em gelo durante até uma hora.
12. Centrifugar a 5.000 xg durante 5 min. A proteína precipitada deve formar um sedimento apertado, branco. Verter o sobrenadante para um tubo de 1,5 ml rotulados, e, em seguida, incubar as amostras em gelo durante pelo menos 3 min. Centrifugar a 5.000 xg durante 3 min.
13. Adicionar 200 ul de 2-propanol (isopropanol) para cada 180 ul de tampão ATL adicionado anteriormente a um tubo rotulado 1,5 mL (pode ser necessário usar um tubo de 2 mL). Por exemplo, se fazer três rolos de adicionar 600 mL de isopropanol. Adicionar 1 ml de glicogénio para cada 180 ul de tampão ATL adicionado anteriormente para o isopropanol e inverter o tubo várias vezes para misturar.
14. Adiciona-se cuidadosamente o sobrenadante do passo de precipitação de proteína na mistura de isopropanol. Misturar o tubo, invertendo suavemente, pelo menos, 50 vezes.
15. Centrifugar a máxima spEED durante 3 min. O ADN será visível como pequeno sedimento branco no fundo do tubo.
16. Despeje ou aspirar o sobrenadante para o tubo adequado de lixo. Manter um tubo de 1,5 ml resíduos separado para cada espécime no caso do sedimento vem desalojadas por isso não vai ser perdido ou misturado com o desperdício de outros espécimes. Drenar o tubo sobre uma toalha de papel e assegurar a maior parte do isopropanol é removido.
17. Adicione 300 ml de acabado de fazer etanol a 70%. Inverter o tubo suavemente várias vezes para lavar o sedimento. Tente garantir o sedimento vem desalojado para assegurar uma limpeza mais profunda.
18. Centrifugar a velocidade máxima para 5 min. e em seguida, remover cuidadosamente o etanol. O pellet pode estar solto, então sirva ou aspirar lentamente e observar o sedimento. Remover o excesso de etanol a partir do interior do tubo, sem tocar no sedimento. Permitir que as amostras para secar ao ar durante 5-15 min, tendo o cuidado de não mais secar a amostra.
19. Adicionar entre 25-100 ul de DNA Hydration Solução para eACH amostra com base no tamanho do sedimento de DNA e a quantidade de partida de tecido. Vortex os tubos vigorosamente e rapidamente girar em uma microcentrífuga. Incubar durante 1 hora a 65 ° C para re-hidratar completamente o ADN.

3. Genomic Controle de Qualidade DNA

Nota: Há três passos independentes para o controle de qualidade do DNA (QC). Ver Tabela 2 para mais explicações sobre por que cada passo QC é realizada.

Instrumento	Resultado	Indicação	ideal Gama
DropSense96	A260 / A230	Identificação de contaminantes químicos (por exemplo, etanol)	1,50-2,2
DropSense96	A260 / A280	Identificação de contaminantes proteicos	1,60-2,2
DropSense96	Concentração	quantificação do DNA	> 1 ng / ul
TapeStation	DNA Smear	Determinação da integridade do ADN (por exemplo, a degradação / fragmentação do ADN extraído)	50%> 1000 pb
qubit 2.0	Concentração	quantificação do DNA mais precisas	> 1 ng / ul

Tabela 2:. DNA QC Resultados Esperados Todos estes valores são tidos em conta antes de executar permitindo uma amostra para avançar para a fase de preparação da biblioteca.

1. Seguindo o protocolo do fabricante, executar 2 ul do DNA extraído de um fluorómetro para se obter a concentração de trabalho (ng / mL) da amostra.
2. Corra 1 - 2 ul de cada amostra numa UV / VIS para verificar a qualidade da amostra (A260 / A230 e A260 de rato / A280ios) de acordo com as instruções do fabricante.
3. Para amostras de FFPE: Seguindo as instruções do fabricante, a corrida 1 ul de cada amostra num sistema de electroforese em gel de microfluidos para avaliar a degradação / fragmentação do ADN. Veja a Figura 2 para exemplos.

Figura 2:. O DNA genômico QC Gel Exemplo A linha verde sobre as bandas mais baixos é para indicar o marcador inferior. A linha vermelha adicionou-in é indicar aproximadamente 1.000 pb. Pista A2 representa DNA totalmente intacta, como seria de esperar de sue tis fresco (por exemplo, sangue periférico ou medula óssea). Lanes B1, C1 e D1, B2, C2, E2 são exemplos de boa DNA FFPE, intacta. O ADN em F2 pista parece estar intacto, mas em uma concentração demasiado baixa. O DNA no G2 pista é degradado ou fragmentada e não funcionará no ensaio. Lanes E1, F1, G1, H1, D2,H2 representar DNA que cai na "zona cinzenta" o que significa que o ensaio pode funcionar bem, mas alguns do DNA poderia ser muito danificado ou reticulado e, portanto, não terá um bom desempenho no ensaio. Por favor clique aqui para ver uma maior versão desta figura.

4. Biblioteca Preparação Amplicon

1. Hibridização de Oligo Pool and Extension-ligadura de Oligos Vinculadas
   1. Na sala de Pré-PCR, adicionar o volume necessário de Baixa EDTA TE, 5 ul de tubo Oligo do Painel (por exemplo, Solid-NGS Painel ou heme-NGS Painel), e 100-250 ng de ADN genómico de cada um correspondendo bem em um semi-contornado 96 bem como a placa marcado (HIB) placa de hibridação.
   2. Adicionar 40 ul de Oligo hibridação para Sequencing Reagente 1 (OHS1) para cada amostra na placa HYB. Pipeta suavemente para cima e para baixo pelo menos 5 - 6 vezes para misturar. Alterar pontas depois de cada coluna para evitarcontaminação cruzada.
   3. Selar a placa HYB com folha de alumínio adesiva e centrifugar a 1000 xg durante 30 segundos.
   4. Incubar a placa na incubadora HYB hibridação pré-aquecida a 95 ° C durante 1 min. Ajustar a temperatura da incubadora hibridação a 40 ° C. Continuar a incubação, enquanto que leva a incubadora para diminuir de 95 ° C a 40 ° C (~ 90 min). Nota: Este arrefecimento gradual é crítica para hibridação correcta.
   5. Durante o último 15 - 20 min da incubação de hibridação, pré-lavar a unidade de filtro Plate (FPU). Apenas preparar os poços a serem usadas no ensaio de corrente, isto é, apenas usar poços frescas / não utilizados de uma placa de filtro previamente aberta, mas nunca poços que foram utilizados re-utilização. Nota: Isto deve ser claro com base no Kit Número na placa de filtro, as marcações na placa de filtro, e o selante utilizado ao longo da placa.
      1. Usando uma pipeta de multi-canal, adicionar 45 ul de uma lavagem rigorosa (SW1) a cada poço.
         
