Aplicação do DNA-metil específico Stain Verde no Labeling fluorescentes de Embriões

Resumo

Um método para coloração fluorescente de material biológico fixo com o marcador específico de DNA verde de metila é descrito. O verde de metila é usado em uma solução aquosa diluída e é muito resistente ao fotobranqueamento. Sua emissão vermelha distante permite imagens profundas de amostras, tornando-o particularmente adequado para embriões inteiros.

Resumo

O verde de metila é conhecido há muito tempo como uma coloração histológica com uma afinidade específica pelo DNA, embora suas propriedades fluorescentes tenham permanecido inexploradas até recentemente. Neste artigo, ilustramos o método de preparação de uma solução estoque aquosa de verde de metila, que quando diluída pode ser usada como um marcador nuclear fluorescente muito conveniente para células e tecidos fixos. Procedimentos fáceis para rotular embriões inteiros de peixe-zebra e pintinhos são detalhados e exemplos de imagens obtidas são mostrados. O verde de metila é maximamente excitado pela luz vermelha, a 633 nm, e emite com um espectro relativamente nítido que atinge o pico de 677 nm. É muito barato, não tóxico, altamente estável em solução e muito resistente ao fotobranqueamento quando ligado ao DNA. Sua emissão vermelha permite imagens confocais de varredura de alta resolução inalteradas de núcleos em espécimes espessos. Finalmente, este protocolo de coloração com verde de metila é compatível com outros procedimentos de coloração celular, como marcação de anticorpos ou marcação de filamentos de actina com faloidina conjugada com fluoróforo.

Introdução

A coloração fluorescente de DNA é ampla e rotineiramente usada tanto em pesquisas biológicas quanto em diagnósticos clínicos, seja para o estudo detalhado da estrutura nuclear e cromossômica, para contracoloração de tecidos e células, ou para estudar parâmetros do ciclo celular¹. Embora várias colorações de DNA estejam disponíveis, as mais amplamente utilizadas foram aquelas excitadas pela luz ultravioleta e emitidas em azul, que se encaixam nos sistemas usuais de três filtros usados na maioria dos microscópios de epifluorescência convencionais quando combinados com fluoróforos emissores de verde e laranja-vermelho, como proteínas fluorescentes ou pequenas moléculas ligadas a anticorpos. Entre essas colorações de DNA emissoras de azul, as mais comuns são DAPI e agentes de ligação de sulcos menores de Hoechst^2,3. No entanto, a incorporação de uma ampla variedade de linhas de emissão de laser e detecção espectral em microscópios de varredura a laser permitiu que os pesquisadores escolhessem o uso de manchas nucleares emissoras de vermelho distante, como iodeto de propídio (PI) ou TO-PRO 3⁴. Uma vantagem dessas colorações é que elas superam o problema da autofluorescência encontrada em muitas células e tecidos, particularmente em embriões⁵, mas muitas delas têm problemas diferentes, como ter perfis de emissão amplos ou serem muito sensíveis ao fotobranqueamento⁶.

O pesquisador suíço Friedrich Miescher descobriu o DNA em 1869, extraindo-o dos núcleos de glóbulos brancos encontrados no pus. Ele o chamou de nucleína e mostrou alguns anos depois que formava precipitados com a mancha relativamente nova verde metil. O verde de metila é composto por três anéis de anilina, com diferentes graus de metilação, e possui duas cargas positivas que lhe permitem ligar-se fortemente ao sulco principal do DNA^7,8. A coloração de DNA por verde de metila foi muito cedo mostrada como específica, levando ao desenvolvimento por Unna e Pappenheim de uma coloração combinada com pironina, que marca especificamente o RNA. A metil verde-pironina tem sido amplamente utilizada desde então na técnica histológica de rotina⁹.

Até recentemente, muito pouco se sabia sobre as propriedades fluorescentes do verde de metila. Nosso trabalho anterior, no entanto, descobriu algumas das vantagens espectrais do verde de metila⁶, como sua excitação a 633 nm, um conveniente deslocamento de Stokes, sua emissão na porção do infravermelho próximo do espectro eletromagnético, maior fotoestabilidade do que as colorações de DNA disponíveis comercialmente com propriedades espectrais semelhantes e a um custo muito baixo. É por isso que decidimos testá-lo para ser usado como um marcador fluorescente específico e de alta afinidade para DNA em tecidos embrionários e em embriões inteiros. Além disso, até agora a coloração nuclear com verde de metila era realizada em pH baixo, dificultando a combinação com a coloração de anticorpos. O objetivo do método detalhado aqui é ter um protocolo para coloração de DNA nuclear fluorescente que supere o inconveniente acima mencionado, realizando o procedimento de coloração em pH fisiológico, tornando-o uma contracoloração adequada para imunomarcação em seções e tecidos inteiros.

