Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de Plasmodium Rhoptry Proteínas

Na pesquisa da malária, a expressão de proteínas imunogénicas utilizando sistemas baseados em células procarióticas ou eucarióticas continua a ser um desafio. A riqueza AT do genoma de Plasmodium e desconhecidos os mecanismos pós translacionais ^14,7, contribuir para as dificuldades associadas com a obtenção de proteínas correctamente dobradas e imunogénicos para produção de anticorpos e estudos de vacinas. Sistemas procariotas tais como Escherichia coli, têm sido utilizados para a expressão da proteína recombinante. Sistemas procariotas são de baixo custo, eficaz, produzir altos rendimentos de proteína recombinante e ter vários vectores de clonagem. Anfitrião E. coli são fáceis de transformar e células crescem rapidamente. No entanto, os sistemas procarióticos têm limitações, tais como a falta de substituição de aminoácidos, modificação pós-translacional, risco de contaminação, produtos heterogéneos e acumulação de proteínas recombinantes dentro de corpos de inclusão ^24.

Em umestudo realizado por Mehlin et al. (2006), 1000 grelhas de leitura aberta (ORF) foram expressos. Aproximadamente 7% das proteínas expressas foram solúvel ^14. A insolubilidade observado é devido à natureza tendenciosa dos genes e da alta freqüência de códons que são usados ​​idealmente pelo Plasmodium AT genoma rico ^14. Uma estratégia alternativa para ultrapassar este problema foi desenvolvido usando plasmídeos ou células hospedeiras contendo ARNt que reconhece codões raros ou codões que correspondem aos ^três frequências. Mesmo depois de executar essas otimizações, muito pequenas porções de proteínas são expressas como solúvel, ativa e imunogênica ^14. Os sistemas de expressão isentos de células contêm todos os componentes necessários para a transcrição e tradução, tais como os ribossomos, fatores de iniciação, factores de alongamento (traduções fatores), tRNA e aminoacil-tRNA. Ambas as reacções de transcrição e de tradução são acopladas no procedimento de um só passo ^11,29. O transcriPÇÃO reacção é realizada num tubo antes quantidade adequada de mRNA é incubada com uma maquinaria de tradução em ^11,29 tubo diferente. Embora estes métodos são bem sucedidos em Plasmodium sp. A expressão da proteína, uma grande desvantagem é o período de tempo para a expressão da proteína, que é de aproximadamente 22 h ^29. Além disso, o alto custo dos materiais para inclusão nos protocolos ^29, os preparativos de trabalho intensivo do ligado celular e inconsistências nos preparativos de componentes, tornar esses sistemas inatingível. O principal foco dos pesquisadores para o desenvolvimento de um sistema de expressão livre de células depende de fatores como a rápida modificação genética, os rendimentos rápidos com altas concentrações e preparações lisado para a frente em linha reta ^1.

Os sistemas eucarióticos, tais como leveduras, linhas celulares de mamíferos, baculovírus sistema de expressão mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum e sistemas de expressão parasitárias such como Leishmania foram utilizados para a expressão da proteína recombinante ^7. Os sistemas eucarióticos partes relação filogenética e, por conseguinte, também partilham características, tais como glicosilação, acilação, formação de ligação dissulfureto, interacção chaperona, proteólise e compartimentalização sub-celular. Eventos secreção de proteínas em eucariotas evitar a acumulação e toxicidade diminui para sistemas de expressão ^13. A utilização de sistemas de leveduras é preferível que elas sejam adequadas para a expressão de proteínas em grande escala e para a obtenção de rendimentos elevados ^4. Dois P. proteínas falciparum PfCP-29 e Pvs25 foram produzidas utilizando o sistema de levedura ^4. No entanto, uma grande desvantagem na síntese da maioria das proteínas foi padrões irregulares de N e O-glicosilação, truncagem e dobragem incorrecta de proteínas a partir da sua forma nativa ^4.