      2. Se existir líquido residual, rodar a 180 ° FPU e repetir o passo de centrifugação novamente durante mais 3 min. Se o líquido residual gira através do segundo tempo, depois prosseguir para o próximo passo, se não, então pode haver um defeito na placa de filtro e a placa de corrente terá de ser substituído.
   6. Uma vez que a hibridação incubadora tenha arrefecido a 40 ° C, centrifugar a placa a 1000 xg durante pelo menos 30 segundos a 20 ° C para recolher a condensação. Transferir todo o volume de cada amostra da placa de HIB para o centro das cavidades correspondentes pré-lavados da FPU. Alterar dicas após cada coluna para evitar a contaminação cruzada. Cubra a FPU e centrifugar a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C.
   7. Adicionar 45 ul de SW1 e centrifugar a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C. Repetir para um total de duas lavagens. Gire o FPU 180 ° e centrifugar novamente a 2.250 xg por 3 min para remover completamente todo o SW1.
   8. Dissimular a FPU. Descarte todo o flow-through (contendo formamida) no recipiente adequado. Remontar o FPU usando uma placa de coleção Waste MIDI diferente. Adicionar 45 ul de tampão Universal 1 (UB1) a cada poço de amostra e centrifuga-se a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C. ATENÇÃO: Contém formamida.
   9. Adicionar 45 ul de mistura de extensão Ligadura 3 (ELM3) para cada poço de amostra na placa FPU e pipeta-se para baixo e 3 vezes para misturar. Nota: A reacção de extensão-ligação ocorre na membrana placa de filtro.
   10. Selar a placa com folha de alumínio FPU adesiva e incuba-se todo o conjunto em FPU um pré-aquecida a 37 ° C incubadora durante 45 min.
2. Indexação e PCR Amplification
   1. Aliquota os índices a ser usado para os poços correspondentes na indexado amplificação Plcomeu (IAP), organizando os iniciadores no suporte Índice de Placa, dispostos da seguinte maneira: tubos de primers i5 (gorros brancos, solução clara) verticalmente, alinhados com as linhas de A a H, tubos i7 Primer (tampas laranja, solução amarelo) horizontalmente , alinhado com colunas de 1 a 12. Usando um p10 pipeta multi-canal, adicione 4 mL de primers i7 (solução amarela) para cada linha do IAP e adicione 4 mL de primers i5 (solução clara) para cada coluna do IAP.
   2. No gelo ou um bloco de resfriamento, preparação da PCR Master Mix, adicionando 0,5 ul de DNA polimerase 1 (TDP1) a 25 ul de PCR Mix Master 2 (PMM2) por amostra. Inverter, rapidamente vortex, e brevemente centrifugar a PCR Master Mix para misturar.
   3. Adicionar 22 ul da PCR Master Mix para cada poço da IAP e pipeta-se para baixo e 3 vezes para misturar. Alterar dicas entre poços. Mantenha o IAP a 4 ° C.
   4. Após a 45 min de reacção de Extensão-Ligadura (passo 4.1.10), remova o FPU da incubadora e cuidadosamente remover o aluminum selo de alumínio. Cubra com a tampa e centrifugar a 2250 xg durante 3 min a 20 ° C.
   5. Adicionar 25 ul de NaOH 50 mM a cada poço de amostra na FPU. Pipeta cima e para baixo pelo menos 6 vezes; garantir que as pontas de pipeta entram em contacto com a membrana. Alterar dicas após cada coluna. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
   6. amostras de transferência de fluido a partir da FPU para a IAP como se segue:
      1. Usando uma pipeta de multi-canal P100 ajustado para 20 ul, pipetar o NaOH na placa FPU cima e para baixo, pelo menos, 6 vezes. Incline ligeiramente a placa FPU para garantir a aspiração completa da placa.
      2. Transferir 20 ul da FPU para a coluna correspondente do IAP. Pipeta suavemente para cima e para baixo, pelo menos 6 vezes para combinar completamente o DNA com a PCR Master Mix. Selar o IAP com filme adesivo e centrifugar a 1000 x g durante 1 min a 20 ° C.
   7. Traga a placa de PCR para a sala de Pós-PCR e carregar a placa em um termociclador. Execute o PCR program consistindo de um passo de desnaturação térmica a 95 ° C durante 3 min; seguido por 25 ciclos de 95 ° C durante 30 seg, 62 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 60 seg; seguido por uma extensão final de 72 ° C durante 5 min; terminando com uma retenção a 10 ° C. Se não se proceder à próxima etapa, após a conclusão da PCR, a placa pode permanecer no termociclador durante a noite, ou pode ser armazenado a 2 a 8 ° C até dois dias.
3. PCR Purificação e Normalização Bead-Based
   1. Remover as esferas magnéticas de purificação, eluição tampão (EBT), e reagentes de electroforese em gel a partir do frigorífico C 4 ° lugar à TA e, pelo menos, 20 min antes da fase seguinte.
   2. Uma vez que a PCR é completa, centrifugar a 1000 x g durante 1 min a 20 ° C para recolher a condensação. Transferir 1 ul de cada reacção de PCR para retirar tubos poços / placa contendo 4 mL de água para diluir as amostras de 1/5. Pipeta cima e para baixo para misturar.
   3. Adicionar 2 ml daamostras diluídas PCRed a 2 ul de tampão de microfluidos-gel. Selar a tiras / placa. Agitar a 1.800 rpm durante, pelo menos, 30 segundos e centrifugar a 1000 xg durante 30 seg. Seguindo o protocolo do fabricante, executa-se a mistura sobre um gel de microfluidos para avaliar se a preparação da biblioteca rendeu uma biblioteca aceitável (ver Figura 3).
   4. Vortex as contas de purificação magnéticas até que eles são bem-suspenso e a cor aparece homogênea. Adicionar 45 ul de os grânulos de cada amostra.
   5. Selar a placa com película adesiva clara e agitar a placa a 1.800 rpm por 2 min. Incubar à temperatura ambiente sem agitação durante 10 min.
