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Artigo de método

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

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DOI:

10.3791/52785

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20 de maio de 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental Biology, McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh

Neste artigo

Resumo

Para ajudar a avaliar os mecanismos moleculares subjacentes à regeneração hepática impulsionada pela via biliar do peixe-zebra, estabelecemos um modelo de lesão hepática no qual os hepatócitos que expressam nitroredutase são geneticamente ablacionados após o tratamento com metronidazol. Neste protocolo, descrevemos como manipular, monitorar e analisar habilmente a ablação de hepatócitos e a regeneração hepática conduzida por vias biliares.

Resumo

O fígado tem uma grande capacidade para se regenerar. Os hepatócitos, as células parenquimatosas do fígado, pode regenerar em uma de duas maneiras: a regeneração hepática hepatocyte- ou accionada por biliar. Na regeneração hepática-driven hepatócitos, os hepatócitos em regeneração são derivados de hepatócitos pré-existentes, ao passo que, na regeneração-driven biliar, hepatócitos em regeneração são derivadas de células epiteliais das vias biliares (CEBs). Para a regeneração hepática-driven hepatócito, existem modelos de roedores excelentes que têm contribuído significativamente para a compreensão atual da regeneração hepática. No entanto, não existe tal modelo de roedor existe para regeneração hepática-driven biliar. Nós recentemente relatado em um modelo de fígado de peixe-zebra em que BECs extensivamente dar origem a hepatócitos após a perda de hepatócitos grave. Neste modelo, os hepatócitos são especificamente ablação por um meio de farmacogenética. Aqui nós apresentamos em detalhes os métodos para retirar hepatócitos e analisar o processo de regeneração hepática BEC-driven.Este modelo de ablação específica do hepatócito pode ser ainda usado para descobrir os mecanismos moleculares e celulares subjacentes da regeneração hepática-driven biliar. Além disso, estes métodos podem ser aplicados para telas químicas para identificar moléculas pequenas que aumentam ou suprimem a regeneração do fígado.

Introdução

O fígado é um órgão altamente regenerativa. Durante a regeneração do fígado, regenerar hepatócitos, as células do parênquima do fígado, são derivados de hepatócitos pré-existentes (regeneração hepática-driven hepatócitos) ou BEC (regeneração hepática-driven biliar) 1,2. A lesão hepática geralmente provoca a proliferação de hepatócitos pré-existentes; no entanto, quando a proliferação de hepatócitos é comprometida, CEBs pode contribuir para hepatócitos 2-4. Estes dois modos de regeneração do fígado são clinicamente significativa. Após a remoção cirúrgica de uma porção do fígado humano (por exemplo, devido a tumores do fígado ou dadores vivos de fígado), hepatócitos no fígado proliferam restante para recuperar a massa do fígado perdida. Em contraste, em doentes com doenças hepáticas graves, a proliferação dos hepatócitos é grandemente comprometida, de modo a que as CEBs ou células progenitoras do fígado (LPCs) parecem contribuir para a regeneração de hepatócitos 5,6. O modelo de roedor 2/3 hepatectomia parcial, em quehepatócitos proliferam para recuperar a massa hepática perdido, tem contribuído significativamente para a compreensão atual de-driven hepatócito regeneração hepática 7,8. No entanto, não existe um modelo roedor válido no qual os hepatócitos em regeneração são derivados principalmente de CEBs. Embora vários modelos de toxina de roedor fígado levou à identificação de-driven biliar regeneração hepática 2-4, estudos recentes em rastreio de linhagem ratos indicam uma contribuição mínima de CEBs para regenerar hepatócitos nestes modelos 9,10. Alguns dos modelos de lesão de fígado de roedores, incluindo hepatectomia parcial 11-13 e induzida por acetaminofeno danos no fígado 14,15, ter sido aplicada a peixes-zebra e levou à identificação de novos genes ou vias envolvidas na regeneração do fígado. No entanto, hepatócito-driven, mas não BEC-driven, a regeneração do fígado ocorre nesses modelos de lesão do fígado de peixe-zebra. Portanto, um modelo de fígado romance em que BECs contribuir amplamente para se regeneraing hepatócitos é necessária para uma melhor compreensão da regeneração hepática BEC-driven.

