Atímica Rat Modelo de Avaliação da Engineered Ligamento Cruzado Anterior Enxertos

Resumo

Animal models are important tools for the evaluation of tissue-engineered grafts. This paper presents the protocol for preparing an electrospun biodegradable polymer graft for use in anterior cruciate ligament tissue engineering, as well as a surgical protocol for implantation in a rat model.

Resumo

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without intervention. Current treatment strategies include ligament reconstruction with either autograft or allograft, which each have their associated limitations. Thus, there is interest in designing a tissue-engineered graft for use in ACL reconstruction. We describe the fabrication of an electrospun polymer graft for use in ACL tissue engineering. This polycaprolactone graft is biocompatible, biodegradable, porous, and is comprised of aligned fibers. Because an animal model is necessary to evaluate such a graft, this paper describes an intra-articular athymic rat model of ACL reconstruction that can be used to evaluate engineered grafts, including those seeded with xenogeneic cells. Representative histology and biomechanical testing results at 16 weeks postoperatively are presented, with grafts tested immediately post-implantation and contralateral native ACLs serving as controls. The present study provides a reproducible animal model with which to evaluate tissue engineered ACL grafts, and demonstrates the potential of a regenerative medicine approach to treatment of ACL rupture.

Introdução

A ruptura do ligamento cruzado anterior (LCA) é uma das mais comuns de lesões ligamentares do joelho ^1. Porque a ruptura do LCA é incapaz de curar sem intervenção cirúrgica, as limitações nas atividades da vida diária, bem como a participação em esportes de carro mais de 175.000 pacientes submetidos à cirurgia a cada ano ^2, com um custo estimado de um bilhão de dólares por ano ^3. Atualmente, qualquer auto-enxerto ou enxerto de tendão é usado para a reconstrução do ligamento. Embora altas taxas de sucesso pode ser alcançado com tanto auto-enxerto e enxerto de substituição, complicações graves estão associados com estas opções de reconstrução ^4. Tecido auto-enxerto é associado com área doadora morbidade e é limitado em oferta, especialmente em casos de re-ruptura ou lesão multi-ligamentar. Por outro lado, o tecido do enxerto está ligada com a integração do enxerto retardada, a resposta inflamatória adverso, o risco infeccioso teórica, e supp limitadoly ^5. Enxertos não degradáveis ​​sintéticos foram desenvolvidos na década de 1970 e 1980, mas foram prejudicados pela ruptura prematura do enxerto, reações de corpo estranho, osteólise, e sinovite ^6. Como resultado dessas preocupações sérias, não existem actualmente enxertos sintéticos disponíveis para uso clínico nos Estados Unidos.

Devido a essas limitações com opções de enxerto existentes e aos desenvolvimentos recentes em biologia, engenharia e medicina regenerativa, tem havido grande interesse em uma solução de engenharia de tecidos para ACL enxertia. Estratégias de engenharia de tecidos actuais empregam materiais biológicos e sintéticos biodegradáveis ​​para permitir o crescimento interno de tecido do hospedeiro, evitando as limitações associadas com o implante de material sintético permanente ^7.

Policaprolactona (PCL) é um polímero biodegradável que é aprovado pela FDA para um número de aplicações médicas, incluindo barreira de adesão e curativos ^8, que tem sido used em uma ampla variedade de aplicações, incluindo vasculares, osso, cartilagem, nervo, pele, tecido esofágico e engenharia ^5,9-16. Biocompatibilidade favorável, relativamente longa in vivo meia-vida, a força mecânica adequada, e uma elevada elasticidade contribuir para a popularidade deste polímero em engenharia de tecidos. Em um modelo de roedor de cicatrização de feridas, implantado PCL electrospun foi demonstrado ser não imunogénico e para integrar no tecido local, sem reacções adversas ^13. Uma imagem SEM de electrospun PCL é mostrado na Figura 1.

Com atual FDA regulamentar normas, eficácia e segurança em ambos os pequenos e grandes modelos animais seria necessário para um PCL ou qualquer outra ACL enxerto projetado para mover-se em ensaios clínicos nos Estados Unidos. Além disso, condições in vivo pode muitas vezes aumentar as propriedades de um ACL enxerto de tecido in vitro engenharia. Um modelo de rato de reconstrução do LCA autólogo com flexor digitorhum longus tendão foi descrito anteriormente, em que o ACL nativa foi cortada, femorais e tibiais túneis foram perfurados, e o enxerto foi aprovada e fixada no local com sutura ^17-22. Neste artigo, iremos descrever uma modificação deste modelo para a avaliação de substituições ACL engenharia em vez de para a reconstrução à base de auto-enxerto (Figura 2).