   6. Colocar o prato sobre um suporte magnético. Uma vez que o sobrenadante foi solucionada, remova e elimine cuidadosamente o sobrenadante. Se todas as pérolas são inadvertidamente aspirado para as pontas, dispensar as contas de volta para o prato e deixe o resto placa sobre o ímã por 2 min e confirmar que o sobrenadante foi eliminada.
   7. Com a placa em tele suporte magnético, adicionar 200 ul de etanol preparada de fresco de 80% a cada poço de amostra. Mova a placa e para trás algumas vezes. Incubar a placa sobre o suporte magnético durante 30 seg. Cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante. Repetir para um total de duas lavagens.
   8. Remover o excesso de etanol por centrifugação breve a placa a 1000 xg para reduzir qualquer etanol sobre os lados do tubo, colocando a placa de volta para o suporte magnético, e utilizando uma pipeta multi-canal p10 ajustado para 10 mL para remover o etanol. Permitir que as contas para secarem naturalmente durante 5-8 min.
   9. Usando uma pipeta de multi-canal P100, adicionar 30 ul de EBT para cada poço. Pipetar cima e para baixo algumas vezes para garantir que os grânulos de vir para fora do lado do tubo. Selar a placa com película adesiva clara e agitar a placa a 1.800 rpm por 2 min.
   10. Incubar à temperatura ambiente sem agitação durante 3 min. Se existem amostras em que os grânulos não são completamente ressuspensas, gentilmente pipeta cima e para baixo para ressuspender as esferas.
   11. Coloque a placa em um suporte magnético. Usando uma pipeta de multi-canal P100, transferir 20 ul de sobrenadante para uma placa totalmente nova chamada de placa da biblioteca de Normalização (LNP). Transferir os restantes ~ 10 ul das bibliotecas de sequenciamento individuais para uma placa separada chamada de limpa-up Biblioteca Placa restante (RCLP). Conserva-se a placa ao longo com a preparação da biblioteca final, uma vez que pode ser usado como uma reserva para uma segunda sequenciação de execução, se necessário. Se não se proceder à próxima etapa, o LNP e RCLP podem ser armazenadas a -15 a -25 ° C.
   12. Vigorosamente vórtice e ressuspender o Biblioteca de normalização Beads 1 (LNB1). É crítico para ressuspender completamente o sedimento LNB1 talão na parte inferior do tubo. Preparar a mistura de normalização, através da mistura de 8 mL de LNB1 com 44 ul de Biblioteca Normalização Aditivos 1 (LNA1) por amostra. Vigorosamente vortex do Mix Normalização para 10-20 seg.
       CUIDADO: LNA1 contém formamida.
   13. Com intermitente inversão umND vórtex da mistura de Normalização, adicionar 45 ul de cada amostra de LNP. Selar a placa com película adesiva clara e agitar a placa a 1.800 rpm por 30 min. Este 30 min de incubação é crítica para a normalização biblioteca adequada como incubações de maior ou menor do que 30 minutos podem afectar representação biblioteca e densidade de agrupamento.
   14. Durante os 30 minutos de incubação, preparar os reagentes para a sequenciação por degelo o cartucho de reagente e solução tampão Hib (HT1) [CUIDADO: Ambos contêm formamida]. Além disso, se gelo para uma etapa posterior e assegurar um bloco de aquecimento adequado para tubos de 1,5 ml de centrífuga é definido como 96 ° C.
   15. Quando a etapa de mistura 30 min estiver concluída, coloque o LNP em um suporte magnético. Uma vez que o sobrenadante foi desmarcada, use uma pipeta multi-canal para remover com cuidado e descartar o sobrenadante para o recipiente adequado de lixo.
   16. Remover o LNP do suporte magnético e lavagem das pérolas com Biblioteca de Normalização de lavagem 1 (LNW1) como se segue:
       1. Adicionar 45ul de LNW1 a cada poço de amostra.
          ATENÇÃO: Contém formamida. Selar a placa com película adesiva clara e agitar a placa a 1.800 rpm por 5 min. Repetir para um total de duas lavagens. Certifique-se de remover todo o LNW1 após a segunda lavagem.
   17. Remover o LNP do suporte magnético e, utilizando uma pipeta multi-canal, adicionar 30 uL de NaOH 0,1 N (menos de uma semana de idade) a cada poço para eluir a amostra. Selar a placa com película adesiva clara e agitar a placa a 1.800 rpm por 5 min.
   18. Durante os 5 minutos de eluição, adicionar 30 ul de tampão de armazenamento da biblioteca Normalização 1 (LNS1) para cada cavidade a ser usada numa nova placa com o nome da placa de armazenamento (PEC).
   19. Coloque o LNP no suporte magnético. Uma vez que o sobrenadante foi solucionada, transferir a eluição 30 ul à LNS1 no PEC. Alterar dicas entre as amostras para evitar contaminação cruzada.
   20. Selar a placa com película adesiva e centrifugar a 1000 xg durante pelo menos 30 seg.
   21. Adicionar 51; l de cada amostra a ser sequenciada para um amplicon biblioteca agrupada marcado (PAL) tubo de 1,5 ml. Vortex do PAL para misturar e brevemente girar para baixo em uma microcentrífuga.
   22. Dependendo do que química sequenciação sendo usado (V2 ou V3) adicionar 4 - 10 ul de PAL para 590 - 596 ul de HT1. Geralmente, adicionar 5,8 mL de PAL para 595 ul de HT1 para a química V2 e 8,5 ul de PAL para 592 ul de HT1 para a química V3. Rotular como este tubo o tubo diluído amplicon biblioteca (DAL).
   23. Vortex da DAL e brevemente girar para baixo em uma microcentrífuga. Incubar a DAL a 96 ° C durante 2 min. Inverta o tubo DAL 3 vezes e colocar o DAL no gelo por pelo menos 5 minutos, enquanto se prepara o sequenciador para o sequenciamento. Após a 5 min, a DAL está pronto a ser carregado.
   24. Se terminou com a PEC, selar a placa com película de folha de alumínio adesivo e rotulá-la com a data ea placa de identificação. Armazenar o PEC selado e PAL a -15 a -25 ° C.