Protocolo

1. A purificação do corante

1. Prepara-se uma solução aquosa a 4% de verde de metilo por dissolução de 0,4 g de pó de mancha em 10 ml de água destilada. Misture bem até dissolver completamente.
2. Sob um fume-hood, misturá-lo com pelo menos 2 partes de clorofórmio. É importante verificar com antecedência se os tubos são resistentes ao clorofórmio.
3. Misturar bem e centrifuga-se durante 1 min a 2000 xg para acelerar a separação de fases.
4. Após centrifugação, a fase aquosa superior com verde de metilo e uma fase orgânica inferior com clorofórmio e o violeta de cristal de contaminantes são obtidos habitual.
5. Recuperar a fase superior e repita esta etapa até a fase mais baixa parece completamente desprovida de cristal violeta.
6. No final, a fase superior é recuperada e diluído em água até uma concentração final de 2% com verde de metilo. Esta solução de reserva é estável sobre a bancada durante meses e não necessita de ser protegido da luz.

2. Fluorescente Nuclear Coloração de embriões Zebrafish Whole usando Metil Verde

1. Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído) a partir de em tampão fosfato salino (PBS).
   NOTA: Este pode levar desde algumas horas até durante a noite, dependendo da espessura dos embriões. No exemplo, nós fixa 48 horas pós-fertilização (HPF) embriões de peixe-zebra durante a noite.
2. Lavar os embriões três vezes em PBS-T (1% de Triton X-100 em PBS) durante 5 min. A concentração elevada de detergente permeabiliza a cutícula.
3. Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. A presença de detergente durante a incubação é útil para amostras de espessura, tais como embriões de peixe-zebra e larvas.
4. Incubar os embriões na solução, durante pelo menos 6 horas a 4 ° C, com agitação suave. Mais uma vez, a espessura do embrião é o parâmetro de calibração para o comprimento da incubação.
5. Lavar os embriões 3 times com PBS durante 30 min para remover o excesso de detergente. Metil fluorescência verde só é evidente quando ligado ao DNA, daí fundo da molécula não ligada é insignificante.
6. Montagem em um slide escavado ou de uma câmara caseira com solução de montagem (75% de glicerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
   NOTA: Se a coloração nuclear deve ser realizada após imunomarcação, verde metilo pode ser incorporado à solução de montagem na concentração de trabalho, sem a necessidade de lavá-lo afastado.
7. Loja refrigerado ou iniciar imagiologia imediatamente. Realizar imagem com um confocal de varredura a laser (ou outra fluorescência) microscópio com excitação a 633 nm e emissão filtros definidos como registrar em 650-750 nm tendo em conta que metil emissão verde atinge o seu máximo em 677 nm.
   NOTA: Nós fornecemos os dados de medição do perfil de emissão verde de metilo, a ser carregados no software de aquisição, como material suplementar.

3. Fluorescent Nuclear Staining de Whole Pintainho embriões usando Metil Verde

1. Incubar ovos de galinha fertilizados para a fase de interesse. Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído a partir de) em PBS a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS-T, durante 2 h.
2. Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. Incubar os embriões na solução de coloração durante a noite a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS, 1 h cada. Mount na câmara com 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Criação de Imagens fluorescente etiquetado Núcleos em embriões inteiros montado

1. Preparar uma câmara de imagem furando várias camadas de fita isolante sobre uma lâmina de microscópio e cuidadosamente cortar um buraco para ele com um bisturi para colocar os embriões dentro. Isso impedirá que os embriões de esmagamento durante o exame.
2. Transferir cuidadosamente os embriões para a câmara de imagiologia e encher a câmara com a parte superior com 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 para umaformação de bolhas vazio.
3. Cubra com um # 0 lamela evitar ou eliminar transbordante médio. Selá-lo com unha polonês.
4. Aquisição de imagens do espécime no microscópio de fluorescência equipado com um filtro de excitação de 633 ou linha de laser.
   NOTA: filtros de emissão deve cobrir o máximo de 677 emissões de verde metilo.

Resultados

A coloração nuclear de amostras grossas. O protocolo aqui descrito permite a realização de coloração homogênea de estruturas profundas no embriões inteiros. Lente desenvolvimento formar núcleos 48 hpf embriões de peixe-zebra são homogeneamente marcado (Figura 1).

Coloração de ADN com verde de metilo permite a discriminação do ciclo celular dependentes diferenças morfológicas, tais como a identificação de figuras mitóticas ou núcleos apoptóticos (Figura 2A). ...

Discussão

O desenvolvimento progressivo das técnicas de microscopia nas últimas décadas, com foco particular nas variações da microscopia fluorescente, levou à possibilidade de explorar a dinâmica e a estrutura de amostras de tecido intacto, incluindo embriões inteiros^10,11. Uma grande limitação tem sido, no entanto, a disponibilidade de fluoróforos de boa qualidade que podem ser usados para corar direta e rapidamente estruturas subcelulares.

As colorações de DNA fluorescente mais usadas, co...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
Metil verde	Dr. G. Grü bler		Também testou o 323829 Sigma-Aldrich, que é livre de cristal violeta
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	158127
Microscopia confocal de varredura a laser Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin– Isotiocianato de tetrametilrodamina B	Sigma-Aldrich	P1951
Centrífuga	372978		Sigma-Aldrich
5810 R	eppendorf	5811 000.010
lâminas de microscópio	Deltalab	D100004
lamínulas	Esco optics	R525025