Isolamento e caracterização de células-satélite de músculo de rato Cabeça branquiométrico

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de células de satélite a partir de músculos da cabeça branquiométrico de um rato 9 semanas de idade. Os músculos são originários de diferentes arco branquial. Subsequentemente, as células satélites são cultivadas em um revestimento local de tamanho milímetros para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a expansão e passagem em células de satélite.

Resumo

A fibrose e a regeneração muscular defeituosa podem dificultar a recuperação funcional dos músculos do palato mole após o reparo da fenda palatina. Isso causa problemas persistentes na fala, deglutição e sucção. Sistemas de cultura in vitro que permitem o estudo de células satélites (células-tronco miogênicas) dos músculos da cabeça são cruciais para o desenvolvimento de novas terapias baseadas na engenharia de tecidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia. Esses sistemas oferecerão novas perspectivas para o tratamento de pacientes com fissura palatina. Um protocolo para o isolamento, cultura e diferenciação de células satélites dos músculos da cabeça é apresentado. O isolamento é baseado na digestão enzimática e trituração para liberar as células satélites. Além disso, este protocolo compreende um método inovador usando revestimentos de gel de matriz extracelular de tamanho milimétrico, que requer apenas um baixo número de células satélites para ensaios de diferenciação.

Introdução

Cerca de 1: 500 a 1: 1.000 recém-nascidos apresentam uma fissura envolvendo o lábio e / ou palato (CLP); assim, esta é a malformação congênita mais comum em humanos ^uma. Os músculos do palato mole são essenciais para o funcionamento do palato mole durante a fala, deglutição e sucção. Se uma fenda do palato mole está presente, estes músculos são anormalmente inserido na extremidade posterior do osso palatino.

O palato mole move para cima e para baixo durante a fala, impedindo que o ar escape através do nariz. Crianças com uma fenda no palato não têm essa função de controle, resultando em um fenômeno conhecido como disfunção velofaríngea ^2,3. Embora os protocolos de tratamento são variáveis, a reparação cirúrgica do palato mole tem lugar na primeira infância (6-36 meses de idade) ^4. Os músculos anormalmente inseridos do palato mole pode ser corrigido cirurgicamente ^5-7, no entanto, disfunção velopharyngeal persistir em 7% a 30%dos pacientes ^2,3,8-10.

A capacidade do músculo esquelético para regenerar-se através da acção de células satélites (SCS) está bem estabelecida ^11,12. Após a lesão muscular, SCs são activados e migram para o local da lesão. Eles então proliferar, diferenciar, e se fundem para formar novas fibras musculares ou reparar danificado os ^13. Quiescentes SCs expressam o fator de transcrição Pax7 ^14,15, enquanto a sua progênie, os mioblastos proliferação, adicionalmente expressar o fator de determinação miogênica 1 (MyoD) ^16. Mioblastos diferenciadores começam a expressar miogenina (MyoG) ^17. A diferenciação terminal de mioblastos é marcada pela formação de miofibras, e a expressão de proteínas específicas de músculo, tais como cadeia pesada de miosina (MyHC) ^16,18.

Recentemente, várias estratégias têm sido utilizadas em medicina regenerativa para melhorar a regeneração do músculo dos músculos do membro ^19-23. Estudos específicos sobremúsculos da cabeça branquiométrico também são importantes, pois foi demonstrado recentemente que eles diferem de outros músculos em vários aspectos ^24. Em contraste com os músculos dos membros, tem sido sugerido que os músculos da cabeça branquiométrico contêm menos SCs ^25, regenerar mais lento, e tecido conjuntivo mais fibrosa é formada após a lesão ²⁶ Além disso, a proliferação de músculos SCs cabeça branquiométrico também expressar outros factores de transcrição. Por exemplo, Tcf21, um fator de transcrição para a formação muscular craniofacial é fortemente expresso na regeneração de músculos da cabeça, mas dificilmente na regeneração de músculos dos membros ^25. Os músculos do palato mole de pacientes CLP são geralmente menores e menos bem organizada em comparação com músculos palatinos normais ^27,28. Fibras lentas e rápidas estão presentes nos músculos do palato mole, mas as fibras lentas são mais abundantes. Em contraste, os músculos fissura contêm uma maior proporção de fibras rápidas e também uma fonte capilar reduzidaem comparação com os músculos do palato mole normais ^29-31. Fibras rápidas são mais propensas a contração induzida por lesão ^31-33. O pobre suprimento capilar de acompanhamento também pode promover a fibrose ^34,35. Todos estes aspectos podem contribuir para o mau regeneração dos músculos moles do palato após o fecho cirúrgico fenda ^36. Em vista disso, um protocolo para o isolamento e caracterização de músculo cabeça branquiométrico SCs é crucial. Isto proporciona a possibilidade de estudar a biologia dos músculos SC cabeça branquiométrico. Além disso, novas terapias com base em engenharia de tecidos podem ser desenvolvidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia em CRE e outras condições comprometedoras da área craniofacial.