Figura 3:. Biblioteca Prep QC Gel Exemplo A linha verde sobre as bandas mais baixos é para indicar o marcador inferior e a linha roxa sobre as bandas superiores é para indicar o marcador superior. Tudo funcionou bem para pistas H1, A2, B2, C2, E2 e G2. A preparação da biblioteca não funcionar de forma ideal, para pistas D2, F2, e H2, mas os resultados ainda serão obtidos eles simplesmente não pode ter uma cobertura adequada. Para A3, o prep biblioteca apenas Trabalhou e muito provavelmente esta amostra de DNA não era adequada para o ensaio. As faixas mais baixas acima do marcador inferior são os iniciadores não utilizados, porque a alíquota é tirada diretamente do PCRed bem. A amostra NTC só deve ter a banda do primer não utilizado, e nada mais. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

5. Sequencing

1. Assegurar uma SampleSheet.csv correto foi feito para o prazo. Ver Figura 1 para suplementar um exemplo.
2. Enxaguar e secar a célula de fluxo e adicionar 600 ul de DAL para o cartucho de reagente descongelado.
3. Prepare o sequenciador para o seqüenciamento seguindo as instruções na tela.

Análise 6. Os dados

1. Executar o pipeline de bioinformática. Utilizar o gasoduto bioinformática em casa, projetado para identificar as mutações, inserções, exclusões e amplificações ^18.
2. Após o gasoduto foi concluído, verifique os arquivos de log para erros / aviso, como qualquer significativa ajuda erros / avisos na QC do processamento pipeline.
3. Analisar as estatísticas de execução (Tabela 3) para assegurar a biblioteca sequenciado passou no laboratório determinou métricas QC (Figura 4). Rever manualmente cada variante, visualizando os arquivos .bam em um visualizador de dados genômicos (por exemplo, o Integrative Genomics Viewer ¹⁶ (IGV)).
   NOTA: Somente as variantes dentro do intervalo alelo-frequency validado e acima da profundidade mínima de cobertura após a filtragem de qualidade são relatados (utilizando a nomenclatura da Human Genome Variation Society (veículos pesados)). Para a apresentação final, cada variante exônico foi categorizada em: patogênico, provavelmente doença associada, a variante de significado desconhecido (USV), provavelmente benigna, e benigno. Todas as variantes acima dos critérios de relatórios de freqüência do alelo 5%, exceto aquelas variantes benignas consideradas e mudanças sinônimas, foram relatados.

Figura 4. Visão Geral de Controle de Qualidade Passos para NGS. O controle de qualidade de cada etapa do processo é necessário para garantir o sequenciamento trará resultados tais que as métricas de seqüenciamento pré e pós são considerados. tratamento da amostra adequada é essencial para DNA de alta qualidade. e sanguemedula óssea em fixadores inadequados podem produzir DNA de baixa qualidade. Fixação inadequado de amostras de tumores sólidos pode degradar ADN (por exemplo, fixação em B5). qualidade do DNA deve ser avaliada para a proteína e contaminação RNA por meio de espectrofotometria, e avaliados com precisão para a quantidade e integridade do DNA. As métricas de sequenciação têm de ser empiricamente determinadas no laboratório de sequenciação e seguido para cada reacção de sequenciação e a cada espécime. Antes de relatar os resultados de sequenciamento para cada amostra deve ser avaliada para a cobertura, profundidade e desempenho adequado de controlos positivos e negativos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Results

Caso 1 - Heme-NGS Painel

O DNA extraído a partir de sangue periférico leucémicas era de qualidade suficiente e quantidade (176 ng / mL) para o painel de heme-NGS. A profundidade média geral de cobertura foi de 4,933x (acima da profundidade média mínima de cobertura de 1.000x). Estatísticas adicionais de execução estão na Tabela 3. Dos 8 regiões abaixo cobertura 250x, 3 foram causadas por aparamento imprópria dos iniciadores (isto é, a sequência de iniciador não foi adequadamente removida devido a erros de sequenciação), um era um artefato conhecido do ensaio, e os outros 4 eram regiões parciais de exons de diferentes genes sem variantes reportáveis. Embora o nosso protocolo clínico inclui apenas relatando variantes cobertos por, pelo menos, 250 lê, todos os dados com pelo menos 100 leituras são importados para o banco de dados para análise.

processamento de dados from do gasoduto bioinformática detectados três mutações reportáveis, associados à doença; uma mutação missense no FLT3, uma mutação missense no IDH2, e uma mutação frameshift em NPM1. As variantes ex�icas com suas freqüências alélicas estão descritos na Tabela 4. Uma mutação comum em FLT3 é a FLT3 -Internal duplicação tandem (ITD), que não é chamado automaticamente pelo nosso pipeline e requer uma inspecção visual do exão 14. Inspecção visual do exão 14 de FLT3 não mostrou inserção ou duplicação na amostra apresentados. A FLT3 I836del estava na freqüência do alelo 1% e não foi incluído no relatório final porque caiu abaixo da freqüência do alelo mínimo validado de 5%. Esta mutação não é na mesma molécula de ADN como a mudança de FLT3 D835Y (isto é, observada na mesma região amplicão, mas não em "cis", em qualquer das sequenciação leituras) e apenas foi observada por avaliação manual da fi .bamles ao verificar a mudança p.D835Y. As frequências alélicas inferiores das duas mutações de FLT3 sugere que estas mutações podem representar heterogeneidade e / ou evolução clonal; No entanto, a diferença pode ser devido ao desempenho do ensaio para que amplicão ou um polimorfismo de um único nucleótido-(SNP), perto ou sobrepostas a sequência iniciadora que afectou a amplificação desse alelo.