A utilização de células de mamíferos para a síntese de proteínas recombinantes é trabalho intensivo e é expensive para manter linhas de células recombinantes estáveis ^​​4. Portanto, as células de mamíferos têm-se limitado para a análise de sinalização de proteína, as interacções proteína e interacções hospedeiro-parasita e também para testar as vacinas de ADN ^4. O ADN humano e de ARNm no sistema in vitro isento de células de expressão da proteína aqui descrito é um sistema de mamífero baseados em derivados de células HeLa que expressam as proteínas em 3 h. As proteínas expressas utilizando pT7CFE1-chis vetor de expressão têm uma tag C-terminal facilitando a identificação e purificação. O sistema de base de HeLa é suplementado com factores de iniciação da tradução e um regulador de tradução, aumentando assim a eficiência do sistema de tradução. As proteínas podem ser rapidamente traduzidos, peneirados, verificado e processado para uso em várias aplicações imunológicas e estruturais ^15.

Os sistemas de expressão isentos de células eucarióticas, tais como germe de trigo e de reticulócitos de coelho são actualmente utilizados para a expressão de varproteínas eucarióticas ious incluindo proteínas de Plasmodium ^11,29. Além disso, a E. sistemas livres de células com base coli também são empregues para a expressão da proteína eucariótica ^11. A Tabela 1 resume os diferentes sistemas de expressão de células livres, comparando as características dos sistemas, bem como a facilidade da utilização dos sistemas para a expressão da proteína. O sistema isento de células humano em comparação com os outros tem a capacidade de executar pós e co-translacional modificações e é menos dispendiosa. Codon optimization é possível e todas as reacções podem ser realizadas em 3 h. O sistema de HeLa é um sistema de tradução ideal para a síntese de proteína no ambiente de laboratório.

Uma grande vantagem dos sistemas de expressão de células humanas livre em relação a outros sistemas livres de células, é a disponibilidade de várias linhas celulares diferentes derivadas de diferentes órgãos e tecidos. Existem diversas variedades de sistemas isentos de células pode ser desenhado dependendo da linha celular. O extractos derivados a partir de células de mamífero têm uma maior eficiência de sintetizar proteínas grandes do que quaisquer outros sistemas de expressão de célula livre. Estes sistemas de células sem expressão podem também ser utilizados em aplicações de diagnóstico e caracterização de proteínas, tais como micro matrizes ^30. As linhas de células HeLa populares são mais amplamente utilizados para realizar a expressão de proteínas ^33. O retículo endoplasmático nas linhas de células HeLa é subdesenvolvidos, levando à ausência de glicosilação pós-tradução actividade modificação ^33. No entanto, este sistema é que se acredita ser vantajoso para a síntese de proteínas Plasmodium Plasmodium como também não possui modificação pós tradução ²⁹ glicosilação. O protocolo de transcrição-tradução livre de células HeLa é de fácil execução, barata e as proteínas podem ser expressas em 90 min, pronta para a purificação e aplicações a jusante.

