Aqui demonstramos os métodos mais eficientes para congelamento, incorporação, criossecção e coloração de biópsias musculares para evitar o congelamento de artefatos.
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Artigo de método
Fazer e não fazer na preparação de músculo Cortes congelados para análise histológica
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
A avaliação histológica de biópsias do músculo tem servido como uma ferramenta indispensável para a compreensão do desenvolvimento e progressão da patologia de doenças neuromusculares. No entanto, a fim de fazê-lo, o cuidado apropriado deve ser tomado quando excisão e preservar tecidos para alcançar a coloração ideal. Um método de preservação de tecido envolve a fixação tecidos em formaldeído e, em seguida, incorporando-os com cera de parafina. Este método preserva morfologia bem e permite o armazenamento a longo prazo a temperatura ambiente, mas é difícil e requer a manipulação de produtos químicos tóxicos. Além disso, os resultados de fixação em formaldeído antígeno cross-linking, o que exige protocolos de recuperação antigênica para immunostaining eficaz. Pelo contrário, o seccionamento congelado não necessita de fixação e, assim, retém a conformação antigénio biológica. Este método também fornece uma vantagem distinta em volta rápida em torno do tempo, tornando-se especialmente útil em situações que necessitam de avaliação histológica rápido como intraoperativa biópsias cirúrgicas. Aqui nós descrevemos o método mais eficaz de preparação de biópsias musculares para visualização com diferentes colorações histológicas e imunológicas.
Introdução
O exame de histologia muscular desempenha um papel crítico na compreensão de diferentes tipos de distúrbios neuromusculares 1-4. Quando combinado com outras técnicas, permite que pesquisadores para ter uma idéia melhor da manifestação ea progressão da patologia e também pode ser essencial para avaliar a eficácia de uma intervenção terapêutica 5-10. No entanto, para ser exato, os tecidos precisam ser preservados de forma adequada, de modo a preservar o estado fisiológico imediatamente antes da excisão. Isso requer muito cuidado durante a remoção, preservação, seccionamento e coloração.
Os tecidos podem ser preparados de duas maneiras diferentes para estudo microscópico luz. O método primeiro, fixados em formalina embebidos em parafina (FFPE) seções, requer tecidos fixados em formol 10% tamponado naturais antes de ser incorporado com cera de parafina 11,12. A etapa de fixação ajuda a preservar a morfologia melhor, mas também ligações cruzadas pr endógenooteins necessitando, portanto, de antigénios intrincado procedimentos de recuperação para a imunocoloração e eliminando a possibilidade de coloração enzimática em tais seções 12. As secções congeladas, por outro lado, não precisa de ser pré-fixo ou processado; por conseguinte, as proteínas são capazes de reter conformações nativas biológicos 13,14. Além disso, cortes congelados também permitem rápido tempo de resposta, que às vezes é necessário, por exemplo, no diagnóstico intra-operatório de sarcomas e outras biópsias cirúrgicas 15. No entanto, se não for feito corretamente, este método é propenso a congelar danos, que introduz alterações à arquitetura muscular fazendo as seções impróprios para exame histológico. Este artigo irá delinear o método mais eficaz para preparar biópsias musculares, a fim de alcançar uma óptima coloração para exame adequado.
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Protocolo
1. Tissue Colheita e congelamento dos tecidos musculares
- Eutanásia o rato com uma overdose de isoflurano (2-cloro-2- (difluorometoxi) -1,1,1-trifluoro-etano). Execute esta etapa em um exaustor e usar um método de contenção secundária, como um secador ou uma redoma de vidro contendo um cotonete embebido em isoflurano.
- Confirme a morte com firmeza apertando pata. Use um método secundário de eutanásia, como luxação cervical.
- Molhar a pele com álcool a 70% para reduzir a aderência de fios de cabelo soltos sobre os músculos. Descasque a pele fora o membro usando uma pinça fina, tais como # 5.
- Cuidadosamente separar o músculo de interesse (tibial anterior (TA), neste caso) a partir dos ossos por baixo, a partir do tendão e remover.
- Extirpar o músculo, cobri-lo em outubro (de corte ideal composto de temperatura), e coloque-o deitado sobre um molde de congelamento descartável rotulados. Certifique-se de que o músculo está em sua orientação fisiológica normal (cabeça para tail) sem esticar. Alternativamente, congelar o músculo em pequenos quadrados de isopor e fixá-lo utilizando os pinos de insetos para garantir o comprimento correto dos músculos.
- Relaxar 2-metilbutano (isopentano) em um copo de aço usando azoto líquido. Isso leva, em média, 3-5 min. Continue mexendo de forma intermitente até precipitados brancos começam a se formar no fundo e paredes do copo.
NOTA: Quando isso ocorre, isopentano tenha alcançado a temperatura ideal de congelamento (-150 ° C) - Mergulhe os moldes contendo músculos na gelada de 2-metilbutano. Congelar pequenos músculos, como o diafragma e longus extensor digitorum (EDL) para 6-12 seg e músculos maiores, como o sóleo gastrocnêmio (GS) e tríceps para 15 - 20 seg. Não congelar os músculos por muito tempo, pois isso pode levar a fissuras.
- Transfira os tecidos congelados sobre gelo seco e deixe evaporar isopentano (note que este processo leva em média cerca de 15 - 20 min). Enrole os tecidos em papel alumínio e armazená-los em ultra baixa temperatura (-70 ° C a -80 ° C) até o corte.
