Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

Resumo

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol. Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Resumo

O fígado tem uma grande capacidade para se regenerar. Os hepatócitos, as células parenquimatosas do fígado, pode regenerar em uma de duas maneiras: a regeneração hepática hepatocyte- ou accionada por biliar. Na regeneração hepática-driven hepatócitos, os hepatócitos em regeneração são derivados de hepatócitos pré-existentes, ao passo que, na regeneração-driven biliar, hepatócitos em regeneração são derivadas de células epiteliais das vias biliares (CEBs). Para a regeneração hepática-driven hepatócito, existem modelos de roedores excelentes que têm contribuído significativamente para a compreensão atual da regeneração hepática. No entanto, não existe tal modelo de roedor existe para regeneração hepática-driven biliar. Nós recentemente relatado em um modelo de fígado de peixe-zebra em que BECs extensivamente dar origem a hepatócitos após a perda de hepatócitos grave. Neste modelo, os hepatócitos são especificamente ablação por um meio de farmacogenética. Aqui nós apresentamos em detalhes os métodos para retirar hepatócitos e analisar o processo de regeneração hepática BEC-driven.Este modelo de ablação específica do hepatócito pode ser ainda usado para descobrir os mecanismos moleculares e celulares subjacentes da regeneração hepática-driven biliar. Além disso, estes métodos podem ser aplicados para telas químicas para identificar moléculas pequenas que aumentam ou suprimem a regeneração do fígado.

Introdução

O fígado é um órgão altamente regenerativa. Durante a regeneração do fígado, regenerar hepatócitos, as células do parênquima do fígado, são derivados de hepatócitos pré-existentes (regeneração hepática-driven hepatócitos) ou BEC (regeneração hepática-driven biliar) ^1,2. A lesão hepática geralmente provoca a proliferação de hepatócitos pré-existentes; no entanto, quando a proliferação de hepatócitos é comprometida, CEBs pode contribuir para hepatócitos ^2-4. Estes dois modos de regeneração do fígado são clinicamente significativa. Após a remoção cirúrgica de uma porção do fígado humano (por exemplo, devido a tumores do fígado ou dadores v....

Protocolo

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com o procedimento padrão; experimentos foram aprovados pela Universidade de Pittsburgh Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1. Preparação de Embriões / larvas

1. Para realizar cruzamentos programados, configurar adulto do sexo masculino e feminino Tg (fabp10a: CFP-NTR) ^s931 peixes hemizigóticas ou homozigotos O / N e colocar um divisor entre eles. Remover este divisor na manhã seguinte quando o acasalamento é desejado. Coletar embriões esticando a água usando um filtro fino malha de plástico.
2. Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar a superf....

Resultados

MTZ tratamento durante 36 h (A36h, A representa ablação) 3,5-5 dpf reduzida drasticamente o tamanho do fígado (Figura 1B). Depois Mtz washout, considerado como o início de regeneração hepática (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: expressão dsRed reapareceu no prazo de 30 horas (Figura 1B). A rede biliar intra-hepático, tal como avaliado por expressão de Alcam que está presente na membrana de CEBs ^22, mas inicialmente recolhido foi restabelecida em 54 horas.......

Discussão

Grave, mas não leve, ablação de hepatócitos provoca a regeneração do fígado-driven biliar. Por conseguinte, após o tratamento de lavagem e Mtz, é importante para examinar o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz, que pode ser avaliada pela fluorescência intrínseca do PCP fabp10a: NTR-PCP transgene. Uma vez que uma pequena percentagem das larvas tratadas com Mtz exibirá não excisada (0-5%) ou parcialmente ablação (10-20%) os fígados, é essencial para resolver e apenas analisar as larvas com uma muito pequ.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (tricaína) em pó	Sigma-Aldrich	A5040	Faça estoque de tricaína a 0,4% (15 mM): Leve 0,4 g de tricaína a 100 mL com água de ovo. Ajuste para pH 7.
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Metronidazol	Sigma-Aldrich	M1547
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Formaldeído	Sigma-Aldrich	252549
Sulfato de cálcio di-hidratado	Sigma-Aldrich	C3771
N-feniltioureia (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629
Mídia de montagem (Vectashield)	Vector Laboratories	H-1000
100 x 15 mm placa de Petri	Denville Scientific Inc.	Esmalte transparente M5300
	Fisher Scientific	50949071
pinça fina	Ferramentas de Ciência Fina	11251-20	Dumont #5
lâmina de vidro	Fisher Scientific	12-544-1
lamínula de vidro	Fisher Scientific	12-540-A e 12-542-A	18 x 18 mm
zn-5 (camundongo anti-Alcam)	ZIRC	zn-5	1:10 diluição
cabra anti-Hnf4a	Santa Cruz	sc-6556 (C-19)	diluição 1:50
rato anti-RFP	alelo Biotecnologia	ACT-CM-MRRFP10	1:300 diluição
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)	Jackson laboratories	705-605-147	Diluição 1:500
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)	Invitrogen	A21240	diluição 1:500
Cy3 burro anti-rato IgG	Jackson laboratories	712-165-150	1:500 microscópio
de dissecação de diluição	Leica Microsystems	S6F
microscópio de epifluorescência	Leica Microsystems	M205FA
microscópio confocal	Carl Zeiss	LSM700
água			de ovo 0,3 g/L de sais marinhos ' Oceano instantâneo' e CaSO4 0,5 mM em água destilada.
[header]
10X PBS			25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 2 g de KH2PO4.  Leve a 1 L com água destilada.  Ajuste o pH 7.  Autoclave por 20 min a 121 graus Celsius.
1X PBSDT			0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO em 1 X PBS.
Tampão			30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Leve a 1 L com água destilada.  Ajuste o pH 7.
Solução			Misture 1 ml de soro de cavalo inativado pelo calor com 9 ml de PBSDT 1X.