1. Preparação de culturas de células de parasitas, Coleção de Parasite Pellets

1. Prepare meio RPMI-1640-HEPES por adição de 10 g de pó de meio RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sódio, tampão HEPES 5,9 g, 50 mg de hipoxantina e 3,8 g de dextrose em 1 L estéril dH ₂ O. Misture usando a tabela agitador magnético até que todos o pó se dissolva em 1 L de água destilada. Execute micro filtração de mídia usando 0,22 nm. Armazene a mídia em frascos esterilizados.
2. Lavar não infectados (fresco) do tipo A + eritrócitos utilizando RPMI. Prepare a 5% de hematócrito dos eritrócitos (0,5 ml de eritrócitos frescos lavados em 9,5 ml de 10% RPMI + soro humano).
3. Adicione 15% de soro humano + RPMI (15 ml de soro humano e 85 ml de RPMI) para iniciar a cultura de parasitas. Adicione 10% de soro humano e meio RPMI (10 ml de soro humano e 90 ml de RPMI) para continuar a cultura de parasitas nas células vermelhas do sangue.
4. Cultura P. falciparum (3D7 e FCR-3 estirpes) em TipoA + humanos eritrócitos a 5% de hematócrito e de 20% de parasitemia em placa de petri ou num frasco de cultura de 75 centímetros ^3. Manter a cultura in vitro de acordo com o método de Trager e Jensen vela frasco ^26. Alternativamente, manter culturas são em incubadora a 37 ° C mantendo 9,5% de CO ₂ e 3,4% de N _{2 gasoso.} Cultura P. falciparum em meio RPMI 1640 suplementado com HEPES meios 10% de soro humano.
5. Sincronize P. falciparum cultura pela adição de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 mL de meio RPMI-1640 sem soro humano) para concentrar a cultura ^27.
6. Centrifuga-se o concentrado de cultura com Percoll a 2500 xg durante 5 minutos o que resulta em 3 camadas. Cuidadosamente, com uma pipeta de transferência isolar esquizontes da transferência camada intermediária em um tubo separado sob condições assépticas ^27.
7. Lavam-se as culturas de isolado com 10% de soro humano + RPMI-1640 por duas vezes para remover o excesso de Percoll por centrifugação a 7500 xg durante 5 min. DiScard o sobrenadante de cada vez, sob condições assépticas ^27.
8. Continuar a cultura de P. sincronizado esquizontes falciparum em 10% de soro humano + ²⁷ meio RPMI-1640.
9. Recolhe esquizontes por tratamento de Plasmodium eritrócitos infectados com 10 mM de Tris pH 8,8 e centrifugação a 15000 xg durante 15 min ^23. Pelotas do parasita da loja, a -70 ° C após a adição de 5 ul de inibidor de protease (aprotinina) para as peletes. Use pastilhas de parasitas para extração de proteínas, o isolamento de ADN genómico e RNA isolamento.