Apesar de existirem muitos modelos animais para a engenharia de tecidos ligamento, o rato é vantajosa em relação aos modelos maiores para um número de razões. Essas vantagens incluem mais fácil criação e manipulação, menos considerações éticas, e reduziu ^17,23 custo. Além disso, o modelo do rato tem sido utilizada extensivamente como um modelo para a regeneração do tecido ortopédico, incluindo cartilagem, tendão, e engenharia de tecidos ósseos ^24. Em particular, os ratos nus atímicos foram escolhidos devido à sua falta de resposta mediada por células imunes ^{de 25,} permitindo a eventual implantação océlulas dadoras xenogénicas f neste modelo para aumentar ainda mais o enxerto engenharia no futuro. Neste trabalho métodos, descrevemos a fabricação e implantação cirúrgica de um acelular, enxerto polímero biodegradável em um modelo de rato atímica de reconstrução do LCA.

Protocolo

NOTA: Todas as cirurgias animais foram aprovados pela equipe e animal veterinário comitê de uso local, antes do início dos experimentos.

1. Preparação de electrospun Policaprolactona Andaimes

1. Pesar e dissolver de grau médico de poli éster terminado (ε-caprolactona) em forma de grânulo em 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol, para criar uma 10% w / w solução do polímero PCL. Deixe a solução agitar utilizando uma placa de agitação durante pelo menos 3 h para assegurar uma solução homogénea.
2. Electrospin a solução PCL para criar um manguito de fibras PCL altamente alinhadas para a fabricação de andaime.
   1. Prepare a configuração electrospinning em um exaustor química com o ventilador ligado em todos os momentos. Este consiste em uma grande caixa de acrílico, que servirá como um meio isolado a vácuo para o processo de electrospinning e tem pontos de entrada para a solução de fonte PCL impulsionado por uma fonte de tensão, o mandril coletando a motor, e uma porta de vácuo. Limpe o acrylicaixa c cuidadosamente com etanol e cobrir todas as superfícies com folhas de Parafilm para remover quaisquer impurezas que podem comprometer a qualidade do produto electrospun.
   2. Carga de aproximadamente 3 ml da solução anterior em uma seringa de 10 ml com um rombo 18 L, 1 ½ polegada agulha. Remova as bolhas de ar, empurrando a seringa para cima. Solução de bloqueio em uma bomba de seringa programável. Insira a agulha através de um pequeno buraco na caixa de acrílico, deixando cerca de ½ polegada da agulha fora da caixa de acrílico para fixação do fio de fonte de tensão.
   3. Use a 30 milímetros girando mandril Torno como o coletor para as fibras do LCP altamente alinhados; cobrir o mandril firmemente com uma fina tira de papel alumínio. Bloquear o mandril no interior do motor, no lado oposto da caixa de cerca de 15 cm de distância a partir da agulha de uma seringa.
   4. Insira a mangueira de plástico na porta de vácuo e se conectar à fonte de vácuo coifa. Ligar a fonte de vácuo e cobrir a caixa de acrílico com uma tampa.
   5. Set a velocidade da bomba de seringa programável de 2,5 ml / h de infusão. Ligue o motor para operar o mandril a 3.450 rpm e anexar o fio positivo da fonte de tensão para a ponta da agulha fora da caixa usando um jacaré.
   6. Uma vez que a infusão da solução PCL começou, ligue a fonte de tensão e definir a tensão de operação de 20 kV.
   7. Infundir a solução durante 12 minutos para criar uma braçadeira homogénea a partir de 0,5 ml da solução de PCL.
      NOTA: Em média, cada canhão tem material de electrospun suficiente para criar duas folhas de seis lâminas, que podem ser utilizados para criar um total de três suportes de quatro camadas.
3. Laser cortar o manguito PCL para formar várias pequenas folhas em um VersaLaser Cortador 2.3 operado a configuração de baixa vácuo, tensão pouso 10,0 keV, 6,4 mm de distância de trabalho, e diâmetro da sonda de 3,0.
   NOTA: Neste exemplo, um desenho assistido por computador foi utilizado para instruir o cortador para produzir várias folhas de 1,5 mm x 35 mm x 150 mm com andaimesuniformemente distribuídos 150 mm de diâmetro nos 15% de área de poros.
4. Plasma gravar os scaffolds PCL usando um aspirador de plasma para induzir a hidrofilicidade da superfície PCL com aceleração de íons. Defina a vácuo para 450 mTorr e o deleite dos andaimes para 30 segundos a alta potência (29,6 W).
5. Banhe os andaimes em etanol a 70% em um ambiente estéril.
6. Brasão os andaimes individuais com colágeno para facilitar a adesão e proliferação celular in vivo.
   1. Criar uma solução de revestimento de colagénio por diluição de um 8: solução estéril de 2,5 Purecol colagénio de 3 mg / ml de solução-padrão, 10x PBS e NaOH 0,1 N 1:: 1 9 em 1x PBS a 4 ° C. Misturar bem com a solução de assegurar homogeneidade.
   2. Casaco indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm andaimes com uma película de camada fina da solução de colagénio acima. Deixa-se secar durante 24 horas em um ambiente estéril.
7. Usando 5-0 Vicryl, empilhar e apor quatro indivíduo 1,5 milímetros x 35 mm x 150 mm scaffoldsusando um Krackow pontos para criar uma final 0,6 milímetros multi-camadas, andaime de espessura, revestido de colágeno, que está pronto para a implantação.