Em geral, SCs pode ser obtido após dissociação do tecido muscular ^14. Picar, digestão enzimática e trituração geralmente são obrigados a liberar SCs de seu nicho. SCs pode ser purificado por meio de pré-plaqueamento em placas não revestidas ^14,37,38, fractionation em Percoll ^39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética ^41-43. Aqui nós apresentamos um novo protocolo econômico e rápido para o isolamento de células satélites de músculos da cabeça branquiométrico de ratos adultos jovens. Este protocolo baseia-se num manuscrito anterior ¹⁴ e especificamente adaptado para pequenas amostras de tecido. O isolamento de SCs de músculos representativos provenientes do 1 ^º, 2 ^º e 4 ^º arcos branquiais são descritos. Após o isolamento, baixo número de células satélites são cultivadas em gel matriz extracelular manchas de tamanho milímetro para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a necessidade para a expansão e passaging de SCs.

Protocolo

Todos os experimentos aqui descritos foram aprovados pelo Conselho local para Experimentação Animal da Radboud University Nijmegen, em conformidade com as leis e regulamentos (RU-dezembro 2013-205) Holandês.

1. Pontos de Matriz Extracelular gel

1. Execute os seguintes passos um dia antes do isolamento:
   1. Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (100 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir a 1:10 em meio de Eagle modificado por Dulbecco; com 4500 mg / L de glicose, 4 mM de L-glutamina, e 110 mg / ml de piruvato de sódio (DMEM). Manter o gel da matriz extracelular, a 4 ° C em todos os momentos. Nota: mudanças bruscas de temperatura irá resultar em revestimento irregular e formação de cristais.
   2. Manter a solução em gel de matriz extracelular diluído em gelo durante 15 min.
   3. Pré-descontrair uma micropipeta 20 l para 10 min.
   4. Coloque lâminas de câmaras de 8 poços para uma placa de Petri de 100 milímetros e transferir o prato sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min.
   5. Utilizar a micropipeta pré-arrefecido a colocar uma gota de 10 ul de gel de matriz extracelular em cada cavidade. Manter a placa de Petri sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A).
   6. Remover completamente o restante gel de matriz extracelular (Figura 1B), e secar os poços, a 37 ° C durante a noite.