2. Preparar plasmídeo Vector

1. Isolar o ADN genómico a partir de P. pelotas esquizontes falciparum preparados a partir de culturas de cerca de 20% de parasitemia.
2. Adicionar 600 ul de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM de EDTA pH 8,0, 0,1% de SDS e 1 mg / ml de proteinase K, para os microgrânulos num tubo de microcentrífuga, homogeneizar sedimento utilizando uma seringa de 1 ml ligada a uma agulha G 26. Alternativa encher a seringacom a mistura de sedimento e de esvaziamento para um tubo de microcentrífuga de 20 vezes. Incubar tubo contendo homogeneizado de O / N em um banho de água a 50 ° C.
3. Realizar fenol - clorofórmio (P + C) Extracção por adição de 600 ul de P + C (300 ul de fenol e 300 ul de clorofórmio) para sedimento homogeneizado. Tubo de tampa bem apertada e agite a mistura vigorosamente invertendo final end-to-tubo. Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 2 min e recolher solução aquosa superior utilizando uma micropipeta para um novo tubo de microcentrifugação. Repita esta etapa duas vezes.
4. Adicionar 600 ul de clorofórmio à camada aquosa no tubo novo a partir do passo 2.1.2. Vortex o tubo durante 10 segundos e centrifugar a 14000 xg durante 2 min. Medir a camada aquosa superior com uma micropipeta e transferi-lo para um novo tubo de microcentrifugação.
5. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M pH 5,5 e um volume de isopropanol (se camada aquosa é adicionar 300 ul 30 ul de acetato de sódio 5 M pH 5,5 + 330 mL de isopropanol) para a postura aquosoer a partir do passo 2.1.3. Incubar o tubo à temperatura ambiente durante 15 min.
6. Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de DNA. Descartar o sobrenadante e lave o peletizado com 100 ul de etanol a 70% (70 ul de etanol e 30 uL de _dH2O) para remover o excesso de sal a partir do ADN. DNA da loja em 50 ul de _dH2O a -20 ° C.
7. Conceber iniciadores directos e inversos usando software ou manualmente para a amplificação de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 e PF3D7_0114100 previamente identificados em estudos ^16,18 proteoma com locais de restrição apropriados para permitir a clonagem das sequências de genes para os múltiplos locais de clonagem do plasmídeo de expressão pT7CFE1-CHIS, como mostrado na Tabela 2.
8. Fazer uma mistura reaccional de 50 ul por adição; 5 ul de P. isolado ADN genómico de P. falciparum, 5 ul de tampão 10x, 5 jil de _MgCl2, 1,5 ul de iniciador directo, 1,5 ul deiniciador de sentido reverso, 0,5 jil de polimerase de ADN de T7 e 31,5 uL de _dH2O e realizar a reacção em cadeia da polimerase (PCR) a 94 ° C durante 8 min para desnaturação, 50 ° C durante 1 min 30 s para a extensão e 72 ° C durante 9 min para o recozimento e renaturação para amplificar os genes mostrados na Tabela 1.
9. Os produtos de PCR separados sobre gel de agarose a 1% (1 g de agarose e 100 ml de acetato de Tris EDTA (TAE) tampão) ^32.
10. Corte as bandas de DNA amplificados por PCR a partir do gel de agarose, colocar as fatias de gel que contêm o ADN numa coluna de extracção de ADN de gel de rotação e congelar a -20 ° C durante 5 min. Adicionar 100 uL de isopropanol para as fatias de gel congelado e centrifugar a 14000 xg durante 5 min.
11. Medir o escoamento aquosa filtrada no tubo de recolha a partir do passo 2.5, utilizando uma micropipeta e transferir para um tubo novo. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 5 M e centrifugar a 14000 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante e adicionar 10 uL de _dH2O para the sedimento de DNA.
12. Digerir o vector de expressão pT7CFE1-Chis e os fragmentos de ADN purificado a partir de (2.6) em dois tubos separados pela adição de 3 ul de plasmídeo e 5 ul de produtos de PCR do gene para cada tubo. Adicionar a cada tubo, 1 ul de enzimas de restrição específicas, 2 ul de tampão de reacção e 14 ul de _dH2O
13. Adicionar 3 ul de plasmídeo digerido, 5 ul de fragmentos de ADN digeridos, 2 ul de tampão ligase 10X, 1 ul de ligase e 9 jil de _dH2O num tubo de microcentrífuga. Incubar a 12 ° CO / N.
14. Adicionar 0,1 volume de acetato de sódio 3M a pH 5,5 e 2 volumes de etanol (se o volume de tubos de ligação é de 20 ul adicionar 2 mL de 3 M de acetato de sódio + 44 mL de etanol) para o tubo a partir do passo 2.14. Misturar bem e incubar à temperatura de -20 ° C durante 15 min.
15. Centrifuga-se o tubo a 14.000 xg durante 15 min. Remover o sobrenadante cuidadosamente, utilizando uma pipeta micro sem perturbar o sedimento.
16. Adicionar 100 ul de etanol a 70% tO sedimento do passo de 2,10. Centrifuga-se o tubo a 14000 xg durante 5 min. Remova e descarte o sobrenadante. Adicionar 10 ul de água isenta de nuclease para o sedimento de DNA.

3. Usando Protein Expression in Vitro Célula humana Livre Expressão Sistema

1. Preparar 20 ul de mistura de transcrição medindo 2 ul do recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de DNA, 4 ul de tampão de transcrição 5x, 4 ul de mistura de NTP, 2 ul de ARN-polimerase de T7 e 8 mL de água isenta de nuclease para 2 passos humanas in vitro Protein Expression usando moldes de ADN. Misturar os componentes num tubo de microcentrífuga e incubar durante 75 min a 30 ° C num banho de água.
2. Tome 2 ul da mistura de transcrição e adicioná-lo para 23 ul de mistura de tradução contendo 12,5 ul de lisado de células HeLa, 2,5 ul de proteínas acessórias, 1 ul de solução de sal de A, 0,5 ul de aminoácidos Met, 0,5 ul de aminoácidos Leu, 181; l de inibidor de RNAse, 1,25 mL de cabaz energético e 3,75 mL de água livre de nuclease.
3. Incubar a mistura de tradução a partir do passo 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Loja produtos traduzidos a -20 ° C.
4. Preparar 25 ul de mistura de transcrição e de tradução através da adição de 3 ul de o recombinante pT7CFE1-Chis plasmídeo de ADN, 2 ul de água isenta de nuclease, 5 ul de mistura de reacção, 12,5 ul de lisado de células HeLa e 2,5 ul de proteínas acessórias para um passo- Juntamente Humano Expressão IVT proteína para moldes de ADN.
5. Incubar a mistura de reacção a partir do passo 3.4, durante 90 min a 6 h a 30 ° C. Guarde os produtos de tradução -20 ° C.