2. Rat Cirurgia Protocol

1. Induzir a anestesia, colocando rato na câmara de inalação e entrega de 2% de isoflurano com 2 L / min de oxigênio. Confirme o rato está devidamente anestesiados pela aplicação de pressão a pata traseira e avaliação para qualquer resposta.
2. Na mesa de volta não estéril, subcutaneamente injectar 25 mg / kg de ampicilina e 0,03 mg / kg de buprenorfina.
3. Aplicar pomada oftálmica para os olhos. Clipe da pele do membro posterior operatório e preparar o sítio cirúrgico com três esfrega alternadas de clorexidina e etanol 70%.
4. Transfira o rato para a mesa de operação, em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Nariz cone seguro e manter a anestesia através do procedimento com 2% de isoflurano em 2 L / min de oxigênio, entregue cone do nariz. Drapejá de uma forma estéril, deixando o membro operativo exposta.
5. Antes de iniciar a cirurgia, primeiro, confirmar anesthetization adequada por falta de uma resposta à pressão do pé traseiras.
6. Adicione uma 2 cm de comprimento incisão média vertical para o joelho, centrado no nível da rótula. Retirar a pele lateralmente até a incisão é centrado sobre o joelho.
7. Usar um bisturi para fazer uma artrotomia parapatelar medial cortando apenas medial para a patela e estendendo-se proximalmente para o nível da junção músculo do quadríceps e distal ao nível da inserção do tendão patelar sobre o tubérculo tibial. Tome cuidado para não cortar os patelares ou quadríceps tendões.
8. Patela libertação lateralmente através de uma incisão vertical 1 cm para dentro da cápsula do joelho imediatamente lateral do tendão patelar.
9. Verifique se o joelho é estendido. Pegue um par de tesouras finas e passar sob a patela de lateral para medial. Espalhe a tesoura algumas vezes para que o mecanismo extensor pode ser traduzido para ambos os lados.
10. Enquanto flexionando tele joelho, traduzir a patela lateralmente para expor o interior da articulação do joelho. Certifique-se de clara visualização da fossa intercondilar e côndilos do fêmur. Usando um bisturi, transecto a ACL e PCL no entalhe.
11. Carga furadeira com uma k-wire 1,6 milímetros. Coloque ponta k-fio no ACL origem na fossa intercondilar. Broca superolaterally e visualizar o ponto de saída na face lateral do fêmur, a remoção de todo o tecido macio, se necessário com um bisturi. Passe o fio k dentro e fora algumas vezes para garantir a passagem livre para o enxerto.
12. Coloque o fio k sobre a pegada ACL no platô tibial. Broca anterolateralmente e visualizar ponto de saída na tíbia proximal ântero-lateral. Use bisturi para limpar tecidos moles como necessário de modo que o ponto onde o fio de k-sai da tíbia é completamente visualizada.
13. Passe uma agulha encurtado Keith (o ideal é não mais do que 2 centímetros de comprimento) através do túnel do osso femoral. Passe as duas pontas de sutura de uma extremidade do enxerto através do olho da Kagulha eith. Usar a agulha para puxar uma extremidade do enxerto através do túnel femoral.
14. Repetir o passo anterior para passar a outra extremidade do enxerto através do túnel tibial.
15. Use 4-0 Vicryl sutura para fixar o fim femoral do enxerto ao redor periósteo ou outros tecidos moles com um ponto a figura de oito. Tensão manualmente o enxerto com o joelho em extensão. Apor o fim tibial do enxerto de periósteo circundante ou outro tecido mole com um ponto figura em forma de oito.
16. Utilize uma tesoura para cortar o excesso de enxerto em ambas as extremidades, deixando 1-2 mm em cada extremidade passado o ponto figura em forma de oito.
17. Estenda o joelho e reduzir a patela. Usando 4-0 vicryl, coloque um ponto único figura de oito para fechar a cápsula articular medial, impedindo subluxação lateral da patela.
18. Feche a pele com um subcuticular 5-0 Monocryl ou Vicryl sutura contínua, com cuidado para não suturar o músculo subjacente ou ter qualquer sutura visível uma vez que a pele é fechada.
19. Inject ratos por via subcutânea com buprenorfina cada 12 horas para um total de três dias de pós-operatório. Verificar local cirúrgico para a drenagem ou deiscência da ferida no momento da injecção. Mancando e algum inchaço é normal nos primeiros dias após a cirurgia, mas prontamente quaisquer preocupações pós-operatórias em conjunto com o pessoal veterinário. O animal pode ser retornar à habitação social em 2 semanas de pós-operatório, quando incisões cirúrgicas são completamente curado.