Os objetivos gerais do modelo de ablação de hepatócitos descritos aqui são (1) para gerar um modelo de fígado em que BECs contribuir amplamente para os hepatócitos em regeneração, e (2) elucidar os mecanismos moleculares e celulares subjacentes regeneração hepática BEC-driven. Nossa hipótese é que a gravidade da lesão determina o modo de regeneração do fígado; Assim, previmos que a regeneração hepática-driven biliar iniciaria após lesão hepática grave. Para testar esta hipótese, desenvolvemos um modelo de fígado de peixe-zebra, gerando uma linhagem transgênica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, que é altamente expressa nitrorredutase bacteriana (NTR) fundido com a proteína fluorescente ciano (PCP), sob a fabp10a específicas do hepatócito promotor. Desde NTR converte a pró-droga não tóxica, metronidazol (Mtz), em um fármaco citotóxico, ele destina-se somente a ablates NTR-células que expressam 16-18, neste caso, os hepatócitos. Ao manipular a duração do tratamento Mtz, a extensão da ablação de hepatócitos pode ser controlada. Usando esse modelo, que recentemente informou que após a perda de hepatócitos grave, BECs extensivamente dar origem a regeneração hepatócitos 19, que foi ainda confirmada por outros dois estudos independentes 20,21. Portanto, em comparação com o acima mencionado roedor e modelos de lesão de fígado de peixe-zebra, o nosso modelo de ablação dos hepatócitos é mais vantajoso para estudar a regeneração hepática BEC-dirigido.

Este protocolo descreve o procedimento para a realização de experimentos de regeneração hepática utilizando o modelo de ablação de hepatócitos peixe-zebra. Este modelo será adequado para determinar os mecanismos subjacentes a regeneração hepática-driven biliar e para telas químicas para identificar pequenas moléculas que pode reprimir ou aumentam a regeneração do fígado.

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Protocolo

Peixe-zebra foram levantadas e produzido de acordo com o procedimento padrão; experimentos foram aprovados pela Universidade de Pittsburgh Animal Care Institucional e Comitê de Uso.

1. Preparação de Embriões / larvas

  1. Para realizar cruzamentos programados, configurar adulto do sexo masculino e feminino Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 peixes hemizigóticas ou homozigotos O / N e colocar um divisor entre eles. Remover este divisor na manhã seguinte quando o acasalamento é desejado. Coletar embriões esticando a água usando um filtro fino malha de plástico.
  2. Ligue o filtro de cabeça para baixo e lavar a superfície da malha com um bom fluxo de água ovo dispensada de uma garrafa squeeze. Transferir 100 embriões em uma placa de 100 mm de petri com 25 ml de água ovo. Mantenha há mais de 100 embriões por placa de petri e criá-los a 28 ° C.
  3. Para inibir a pigmentação, adicionar feniltioureia (PTU) para as placas de petri antes de 10 horas pós-fertilização (HPF), e levantar embryos / larvas até 80 hpf. A concentração final do PTU é de 0,2 mm. CUIDADO: PTU é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  4. Anestesiar as larvas por adição de 3-amino benzóico éster etílico do ácido (tricaina), a uma concentração final de 0,016%, em placas de petri. Em seguida, utilizando um microscópio de epifluorescência, larvas tipo PCP-positiva. Use larvas com um tamanho semelhante fígado e descartar aqueles com uma menor ou maior do fígado.
    NOTA: qualquer larvas PCP-positivo, independentemente de intensidade, pode ser utilizado porque não há nenhuma diferença na extensão da ablação de hepatócitos entre as larvas hemizigótico e homozigoto. CUIDADO: tricaina é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  5. Retire a água ovo contendo tricaina e adicione água ovo suplementado com 0,2 mM PTU. Manter a embriões / larvas a 28 ° C.