4. Purificação de proteínas recombinantes expressas

1. Adicionar 75 ul de tampão de purificação 1x a 25 ul de produto de tradução para perfazer 100 uL de mistura de purificação.
2. Adiciona-se 100 ul de resina quelante de níquel de 100 ul de mixt purificaçãoure. Lavar Ni-resina duas vezes por adição de 300 uL de _dH2O e 300 ul de tampão de ligação. Re-suspender resina e centrifugar a 14000 xg durante 1 min para remover o excesso de etanol.
3. Adiciona-se 100 ul de mistura a partir do passo de purificação de 4,2-100 ul de resina quelante de níquel e incubar a mistura durante 60 min à temperatura ambiente.
4. Centrifugar a mistura a 14000 x g durante 1 min e recolher o sobrenadante para um novo tubo marcado como "flow through".
5. Lavar a resina com 100 ul de 1x tampão de lavagem (imidazol 20 mM, 250 mM de NaH ₂ PO ₄ a pH 8, 2,5 M de NaCl e dH ₂ O). Centrifugar a 14.000 xg por 1 min e recolher o sobrenadante no novo tubo rotulado de "lavagem". Repita o passo 4.5 duas vezes.
6. Adicionar 100 ul de 1x tampão de eluição (imidazole 100 mM, 250 mM de Na ₂ PO ₄ a pH 8,0, 2,5 M NaCl e _dH2O) à resina e incubar durante 15 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min. Faça o passo de eluição duas vezes. Cadatempo recolher o sobrenadante para tubos de microcentrífuga fresco e rótulo como "fluido".
7. Após eluição, lavar a resina duas vezes tal como descrito no passo 4.5. Fluir através da loja, lavagens e amostras de eluição à temperatura de -20 ° C ou inferior. A resina deve ser armazenada a 4 ° C. Utilizar 30 ul de cada amostra para SDS-PAGE e análise de imunotransferência.

5. Coomassie (Bradford) Ensaio de Proteína ³⁴

1. Preparar padrão de albumina de soro bovino (BSA) as soluções com a concentração de 20 ug / ml (mistura de 10 ul de BSA (2 mg / mL) e 90 uL de _dH2O), 40 ug / ml (mistura de 20 ul de BSA (2 mg / mL) e 80 uL de _dH2O), 60 ug / ml (mistura de 30 ul de BSA (2 mg / mL) e 70 uL de _dH2O), 80 ug / ml (mistura de 40 ul de BSA (2 mg / mL) e 60 uL de _dH2O), 100 ug / ml (mistura de 50 ul de BSA (2 mg / mL) e 50 uL de _dH2O), 160 ug / ml (mistura de 80 ul de BSA (2 mg / mL) e 20 uL de dH₂ O) e 200 ug / ml (100 l de BSA (2 mg / ml).
2. Medida 5 ul de fluxo através de lavagens e amostras de eluato do passo 4.7. Adicionar 95 uL de _dH2O
3. Adicionam-se 5 ml de reagente azul de Coomassie para as misturas dos passos 5.1 e 5.2. Cubra os tubos com parafilme e de vórtice durante 10 seg depois incubar durante 20 min à TA.
4. Usando um espectrofotómetro, medir a densidade óptica (DO) ao comprimento de onda de 650 nm para os tubos de proteína a partir do passo 5.3. Lote concentração vs. leitura OD para determinar as concentrações de proteínas ^34.