3. Protocolo de Coleta de Dados

1. No momento do sacrifício, asfixiar ratos individualmente numa câmara fechada de CO _2, seguida por toracotomia.
2. Colha os dois membros cirurgicamente reconstruídos e contralateral, separando na articulação do quadril.
   1. Para os membros reconstruídos, remover todo o tecido mole, incluindo o ligamento cruzado posterior e os remanescentes da ACL nativa interrompido cirurgicamente, por dissecção fina para isolar apenas o fêmur, tíbia, e enxerto.
   2. Para os membros contralaterais, remover todo o tecido mole, exceto o ACL nativa assim como o fêmur ea tíbia por dissecção bem.
   3. Utilize uma ferramenta rotativa, tais como Dremel, para remover todos, mas ¾ de 1 cm de osso a partir de cada extremidade do fémur complexo tíbia-enxerto.
   4. Durante este processo, e ao longo do teste biomecânico, regular e frequentemente pulverizar as regiões ligamentares com salino normal para evitar a dessecação do joelho colhidas que podem alterar os resultados falsamente.
3. Para a análise histológica, fixar cada joelho individualmente em solução de paraformaldeído a 4% a 25 ° C durante 48 h. Em seguida, submergir o joelho em uma solução de reagente para Immunocal descalcificação completa; este processo é dependente do conteúdo de calcificação da amostra e pode levar até cinco dias. Verifique amostras individuais diariamente para avaliar o progresso como descalcificação incompleta pode reduzir a qualidade da amostra. Uma vez completo, executar o corte, montagem de slides, e coloração se o desejar.
4. Perform testes biomecânicos para avaliar a capacidade funcional do ligamento da engenharia de tecidos.
   1. Prenda o fêmur ea tíbia enrolando 28 G arame de aço galvanizado em torno da epífise de cada osso em separado. Isso é para evitar que os dados de testes biomecânicos imprecisas de falha de tração prematura da amostra com o osso em vez de no ligamento de interesse.
   2. Pot o fêmur em uma mistura de cimento de polimetilmetacrilato (PMMA) osso. Para fazer isto, misturar os dois componentes de cimento e utilizar imediatamente a mistura viscosa para fixar o fémur no interior do metal, que encerra completamente a diáfise do osso no pote cimentada com a epífise e ligado ligamento saliente livremente. Permitir espontânea polimerização por radicais livres de transformar gradualmente os componentes viscosos misturadas a um material pastoso e, eventualmente, em uma matriz sólida endurecido.
      NOTA: Este processo leva vários minutos e pode ser monitorado por avaliação manual da temperatura de um bolo feito a partir deo restante cimento; a temperatura deve aumentar transitoriamente durante a reacção de polimerização exotérmica e diminuem para a TA, depois os material solidifica.
   3. Repita o mesmo processo acima para cimentar a tíbia, com exceção, mantendo o ligamento do joelho em 20 ° de flexão para o teste mecânico ideal.
   4. Monte o complexo fêmur-enxerto-tibial cimentada em um aparelho de ensaio de tração, e se preparar para carga recorde e deslocamento em função do tempo a partir do início de tensão ao fracasso. Neste exemplo, foi utilizado um modelo Instron 5564 com uma célula de carga de 1 kN.
   5. Pré-tensão do enxerto a 2 N a uma velocidade de rampa de 0,5 N / min e, em seguida, para testar o enxerto falha a uma velocidade de deformação de 0,5 mm / seg. Durante o processo, certifique-se que o ligamento está falhando em meados da década de substância e que o fêmur e da tíbia óssea são seguras e não prematuramente falhando, o que pode inaccurately avaliar as propriedades biomecânicas do ligamento testado.
   6. Use a carga-deslocamento geradocurvas para calcular a carga de ruptura e de rigidez do ligamento testado.