2. Tratamento Mtz

  1. Prepare fresco solução a 10 mM Mtz dissolvendo 0,171 g de pó em 1 Mtz00 ml de água de ovo suplementado com 0,2% de DMSO e 0,2 mM de UTP. Para dissolver completamente o Mtz, misturar a solução à temperatura ambiente com agitação rápida durante 20-30 minutos. Para ajudar a solubilizar Mtz Mtz e para melhorar a permeação para as larvas, adicione DMSO ao preparar Mtz. CUIDADO: A exposição prolongada ou aumento da concentração de Mtz é tóxico. Use de acordo com as diretrizes de manejo adequadas.
  2. Separe as larvas em grupos controle e experimentais, transferindo número desejado de larvas em duas diferente 100 mm prato de petri ou multi-bem placa. Para o grupo experimental, manter as larvas em solução Mtz 10 mM; para o grupo controle, mantê-los em água ovo contendo 0,2% de DMSO.
  3. Cobrir as placas ou pratos de petri contendo a solução Mtz com folha de alumínio para evitar o foto-inactivação da MTZ, e incuba-se a 28 ° C. A duração do tratamento depende da Mtz fase larval e a linha transgénica.
  4. Para observar a ablação de hepatócitos grave semelhante no Tg (fabp10a: NTR-PCP) linha, tratar as larvas com a solução de Mtz ou 3,5 dias pós-fertilização (dpf) (para uma duração de 36 h) ou a partir de 5 dpf (para uma duração de 24 horas).

3. Análise da regeneração hepática biliar-driven

  1. No final do período de ablação, remover a solução Mtz das placas. Lavar as larvas tratadas com Mtz por adição de 25 ml de água ovo. Agitar a placa de 2-3 vezes para lavar as larvas antes de descartar a água do ovo. Repetir três vezes e, em seguida, mergulhar as larvas mais uma vez em água de ovo. Para evitar o edema do coração e a morte larval em larvas tratadas com Mtz, adicionar uma concentração mais baixa de tricaina, a uma concentração final de 0,008%, para imobilizar as larvas.
  2. Para a análise do fígado, fígado examinar o tamanho das larvas tratadas com Mtz sob um microscópio de epifluorescência, com o filtro de PCP. Avaliar os níveis de ablação de hepatócitos com base no tamanho relativo do fígado: grande (não-ablação; 0-10% de larvas), forma (parcialmente ablação; 10-20%), e muito pequena (totalmente ablação; 80-90%).
  3. Retirar as larvas com fígados não ablacionadas ou parcialmente extirpadas. Apenas manter larvas com uma pequena fígado, o que é indicativo de ablação hepatócitos grave. Para a análise de fígado na regeneração 0 ponto de tempo hr (R0h), colher as larvas após Mtz washout e PCP classificação. Caso contrário, mantenha as larvas classificadas em água ovo suplementado com PTU 0,2 mM até que esteja pronto para a colheita.
  4. Transferir larvas recolhidas para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e substituir a água de ovo com a solução de fixação de formaldeído a 3% em tampão PEM. Incubar o tubo num rotor O / N a 4 ° C.
  5. Substituir a solução de fixação com 1 ml de PBSDT e rodar o tubo contendo as larvas no rotor durante 5 min.
  6. Transferir as larvas fixo numa placa de Petri contendo 100 milímetros PBSDT usando uma pinça e, remover manualmente gema e barbatanas peitorais sob um microscópio de dissecação. Transfira até tp 20 larvas dissecado em um tubo de 1,5 ml.
  7. Substitua PBSDT solução com 1 ml de solução de bloqueio e balançar o tubo num agitador rotativo à temperatura ambiente durante 2 h.
  8. Substituir solução de bloqueio com 100 ul de solução contendo os anticorpos primários de bloqueio. Lentamente balançar o tubo num rotor O / N a 4 ° C.
  9. Remover a solução de anticorpo primário e lava-se com PBSDT 5 vezes durante 10 min de cada vez. Em seguida, adiciona-se 100 ul de solução de bloqueio contendo anticorpos secundários e rocha que num rotor a TA durante 2 h.
  10. Lavar cinco vezes com PBSDT durante 10 min de cada vez, à TA por balanço num rotor.
  11. Orientar as larvas lateralmente sobre uma lâmina de microscópio e adicionar uma gota de meio de montagem. Cobri-los cuidadosamente com uma tampa de vidro e selar a tampa de vidro com um esmalte de unha. Agora, ele está pronto para a microscopia confocal.