2. Incorporar os tecidos em outubro de Elaborar bloco de tecido
- Tecidos de transporte em gelo seco para cyrostat para evitar o descongelamento. Transferência para o tecido criostato câmara (definida a -20 a -24 ° C para evitar o descongelamento completo de tecidos) e deixá-los equilibrar durante 30 min.
- Vire a baía Peltier de refrigeração por diante. Se o cryostat não tem esse resfriamento, use aerosol spray de arrefecimento para congelar rapidamente a outubro Não deixe que o degelo do músculo em qualquer ponto durante a incorporação, pois isso pode resultar em danos causados por congelamento.
- Adicione uma camada fina e uniforme de outubro no disco de amostra e deixe esfriar. Quando a maior parte dos PTU é congelada no fundo enquanto ainda líquido na parte superior, insira o tecido na orientação correta (perpendicular outubro para seções transversais e paralelas para outubro para cortes longitudinais). Use spray de aerosol arrefecimento para congelar rapidamente outubro Toque na parte unembeded do tecido com calor extractor e aguarde 45 segundos.
- Adicionar outra camada fina de outubro em torno do músculo, pulverizador com de aerossol de pulverização de arrefecimento e extrair o calor tal como no passo anterior.
- Continua a adicionar outubro em pequenos incrementos e congelar rapidamente OCT utilizando uma combinação de aerossol de pulverização e extractor de calor de arrefecimento até que todo o músculo é coberto.
- Colocar o extractor de calor na parte superior do bloco de tecido e esperar durante 5 min.
3. Preparar Seções e identificando as secções de Mid-barriga Região dos Músculos
- Montar o espécime para o cabeçote da amostra. Aperte o botão para fixar o disco. Certifique-se de que o disco de amostra está em bom contato com o cabeçote de amostra.
- Ajuste a temperatura da câmara de entre -21 e -24 ° C e aguarde até que a temperatura definida é alcançada.
- Ajuste as configurações de espessura (7 um); aparar o bloco através do avanço ou retração do bloco usando configurações grossas e finas.
- Recolher as seçõesem pré-aquecido lâminas de microscópio com carga positiva, pressionando a parte superior da lâmina para as secções, utilizando a atracção entre cargas opostas para facilitar a aderência das secções de corte na lâmina.
- Identificar as secções médio-barriga por medição da área da secção transversa (AST) das secções. Faça isso usando software de imagem no computador que está ligado ao microscópio.
NOTA: As imagens de contraste de fase são tomadas e circunferência de todo o músculo é medido através de uma função de rastreamento sobre o programa de software. Isto irá proporcionar tanto CSA, bem como diâmetro mínimo furão (medida de fibras de tamanho em corte transversal que é expressa como a menor distância entre duas tangentes paralelas em lados opostos de uma partícula) medições. Nota: Quando CSA e diâmetro mínimo ferret medições começar a platô, mid barriga foi atingido. - Inventário e arquivar as lâminas a -80 ° C para a coloração futuro.
NOTA: o PTU não precisam ser removidos antes da staininprocedimentos de g. Uma vez que as lâminas são lamínulas, eles estão prontos para ser manchado imediatamente.
4. Coloração
NOTA: Embora os procedimentos passo a passo detalhadas podem ser encontradas na folha de dados do produto e deve ser seguido por procedimentos de coloração, otimização de pessoal pode ser obrigado a obter a coloração ideal.
- Como meios de montagem (ver quadro) não seja miscível com água, por meio de lâminas de desidratar graus crescentes de álcool (2 min cada em 70%, 95%, e 100% de etanol) e limpá-las com xileno (100% durante 5 min) para garantir lâminas não se tornam opaca ao longo do tempo.
- Lamela seções e deixe-os secar. Imagem com microscópio equipado com software de imagem.
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Resultados
A instalação para a colheita e congelamento de tecidos pode ser visto na Figura 1. Tecidos excisados deve ser armazenado em uma gaze embebida em PBS para evitar a secagem (Figura 1A). Quando os tecidos são selecionados para serem utilizados para análise histológica eles devem ser mergulhados em outubro e dispostas em molde crio na orientação adequada e tão perto de comprimento fisiológico possível para garantir a morfologia preciso (Figura 1B). Polpa de isopentano apr...
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Discussão
A histologia e imuno-histoquímica têm sido utilizados como ferramentas fundamentais para a compreensão da manifestação e progressão da patologia de várias desordens neuromusculares. Classicamente, biópsias musculares foram fixadas pela primeira vez em formaldeído e depois incorporado com cera de parafina. Enquanto fixação em formol preserva a arquitetura do tecido e permite o armazenamento e transporte de tecido à temperatura ambiente, também inativa enzimas e proteínas ligações cruzadas que obrigariam a novas medidas p...
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Alex Miller pelas revisões do manuscrito. Este trabalho foi apoiado com as bolsas de pesquisa concedidas a M.G. da Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) e Muscular Dystrophy Association (218938).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Criostato | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 EUA, telefone comercial 1-800-248-0123 Alternativa: Richard Allen Scientific |
| Microscópio | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativa: Olympus |
| Software de análise de imagem | Nikon Imaging Software Pesquisa Básica | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, EUA, Telefone: 1-631-547-8500 Alternativas: Imagem J, Metamorph |
| Isoflurano | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 EUA |
| OUTUBRO | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Fonte alternativa: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR |
| Scientific Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Fonte alternativa: VWR Scientific |
Referências
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Reimpressões e permissões