6. Western Blotting

1. Adicionam-se 5 ul de extractos de P. esquizontes falciparum, 2 ul de Escherichia coli recombinante expressa rhOP-3 proteínas ^31, 5 ul de proteínas recombinantes expressas utilizando 2-passo e um passo em sistemas de expressão in vitro humano e 10 ul de produtos de proteína purificada utilizando o método de afinidade para separar os tubos. Adicionar tampão de amostra de electroforese contendo mercaptoetanol a cada tubo para um volume final de 20 ul de fazer amostras de proteínas solubilizadas. Ferver tubos durante 2 minutos.
2. Carregue amostras de proteínas solubilizadas sobre 10% de gel SDS-PAGE para separar as proteínas.
3. Transferir proteínas separadas a partir de géis de SDS-PAGE para papel de nitrocelulose (PCN) por electroforese a 35 mA por gel em uma câmara de western blotting semi-seco durante 2 h.
4. Bloco PCN após a transferência com 2% de leite desnatado.
5. Incubar bloqueados PCN com os seguintes anticorpos policlonais diluídos 1: 100 em 2% de leite para efectuar transferência de Western; anticorpo de coelho # 676 ²¹ específico para P. roptrias merozóito falciparum, ²⁰ anticorpos de ratinho específicos para P. yoelii e P. roptrias merozoite berghei, anti-soros # 685 específicos para a P. falciparum proteína vacúolo parasitóforo, SERA (serina rico antígeno) ²² e anticorpos específicos para o Maurer217; s proteína fenda CGFP-2TM ^28.
6. Incubar PCNs também em 1: 100 controles do mouse e soro de coelho e cultura gasto sobrenadante (SCS) a partir de células de mieloma SP2 normais diluído como negativos.
7. Incubar PCNs com anticorpos e os controlos nas 4 ºC O / N.
8. Lavar PCN 4x com tampão Blot e incubar PCN com espécies anticorpos secundários específicos conjugados com peroxidase de rábano (HRP), diluído 1: 1000 em 2% de leite.
9. Lavar PCN 4x com tampão de transferência. Incubar PCN lavada com a solução de desenvolvimento de cor A + B (Solução A: adicionar 50 ml de tampão 1x Blot e 30 ul de H ₂ O _2; Solução B: adicionam-se 10 ml de metanol e 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min no escuro. Analisar os resultados western blot colorimetria.

Validação das proteínas recombinantes expressas através de reactividade com anticorpos específicos é um primeiro passo importante para confirmar a dobragem correcta das proteínas expressas. Proteínas da malária recombinantes foram expressos utilizando o passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas recombinantes são o método de afinidade de Ni-quelante purificada. Em seguida, usamos anti-soros contra roptrias inteiras merozoite em transferência Western de proteínas recombinantes separados SDS-PAGE.

A Figura 1 mostra fragmentos de genes amplificados por PCR de PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 PF3D7_1436300 e em um gel de agarose a 1%. As bandas de DNA foram excisadas e DNA purificado por congelamento no DNA extração rotação da coluna.

