Sistemas HeLa celular Com base livre expressão para a expressão de<em&gt; Plasmodium</em&gt; Rhoptry Proteínas

Resumo

Expressão de proteínas da malária em sistemas baseados em células permanece um desafio. Nós demonstramos dois sistemas de célula livre expressão de passo e um passo IVT (em tradução vitro) para expressar proteínas recombinantes rhoptry malária a partir de células HeLa. Nós usamos um sistema de purificação baseado afinidade Ni-resina para purificar as proteínas rhoptry.

Resumo

A malária causa de morbidade e mortalidade mundial significativa. Nenhuma vacina de rotina está disponível no momento. Uma das principais razões para a falta de uma vacina é o desafio de identificar candidatos a vacinas adequadas. Proteínas malária expresso utilizando sistemas procariotas e eucariotas de expressão baseados em células são mal glicosilada, geralmente insolúveis e passam por dobragem inadequada levando a imunogenicidade reduzida. Os sistemas de expressão livres de gérmen de trigo, lisado de reticulócitos de coelho e lisado de células de Escherichia coli são actualmente utilizados para a expressão de proteínas da malária. No entanto, o período de tempo e a expressão inadequada de glicosilação de proteínas continua a ser um desafio. Nós demonstramos a expressão de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando células HeLa sistemas baseados livre expressão, denominados "in vitro de células livre sistemas de expressão humanos". Os sistemas de expressão isentos de células HeLa baseado 2 transcrever o ARNm em 75 min e 3 ul de transcribed ARNm é suficiente para traduzir proteínas em 90 min. O sistema de expressão de um-passo é uma transcrição e tradução acoplado sistema de expressão; a transcrição e tradução de co-ocorre em 3 h. O processo também pode ser estendido durante 6 horas, fornecendo energia adicional. No sistema de expressão de 2 passos, o ARNm é transcrita em primeiro lugar e, em seguida, adicionados à mistura de tradução para a expressão da proteína. Nós descrevemos como expressar proteínas de malária; um hidrofóbico Cleft de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembranar (CGFP-2TM), uma proteína PF3D7_0925900 hidrófilo e um tatu repetições contendo proteína PF3D7_1361800, utilizando o sistema de livre expressão de células HeLa base. As proteínas são expressas em micro volumes empregando 2-passo e um passo-estratégias de expressão. Um método de purificação por afinidade para purificar a 25 ul de proteínas expressas utilizando o sistema isento de células humanas de expressão in vitro é também descrito. Rendimento de proteína é determinada pelo ensaio de Bradford e a expressoe proteínas purificadas pode ser confirmada por análise de transferência de western. Proteínas recombinantes expressas podem ser utilizados para a vacinação, imunoensaios e sequenciação de proteínas.

Introdução

Na pesquisa da malária, a expressão de proteínas imunogénicas utilizando sistemas baseados em células procarióticas ou eucarióticas continua a ser um desafio. A riqueza AT do genoma de Plasmodium e desconhecidos os mecanismos pós translacionais ^14,7, contribuir para as dificuldades associadas com a obtenção de proteínas correctamente dobradas e imunogénicos para produção de anticorpos e estudos de vacinas. Sistemas procariotas tais como Escherichia coli, têm sido utilizados para a expressão da proteína recombinante. Sistemas procariotas são de baixo custo, eficaz, produzir altos rendimentos de proteína recombinante e te....

Protocolo

1. Preparação de culturas de células de parasitas, Coleção de Parasite Pellets

1. Prepare meio RPMI-1640-HEPES por adição de 10 g de pó de meio RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sódio, tampão HEPES 5,9 g, 50 mg de hipoxantina e 3,8 g de dextrose em 1 L estéril dH ₂ O. Misture usando a tabela agitador magnético até que todos o pó se dissolva em 1 L de água destilada. Execute micro filtração de mídia usando 0,22 nm. Armazene a mídia em frascos esterilizados.
2. Lavar não infectados (fresco) do tipo A + eritrócitos utilizando RPMI. Prepare a 5% de hematócrito dos eritrócitos (0,5 ml de eritrócitos frescos lavados....

Resultados

Validação das proteínas recombinantes expressas através de reactividade com anticorpos específicos é um primeiro passo importante para confirmar a dobragem correcta das proteínas expressas. Proteínas da malária recombinantes foram expressos utilizando o passo e de dois passos em sistemas de expressão isentos de células humanas in vitro. As proteínas recombinantes são o método de afinidade de Ni-quelante purificada. Em seguida, usamos anti-soros contra roptrias inteiras merozoite em transferência Western de proteínas rec.......

Discussão

Os passos importantes para a expressão bem sucedida das proteínas em dois passos, utilizando em sistema de expressão de células humanas in vitro livre e purificação são: 1) a amplificação bem sucedida e clonagem de genes em pT7CFE-Chis plasmídeo vector; 2) a transcrição do RNA a ^{30 °} C; 3) a tradução de proteína a 30 ° C na presença de inibidor de ARNase; 4) desenvolver o protocolo de purificação de afinidade com base usando esferas de resina revestidos com Ni e 5) análise de resultados em western blot utiliz.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de expressão livre de células humanas in vitro de 2 etapas	Thermo Fisher	88856	Descontinuado. Armazene sempre a -80 °C. Não descongele em água morna
Sistema de tradução acoplado de 1 passo in vitro	Thermo fischer	88860	Armazene sempre a -80 ° C. Não descongele em água morna
Sistema de purificação ProBond	Invitrogen	K850-01	Armazene na RT
Resina quelante de níquel Probond	Invitrogen	R801-01	Armazene em 4oC.
Banco de		de Sangue Humano A +	em 4 ° C.

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