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Resultados

MTZ tratamento durante 36 h (A36h, A representa ablação) 3,5-5 dpf reduzida drasticamente o tamanho do fígado (Figura 1B). Depois Mtz washout, considerado como o início de regeneração hepática (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: expressão dsRed reapareceu no prazo de 30 horas (Figura 1B). A rede biliar intra-hepático, tal como avaliado por expressão de Alcam que está presente na membrana de CEBs 22, mas inicialmente recolhido foi restabelecida em 54 horas...

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Discussão

Grave, mas não leve, ablação de hepatócitos provoca a regeneração do fígado-driven biliar. Por conseguinte, após o tratamento de lavagem e Mtz, é importante para examinar o tamanho do fígado das larvas tratadas com Mtz, que pode ser avaliada pela fluorescência intrínseca do PCP fabp10a: NTR-PCP transgene. Uma vez que uma pequena percentagem das larvas tratadas com Mtz exibirá não excisada (0-5%) ou parcialmente ablação (10-20%) os fígados, é essencial para resolver e apenas analisar as larvas com uma muito pequ...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem aos Drs. Hukriede e Tsang pelas discussões. M.K. foi apoiado por uma bolsa de treinamento do NIH (T32EB001026). Este trabalho foi apoiado em parte por doações da American Liver Foundation, da March of Dimes Foundation (5-FY12-39) e do NIH (DK101426) para DS

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Éster etílico de ácido 3-aminobenzóico (tricaína) em póSigma-AldrichA5040Faça estoque de tricaína a 0,4% (15 mM): Leve 0,4 g de tricaína a 100 mL com água de ovo. Ajuste para pH 7. 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
MetronidazolSigma-AldrichM1547
Triton X-100Sigma-AldrichT8532
FormaldeídoSigma-Aldrich252549
Sulfato de cálcio di-hidratadoSigma-AldrichC3771
N-feniltioureia (PTU)Sigma-AldrichP7629
Mídia de montagem (Vectashield)Vector LaboratoriesH-1000
100 x 15 mm placa de Petri Denville Scientific Inc.Esmalte transparente M5300
Fisher Scientific50949071
pinça finaFerramentas de Ciência Fina11251-20Dumont #5 
lâmina de vidroFisher Scientific12-544-1
lamínula de vidroFisher Scientific12-540-A e 12-542-A18 x 18 mm
zn-5 (camundongo anti-Alcam)ZIRCzn-51:10 diluição
cabra anti-Hnf4aSanta Cruzsc-6556 (C-19)diluição 1:50
rato anti-RFPalelo BiotecnologiaACT-CM-MRRFP101:300 diluição
AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L)Jackson laboratories705-605-147Diluição 1:500
AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L)InvitrogenA21240diluição 1:500
Cy3 burro anti-rato IgGJackson laboratories712-165-1501:500 microscópio
de dissecação de diluiçãoLeica MicrosystemsS6F
microscópio de epifluorescênciaLeica MicrosystemsM205FA
microscópio confocalCarl ZeissLSM700
águade ovo 0,3 g/L de sais marinhos ' Oceano instantâneo' e CaSO4 0,5 mM em água destilada.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
[header]
10X PBS25.6 g Na2HPO4· 7H2O, 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 2 g de KH2PO4.  Leve a 1 L com água destilada.  Ajuste o pH 7.  Autoclave por 20 min a 121 graus Celsius.
1X PBSDT0,2% Triton X-100 e 0,2% DMSO em 1 X PBS.
Tampão30,2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.  Leve a 1 L com água destilada.  Ajuste o pH 7.
SoluçãoMisture 1 ml de soro de cavalo inativado pelo calor com 9 ml de PBSDT 1X.
PEM de bloqueio

Referências

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