Malária genes amplificados com sucesso (mostrados na Tabela 2) a partir de ADN genómico foram clonados no vector de expressão pT7CFE-Chis. Re-amplificação dos genes do recoplasmídeos mbinant demonstrou a presença dos fragmentos de genes clonados no vector. O diagrama de fluxo de sistemas de expressão utilizados para a tradução da proteína é mostrada na Figura 2. As Figuras 2A e 2B mostra um procedimento prudente passo do procedimento de 2 passos em sistema de expressão in vitro humano e de células sem o sistema de tradução acoplado IVT 1-passo. Expressão sucesso de proteínas de Plasmodium utilizando sistemas in vitro de células humanas livre expressão foi confirmada por rhoptry anti-soros de coelho específico. Tal como ilustrado na Figura 3A, as proteínas recombinantes foram reconhecidos por anti-soros de coelho específico rhoptry # 676. Como mostrado anteriormente, expressaram proteínas recombinantes não foram reconhecidos por anti-soros contra proteínas de P. vacúolo parasitóforos falciparum e P. yoelii demonstrando a especificidade do anti-soro de coelho 676 contra as proteínas expressas a 32. Soro de coelho normal (NRS), não reagiram com proteínas recombinantestraduzido usando 2-passo na célula do sistema de expressão in vitro humano livre e um passo IVT acoplado sistema de tradução (Figura 3B). A expressão bem sucedida das proteínas recombinantes Plasmodium foi confirmada por diferentes técnicas, tais como Na-gel de coloração de histidina e de níquel-HRP 32 coloração. As proteínas expressas foram purificadas pelo sistema de purificação por afinidade. A purificação é realizada no método descontínuo (não colunas usado). A técnica é optimizado por alteração da concentração de imidazole de 60 mM a 100 mM. A concentração óptima para a eluição é de 250 mM. A Figura 4 mostra a purificação bem sucedida de proteínas traduzidas a partir de 25 ul de produtos proteicos traduzidos. A Figura 4A mostra a purificação bem sucedida de fenda proteína transmembranar de Maurer 18. A Figura 4B mostra a purificação bem sucedida de PF3D7_0925900, P. falciparum ortólogo de Plasmodium yoelii PY17X_0830000 gene, umaproteína hipotética de 32. A Figura 4C mostra a purificação bem sucedida de repetições tatu contendo proteína PY17X_1139200, uma proteína hipotética usando pérolas de resina de Ni e 100 mM de imidazole em 1x tampão de eluição. O rendimento de proteína após a purificação é de 3,5 ug / 25 uL.

Figura 1. A amplificação de P. falciparum e P. genes. yoelii produtos em gel de agarose 1% de brometo de etídio mostrando coradas PCR de fragmentos de genes de PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 e PFA0680cw amplificados a partir de P. ADN genómico de P. falciparum.

Figura 2. Fluxograma de bas HeLa celular ed sistema de expressão livre. Representação esquemática de ambos 2-step e 1-passo em sistemas in vitro livre expressão de células humanas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3. Imunotransferência confirmação da expressão da proteína. A análise de Western blot de proteínas recombinantes expressas utilizando coelho específico todo rhoptry anti-soros # 676 e soro de coelho normal. (A) A reactividade de anti-soros de 676 com as proteínas recombinantes expressas. (B) de soro normal de coelho não reagiu com as proteínas recombinantes expressas. Proteína vacúolo parasitóforo não reagiu com as proteínas recombinantes 32."target =" _ blank hres.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Purificação de proteínas a partir das micro volumes de produto de tradução. A purificação de proteínas recombinantes expressas utilizando níquel quelante método de afinidade em resina. As proteínas expressas (tradução) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, e (C) PY17X_1139200 proteínas foram incubadas com Níquel - resinas quelantes são purificados com resina quelante de Níquel, na ausência de tampão de imidazol em tampão de ligação e purificação. Após a incubação, as esferas foram centrifugadas, as proteínas não ligadas foram separadas e as pérolas lavadas duas vezes em tampão de lavagem. Proteínas recombinantes ligadas foram eluídas duas vezes seguida de uma lavagem das pérolas. Proteínas traduzidas, lavagens, eluatos e contasforam solubilizados em tampão de amostra de electroforese. Imidazole foi usado na lavagem (20 mM de imidazol) e eluição (100 mM de imidazol) buffers. Os anti-soros # 676 reconhecido com sucesso e expressa proteínas recombinantes purificadas. Soro normal de coelho não reagiu com proteínas expressas como mostrado na Figura 3B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1. Celulares sistemas de livre expressão na pesquisa da malária. Comparação de celularOs sistemas de expressão livres usado actualmente em investigação da malária.

Tabela 2. genes Rhoptry no estudo. Os iniciadores de diferentes genes expressos neste estudo 19.

Tabela 3. Hela com células, os sistemas de expressão livres. Kits utilizados para a expressão de proteínas.

Não temos nenhum interesse financeiro conflitante neste estudo.