Resultados

Em nossa experiência de 92 cirurgias de ratos por um único cirurgião, o tempo médio operatório da incisão para a conclusão da ferida foi de 16,9 min, com um desvio padrão de 4,7 min. No momento do sacrifício, os ratos pesavam 356 ± 23 g. Todos os ratos toleraram bem a cirurgia, e experiente sem complicações. Imediatamente após a cirurgia, os ratos foram anotados para suportar o peso sobre a extremidade operatório, mas exibiu um ligeiro coxear. Por uma semana de pós-operatório, todos os ratos foram deambu...

Discussão

Lesões do LCA é uma condição comum em cirurgia ortopédica de esportes, com opções limitadas de Reconstrução, com o tempo presente. A fim de desenvolver um substituto apropriado da engenharia de tecidos para a ACL que irá permitir a regeneração in vivo, num modelo animal adequado é necessária. Neste estudo, a fabricação de um enxerto de engenharia biodegradável é descrita, como é o seu implante in vivo utilizando um modelo reprodutível de reconstrução ACL em um rato atímico. Este ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Medical grade ester terminated poly (ε-caprolactone), granule form (MW = 110,000)	Lactel Absorbable Polymers		Custom synthesized polymer to desired molecular weight
1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol	Sigma-Aldrich	105228	Solvent for PCL polymer
18 G x 1½" bevel needle	BD Medical	305196
Remote Infuse/Withdraw Programmable Syringe Pump	Harvard Apparatus	702101
VersaLaser VLS2.30 Laser Engraver	Microgeo USA	VLS2.30
Expanded Plasma Cleaner 115 V	Harrick Plasma	PDC-001	Plasma etch just prior to collagen coating for surface modification
PureCol Collagen Standard Solution, 3 mg/ml	Advanced Biomatrix	5015-A	Mix 8:1:2.5 solution of PureCol, 10x PBS, 0.1 N NaOH 1:9 in 1x PBS
Suture, 5-0 Vicryl	Henry Schein	1086471
Suture, 4-0 Vicryl	Henry Schein	6540072
Sharp-pointed Dissecting Scissors (Straight; 4.5 inch)	Fisher Scientific	8940
Buphrenorphine hydrochloride	Sigma-Aldrich	B9275	Use 0.03 mg/kg for both intra- and post-operatively for pain control
Ampicillin, injectable	Henry Schein	1185678	Use 25 mg/kg subcutaneously during the procedure
K-wire, 1.6 mm	Spectrum Surgical	SI040062
Keith Needle, Straight 1½"	Delasco Dermatology Lab & Supply	KE-112
Immunocal Decalcifying Solution	Fisher Scientific	NC9491030
Opticryl Acrylic Resin Bone Cement (PMMA) (Monomer and polymer)	US Dental Depot	OPTICRYL 100410
Instron Model 5564 Tensile Testing Machine	Instron	5564	Any comparable tensile testing apparatus is suitable