Os resultados do Painel Heme-NGS Para o caso 1 com mutações AML identificados em FLT3, IDH2 e NPM1, três genes comumente mutados em AML. As mutações em FLT3 são observados em ~ 25% dos pacientes adultos com leucemia mielóide aguda (banco de dados COSMIC ¹⁷⁾ e são ou duplicações em tandem interna (ITD) ou mutações missense no domínio da tirosina quinase. Os FLT3-ITD é a mutação mais comum e está associado com má resposta à quimioterapia padrão, enquanto o significado prognóstico da FLT3 quinase dmutações pontuais omain, como visto neste paciente AML, tem um impacto claro sobre o prognóstico ^14. Isocitrato desidrogenase 2 (NADP +), mitocondrial (IDH2) é um gene que codifica um modificador epigenética que é comumente mutado em AML. Mutações nos modificadores epigenética são relativamente comuns no LMA, com mutações em IDH1 e DNMT3A representam outras mutações nesta classe de genes que levam a desregulação do gene. As mutações no gene de nucleofosmina (NPM1) são uma das mutações mais comuns adquiridas em AML e são geralmente considerados a ser um bom factor de prognóstico (na ausência de um FLT3 - ITD).

Co-mutações de NPM1 e o IDH2 têm sido descritos na literatura como um indicador de prognóstico favorável ^5, com um 3-ano de sobrevivência global de 89%. Isto representa uma vantagem de sobrevida significativa quando comparada com a sobrevivência geral de 3 anos detipo selvagem NPM1 e IDH2 de 31%. Por exemplo, padrão de prática de cuidados inclui a análise de mutação para NPM 1 e mutações FLT3-ITD. Neste cenário, a detecção de apenas uma mutação NPM1 não seria suficiente para adequadamente paciente stratify para o risco, como as mutações secundárias pode ser favorável (por exemplo, IDH2) ou desfavorável (por exemplo, TET2), reduzindo a confiança para aliviar um transplante de medula óssea.

Caso 2 - Painel de Solid-NGS

ADN extraído a partir do tecido FFPE era de qualidade e em quantidade suficiente para o Solid-NGS painel, com uma concentração de 252 ng / mL e apenas 4% do ADN abaixo de 1.000 pares de bases (pb). Após a análise dos dados a profundidade média de cobertura foi de 9.167 lê (bem acima da nossa corte profundidade mínima de 1.000 leituras) sem regiões abaixo de 250 profundidade de leitura. métricas QC adicionais estão shoWN na Tabela 3.

Dados processados ​​através do gasoduto bioinformática detectadas duas mutações associadas à doença: uma inserção em quadro no exão 20 de ErbB2 (Her2 / neu) e uma mutação missense no TP53. Todas as variantes ex�icas com suas freqüências alélicas estão representados na Tabela 5. A inserção no ERBB2 na verdade representa uma seqüência conjunto duplicado (Her2 / neu), como refletido na nomenclatura. Identificação e confirmação da revisão manual em quadro de inserção necessária do sequenciamento lê através IGV. A detecção das frequências de mutação de mais do que 50%, como pode ser visto, tanto para o gene TP53 e o Her2 / neu mutações é sugestivo de uma perda de heterozigotia (LOH) evento (ver discussão).

Os-NGS sólidos resultados do Painel de Caso 2 com mutações adenocarcinoma de pulmão detectados in ERBB2 (HER2 / neu) e TP53, dois genes que normalmente não são testados como parte do padrão de cuidado atual para pacientes com câncer de pulmão. HER2 / neu codifica um receptor tirosina-quinase semelhante a outro gene comumente mutado no cancro do pulmão, EGFR . A activação de HER2 exão / neu 20 inserções são observados em 2 - 4% de adenocarcinomas do pulmão, são responsáveis ​​pela maioria das mutações de HER2 / neu observados no cancro do pulmão, e são tipicamente observados em tumores sem mutações em outros genes do controlador, tais como EGFR e ALK ¹² . Existem várias linhas de evidência mostrando potencial para várias opções de tratamento para pacientes com ativação de inserções HER2 / neu, incluindo resposta parcial a terapia de combinação com HER2 / neu e inibidores de mTOR ¹³ e controle de doenças significativa com o anticorpo monoclonal Trastuzumab em conjunto com quimioterapia ^15. Descobrir uma mudança TP53 não é uncoMMON no cancro, mas neste momento não há terapias viáveis.

	Caso 1	caso 2
Iniciando total Lê	2.215.926	2.129.110
Percentagem de Lê Mapping	98,42%	98,29%
Percentagem de Lê no alvo	99,01%	97,29%
Percentagem de Lê no alvo Depois de Filtro	97,60%	95,45%
Percentagem de utilizável Lê	94,87%	91,79%
Percentagem de Bases acima Cobertura 250x	98,40%	100%
Percentagem de Bases umabove 1000x Cobertura	95.90%	99,70%
Cobertura Abaixo 250x - Amplicon Número	8	0

Tabela 3:. Sequencing Run QC Metrics Este é um resumo das estatísticas de execução mais importantes, não incluindo a cobertura média, que são utilizados para a avaliação de dados para determinar se uma amostra biblioteca prep passou QC. Todo o processo é bem sucedido se todas as percentagens são acima de 90%, mas é possível, com a transição de SW1 ou UB1 no passo de lavagem FPU ou cross-talk iniciador, ter inferior »por cento no alvo" na gama de 80 - 90%. Se o "Percentagem mapeada" é demasiado baixo, que poderia indicar uma contaminação de bactérias ou outro DNA, como todas as amostras devem estar alinhadas para humano. Quando qualquer uma destas especificações estão abaixo de 80%, a amostra é apanhado em nova revisão para ajudar a determinar a forma de proceed e melhorar o processo.

Tabela 4:.. Caso 1 Resultados detectado patogênicas, doença associada, variantes de significado desconhecido (USV), e variantes ex�icas provavelmente benignos acima dos critérios de relatórios de freqüência do alelo 5% estão relacionados Por favor clique aqui para baixar esta tabela.

Tabela 5:.. Caso 2 Resultados detectado patogénica, doença associada, a variante de significado desconhecido (USV), e as variantes ex�icas provavelmente benignos acima dos critérios de relatórios de freqüência do alelo 5% estão listados Por favor clique aqui para baixar esta tabela.

Suplementar Figura 1: Um exemplo de uma base SampleSheet.csv-amplicão. Esta folha transmite para o sequenciador de que a química de correr (neste caso do amplicon), o fluxo de trabalho (por exemplo, GenerateFastq), o que a aplicação e o ensaio (por exemplo, FastqOnly), quantas bases (ou lê) em sequência (neste caso 186 pb x 186 pb), e por último o que as amostras estão associadas com certos índices (neste caso duplo de indexação). As peças que estão destacadas em amarelo pode ser mudada ao que o pesquisador quer, mas neste caso o laboratório usa esses parâmetros. Por favor clique aqui para baixar este valor.

Discussion

Como os dois testes NGS descritos neste manuscrito são oferecidos clinicamente, a consideração prática mais importante é o controle de qualidade. Especificamente, perto consideração deve ser dada à qualidade e quantidade de DNA extraído. Isto é especialmente importante para as amostras FFPE que são muitas vezes altamente degradada com um rendimento de ADN variável. Um método de precipitação com isopropanol foi desenvolvido a fim de maximizar o rendimento de ADN a partir de amostras de FFPE como métodos baseados em colunas foram encontrados para levar, por vezes, a tosquia de ADN com volumes de eluição limitados. Portanto, a maior parte do tempo quando uma amostra produz muito baixa concentração ou é muito degradada para o ensaio, isto é provavelmente devido ao tamanho do tecido, o tipo ou a fixação e não o processo de extracção. Para amostras / da medula óssea do sangue, se houver uma falha de extracção, é geralmente devido a um hemodilute amostra a ser (ou seja, não tendo o número suficiente de células brancas do sangue ou tumores em que sorteio) ou quimio extirpadas.

. Nt "> Durante a validação, pontos de corte para a aceitação da qualidade e quantidade de DNA deve ser estabelecida A entrada recomendada de 100-250 ng é muitas vezes usado no ensaio; no entanto, se a qualidade do DNA é boa, em seguida, mais baixos valores de entrada pode ser bem sucedido. Além disso, se a qualidade do DNA é deficiente (ou seja, a quantidade de ADN amplificável é menos de 100-250 ng), em seguida, quantidades de entrada mais elevadas podem melhorar a qualidade dos resultados da sequenciação (uma vez que a quantidade de ADN amplificável irá alcançar a entrada recomendada) . Métricas para a qualidade e quantidade de DNA deve ser aplicado a cada amostra antes de avançar o DNA em preparação biblioteca. Essas amostras em uma "zona cinzenta" (ver Figura 2) deve ser executado a critério do diretor do laboratório ou pessoa designada. Atualmente o melhor forma de prever se o ADN não será um bom desempenho durante a sequenciação é a realização de um ensaio à base de qPCR que permite a quantificação e a qualidade de avaliação de ADN de entrada. Esta abordagem elimina a bioavailability de diferentes fragmentos de tamanho na amostra, através da amplificação de diferentes fragmentos de tamanho (por exemplo, 100 pb, 150 pb, 200 pb e 300 pb) e comparação de rendimento.

Actualmente, a preparação da biblioteca envolve um grande número de etapas manuais que um passo em falso em um dos vários momentos pode causar a biblioteca para falhar ou ser de má qualidade. A análise gel microfluídico é o único passo QC para verificar um problema de biblioteca de preparação antes de seqüenciamento. Consequentemente, existem diversos passos críticos onde atenção adicional pode aumentar a probabilidade de uma reacção bem sucedida. É imperativo para garantir a amostra correcta e banco de oligonucleótidos são utilizadas para cada espécime. Garantir e devidamente gravação que cada amostra contém uma das 96 combinações únicas de pares de primers de PCR de dupla indexado reduz a chance de um mix de amostra para cima. Além disso, é importante para garantir a placa de filtro (FPU) drena correctamente; se não drenar adequadamente esta pode causar o exteetapa nsion-ligadura da preparação biblioteca para executar subótima e levar a qualidade dos dados de sequenciamento pobres. Após biblioteca QC, é crítico para assegurar que os grânulos estejam totalmente LNB1 ressuspensas e que a solução LNB1 / LNA1 é bem misturado antes de adicionar as amostras como a concentração desta mistura é usada para determinar a molaridade da biblioteca. Finalmente, se o passo de eluição do grânulo leva a uma quantidade sub-óptima de biblioteca eluindo fora dos grânulos que irá diminuir a densidade de agrupamento e, eventualmente, causar a biblioteca para obter a cobertura não significativo adequada. Por outro lado, um excesso da biblioteca vai levar a uma qualidade lê. Portanto, é importante ser consistente na etapa de normalização baseadas em esferas para assegurar o agrupamento óptima e agrupamento das bibliotecas no sequenciador.

Além disso a preparação da biblioteca, que é crítico para validar um oleoduto bioinformática que irá produzir as chamadas de mutações precisas, a partir dos arquivos fastq desmultiplexado em bruto. escolhendo umsolução personalizada pode ser demorado, pois há muitos alinhadores de código aberto e disponíveis comercialmente, os chamadores variantes, e pacotes de software NGS que seria preciso peneirar. algoritmos personalizados terá de ser concebido para obter estatísticas de desempenho essenciais, identificar mutações recorrentes únicas que escapado ferramentas de código mais abertos e determinar o status do número de cópias sobre cada um dos loci. Durante o processo de validação de um oleoduto bioinformática, é importante para determinar os pontos de corte reportados para as variantes que satisfazem ou excedem tanto uma profundidade mínima de cobertura depois da filtragem da qualidade (por exemplo, um mínimo de 250 leituras) e uma frequência de alelos mínimo (por exemplo, 4 %). Uma vez que este um ensaio baseado em amplicão multiplexados, é importante para determinar o comprimento médio mínimo da profundidade de cobertura (por exemplo, 1.000 vezes) que a biblioteca necessita para conseguir a ser capaz de obter o menor fragmento amplificado realizando a profundidade mínima de leituras. Além disso, a natureza multiplexada do ensaio faz Cause off efeitos alvo e estes "artefatos" terá de ser descoberto e totalmente controlados antes do lançamento. Outra limitação importante para o ensaio descrito é a necessidade de amostras para conter mais de 10% do tumor, a fim de atingir a frequência do alelo menos validado.

A detecção de frequência baixa, 1%, inserções FLT3 é evidência de que a análise manual é ainda desejável neste processo. Mesmo com um corte de 5% freqüência do alelo, algumas mutações importantes talvez não atendidas e, assim, a revisão manual será essencial para determinar estas variantes. Para FLT3-ITD, inspeção visual do exão 14 é realizada para todos os pacientes com LMA para garantir um nível baixo ou grande inserção / duplicação não passa despercebido. Além disso, HER2 exão 20 inserções que são vulgarmente próxima à sequência de iniciador, necessitar de intervenção manual. Apesar de ter um pipeline de bioinformática robusta, algumas variantes poderia passar despercebida, que é apenas a natureza de ter um corte durooff para a maioria das estatísticas mencionadas acima. bioinformática melhores seriam necessários para ajudar a aliviar este problema, assim como as metodologias de preparação e / ou sequenciamento melhor biblioteca, porque é mais vantajoso ter dados de qualidade a cortes ainda mais baixas que contêm menos artefatos e falsos positivos.

A detecção e a interpretação de frequências de alelos pode ser difícil devido à dificuldade na determinação de tumores e de polarização percentagem amplificação de algumas regiões do genoma. Além disso, as frequências de alelos mais de 50% pode ser detectada, como observado no caso 2. Isto é interpretado como uma perda de heterozigotia (LOH) evento, quer devido à perda do alelo normal, o que conduz ao aumento aparente de mutante lê, uma ganho do alelo mutante (por exemplo, 2 mutante e uma cópia normal) ou outros mecanismos. Estes mecanismos podem ser elucidadas pela utilização de matriz de hibridação comparativa genómico (aCGH ¹⁹⁾ e / ou uma matriz de genotipagem de SNP. ^20.

As metodologias de enriquecimento alvo atuais contam com procedimentos de dia inteiro de qualquer das técnicas de PCR multiplexados captura híbrida ineficiente ou que resultam na necessidade de uma maior cobertura sequenciamento de uma única amostra e mais off sequenciamento alvo lê. Aplicações adicionais para oncologia molecular NGS esperadas no futuro próximo, irá incluir mais fáceis métodos de preparação de bibliotecas que podem ser completamente automatizável e ser capaz de processar as amostras com quantidades muito pequenas de ADN de entrada (ou seja, menos de 1 ng), bem como amostras com altamente degradada ADN. Para enfrentar esses desafios, a maioria dos métodos será presumivelmente, baseado na PCR, quer ser uma abordagem de PCR de várias etapas ou uma abordagem PCR singleplex massivamente paralelo. Além disso, o código de barras molecular de produtos de amplificação individuais foi demonstrado reduzir drasticamente fundo sequenciação ruído e irá permitir o teste das amostras com menores proporções de células de tumor para obter frequências alélicas inferiores e avançar para capturar circulating células tumorais.

Detecção de mutações associadas à doença em amostras de cancro tem sido padrão de atendimento durante décadas. Historicamente, os genes foram frequentemente testadas sequencialmente, um gene / exão de cada vez, com a identificação de uma mutação que conduz ao fim da sequência de teste. O advento de NGS tem permitido uma abordagem menos tendencioso para sequenciar vários genes associados com muitos cancros em paralelo que conduzem à identificação de múltiplas mutações que estão associados com neoplasia. A utilidade clínica de NGS para a detecção de mutações somáticas no cancro é cada vez mais evidente. De fato, a análise baseada em NGS de amostras de tumor representa um novo paradigma que desafia os testes genéticos tradicional, único, mas a utilidade clínica é muito clara. Laboratórios clínicos têm hoje a oportunidade excitante para se casar com a validação do método cuidadoso e interpretação do teste com a aplicação desta poderosa tecnologia.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tela de DNA genômico Fita	Agilent Technology	5067-5365
Reagentes de DNA genômico	Tecnologia Agilent	5067-5366
Tela D1000 de alta sensibilidade	Agilent	5067-5584
Reagentes D1000 de alta sensibilidade	Tecnologia Agilent	5067-5585
TapeStation 2200	Tecnologia Agilent	G2965A
Software de Análise TapeStation	Tecnologia Agilent	A.01.04 ou superior
Racks de Armazenamento de Tubos de 96 poços	Qualquer Fornecedor
Rack de Tubos de 15/50 ml	Qualquer Fornecedor
Rack de Placas de 96 poços	Qualquer Fornecedor
Pipeta, single-channel, 0.5– 2,5 μ l	Qualquer Pipeta de Fornecedor
, monocanal, 1– 10 μ l	Pipeta de Qualquer Fornecedor
, monocanal, 2– 20 μ l	Pipeta de Qualquer Fornecedor
, monocanal, 10– 100 μ l	Pipeta de qualquer fornecedor
, canal único, 20– 200 μ l	Pipeta de Qualquer Fornecedor
, monocanal, 100– 1.000 μ l	Qualquer fornecedor
Pipetador sorológico	Qualquer fornecedor
Vórtice	Qualquer fornecedor
Balde de gelo	Qualquer fornecedor
Microcentrífuga (para tubos e tubos de tira)	Qualquer fornecedor
Freezer, -20 ° C	Qualquer Fornecedor
4 ° C Geladeira	Qualquer Fornecedor
Água ou Banho de Contas	Qualquer Incubadora de Fornecedores
(37 ° c)	de qualquer fornecedor
, 1  ml	Qualquer Fornecedor
Pipetas Sorológicas, 5  ml	Qualquer Fornecedor
de Pipetas Sorológicas, 10  ml	Qualquer Fornecedor
de Pipetas Sorológicas, 25  ml	Qualquer Vendedor
Luvas	Qualquer Fornecedor
Lâminas de Barbear Qualquer	Fornecedor
KimWipes	Qualquer Fornecedor
Tubo Cônico de 15 ml	Qualquer Fornecedor
Tubo Cônico de 50 ml	Qualquer Fornecedor
Toalhas de Papel	Qualquer Fornecedor
Etanol de 200 provas	Qualquer Vendedor		Loja em Armário Inflamável
2-Propanol (Isopropanol)	Qualquer Loja Vendedora		em Armário Inflamável
Reservatórios de 25 ml	Qualquer Fornecedor
10 N NaOH	Qualquer Fornecedor
Pipeta, 8 canais, 1 – 10 μ l	Pipeta de qualquer fornecedor
, 8 canais, 10 – 100 μ l	Qualquer Pipeta de Fornecedor
, 8 canais, 20 – 300 μ l	Qualquer Fornecedor
Balde de Gelo	Qualquer Fornecedor
Garrafa de Água Esguicho	Qualquer Fornecedor
Garrafa de Álcool Esguicho	Qualquer Fornecedor
Papel de Limpeza de Lentes	Qualquer
, 96-well PCR, Semi-Skirted	Qualquer Fornecedor
Tiras de tubo, 8-well, 0.2  ml	Qualquer Fornecedor
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881
BioShake IQ ou 3000-T elm	Bulldog Bio/Q.Instruments	1808-0506/ 1808-0517
DropPlate96 S - LabChipDS	Calibrador	128876
DropPlate96 D - LabChipDS	Calibrador	132848
DropSense96	Calibrador (Trinean)
DropQuant Software	Caliper (Trinean)
Filme de vedação de placa	Denville	B1212-5S
Folha de vedação de alumínio	Denville	B1212-6S
Sistema de água pura sem nuclease	EMD Centrífuga Millipore
5424 Centrífuga	Eppendorf	22621408
5804R	Eppendorf	22623508	Rotadores de tubo e placa de 15 ml, de preferência uma centrífuga que pode ir até 2.500 x g.
Tubo Safe-Lock 1,5 ml, Natural	Eppendorf	22431021
Tubo de 5 ml, Tubo DNA LoBind	Eppendorf	30108310
5430R Centrífuga	Eppendorf	022620645	Qualquer centrífuga rotadora de placas funcionará
Incubadora de Microamostras Hybex	Fisher Scientific	1057-30-0
Hybex 0,2 ml Bloco de Tubo	Fisher Scientific	1057-31-0
Amplicon TruSeq - Painel de câncer	Illumina	FC-130-1008	96 reações
TruSeq Custom Amplicon		Illumina PE-940-1011	96 reações
TruSeq Custom Amplicon Index Kit	Illumina	FC-130-1003	96 índices, 384 amostras
Kit de reagentes MiSeq v3, 500 ciclos	Illumina	MS-102-3003
Kit de reagentes MiSeq v2, 300 ciclos	Illumina	MS-102-2002
Kit de Reagentes MiSeq v2, 500 Ciclos	Illumina	MS-102-2003
Experiment Manager	Illumina	1.3 ou superior
MiSeq Reporter	Illumina	2.0 ou superior
Visualizador de Análise de Sequenciamento	Illumina	1.8 ou superior
Kit de Fixação e Colar de Placa de Índice TruSeq	Illumina	FC-130-1007
MiSeq v2	Illumina	SY-410-1003
TruSeq Custom Amplicon Placa de Filtro	Illumina	FC-130-1006
Adaptador de Índice Tampas de Substituição	Illumina	11294657
Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Qubit 0.5 ml Tubos	Invitrogen	Q32856
Qubit dsDNA Kit	de Ensaio de Amplo AlcanceSuporte Magnético Invitrogen	Q32853
DynaMa6-96, Saia Lateral	GeneAmp Invitrogen	120.27
9700 (bloco de ouro/prata)	Life Technologies	N8050200
Kit de Sangue Gentra Puregene	Solução de	Qiagen 158489
(16 ml)	Qiagen	19093
Buffer ATL (4 x 50ml)	Solução	de Proteína 939011
(50 ml)	Qiagen	158910
(100 ml)	de Glicogênio 158914		Qiagen
(500  μ l)	Qiagen	158930
Qiagen Proteinase K	Qiagen	19133
Rnase (5 ml)	Qiagen	158924
Água Livre de Nuclease (10 x 50 ml)	Qiagen	129114
Pestles	USA Scientific	1415-5390
TipOne RPT 10 µ l pontas alongadas da pipeta do filtro em cremalheiras esterilizadas, 10 cremalheiras de 96 pontas (960 pontas).	USA Scientific	1180-3810
TipOne RPT 100 µ l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)	USA Scientific	1180-1840
TipOne RPT 200 μ l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks, racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)	USA Scientific	1180-8810
TipOne RPT 20 μ l natural, pontas de pipeta de filtro chanfradas em racks, racks esterilizados, 10 racks de 96 pontas (960 pontas)	USA Scientific	1180-1810
TipOne RPT 1,000 μ l pontas de pipeta de filtro XL naturais e graduadas nos	EUA Scientific	1182-1830