2. Dissecção de Cabeça Músculos (músculo masseter, digástrico, e músculo levantador do véu palatino)

1. Antes de dissecção, preparar 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) suplementada com 2% de Penicilina-Estreptomicina (P / S). Manter em gelo.
2. Após a eutanásia de um rato adulto jovem (9 semanas) com CO ₂ / O _2, decapitar a cabeça e retire a pele da cabeça. Transferir a cabeça de PBS arrefecido em gelo suplementado com 2% de P / S em um tubo de 50 ml.
3. Músculo masseter (derivado do primeiro arco branquial)
   1. Coloque a cabeça com um lateral-se sobre uma almofada de silicone e corrigir com hipodérmica needles (Figura 2A).
   2. Identificar a glândula parótida e nervo facial (Figura 2A). Expor a fascia profunda cobrindo a glândula. Corte a fáscia e remover a glândula usando tesouras de dissecação. Identificar o conduto auditivo externo. Trace o nervo facial do forame estilomastóideo e retire cuidadosamente os ramos temporais, zigomáticos, e bucais com uma lâmina de bisturi n ° 15.
   3. Livre a cabeça superficial do músculo masseter, removendo a fáscia. Identificar cabeças tanto superficial e profunda do músculo masseter. Traçar a cabeça superficial até sua aponeurosis tendinosa grossa inserido no processo zigomático da maxila.
   4. Separa-se o tendão a partir da sua origem no processo de zigomática com uma pinça rectas. Cortá-la com uma lâmina de bisturi n º 15 ou tesouras de dissecação e cuidadosamente vida dele (Figura 2B).
   5. Dissecar a cabeça superficial do músculo masseter até sua inserção no ângulo e metade inferior de tele Superfície lateral do ramo da mandíbula com uma lâmina de bisturi n ° 15 (Figura 2C). Agora, remover completamente o músculo.
4. Ventre posterior do músculo digástrico (derivado do ^2º branquial arco)
   1. Coloque a cabeça em uma posição supina sobre a almofada de silicone e corrigir com agulhas hipodérmicas (Figura 3A).
   2. Retire a gordura subcutânea que recobre tanto sublingual e submandibular. Em seguida, remova a fáscia superficial e glândulas usando tesouras de dissecação. Expor o músculo digástrico (anterior e posterior da barriga).
   3. Segure o tendão anterior do ventre posterior com uma pinça reta, cortá-la, e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (Figura 3B). Fazer a mesma no lado contralateral.
5. Levator músculo do véu palatino (derivado do quarto arco branquial)
   1. Após a dissecção do ventre posterior do músculo digástrico, Localizar o músculo stylohyoid, puxe-o lateralmente e, cuidadosamente, remova-a (Figura 4A).
   2. Localize o tendão do músculo levantador do véu palatino que insere na bula timpânica (Figura 4A). Dissecá-lo com cuidado e corte-o em ambos os lados.
   3. Procure a traquéia eo esôfago que corre atrás dele. Levantar o esófago, e expor a faringe, laringe e o palato mole.
   4. Localize a área do palato mole, onde é inserido o levantador do véu palatino e cortá-lo solto (Figura 4B).
      Nota: Diretamente após a dissecação, remova cuidadosamente tendões e tecido conjuntivo de cada músculo sob o microscópio estéreo. Submerge todas as amostras rapidamente em etanol a 70%, e transferi-los para PBS arrefecido em gelo suplementado 2% de P / S em um tubo de 15 ml.

3. Isolamento de células satélites

1. Execute as seguintes etapas de preparação para SC isolamento a partir de 3 grupos de músculos:
   1. Prepare a 7,5 ml de 0,1% de pronase em DMEM. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 um. Pré-aquecer a solução a 37 ° C num banho de água durante 10 minutos antes do isolamento.
   2. Preparar 35 ml de DMEM suplementado com 10% de Soro de Cavalo (HS) e 1% de P / S. Também pré-aquecer a 37 ° C num banho de água.
   3. Preparar 15 ml de meio de cultura, que consiste em DMEM suplementado com 20% de soro fetal de bovino (FBS), 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha (CEE). Pré-aquecer a 37 ° C num banho de água.
   4. Pré-revestimento seis pipetas de plástico (10 ml) com HS e secas durante pelo menos 10 minutos antes da utilização.
2. Na capa de cultura, transferir cada músculo em um poço de uma placa de 6 poços. Usando as tesouras de dissecação, cortados do músculo em pedaços pequenos de cerca de 2 mm. Tenha cuidado para não picar o tecido muito.
3. Adiciona-se cuidadosamente 2,5 ml de solução de pronase a 0,1% a cada poço e incuba-se a 37 ° C durante 60 min. Agite ligeiramente a placa após 20, 40 e 60 min. Nota: O duratio exatan da incubação depende de fatores como idade e estirpe dos animais.
4. Monitorar sob o microscópio. Confira os fragmentos musculares e parar a digestão enzimática quando os feixes de fibras ter uma aparência solta (Figura 5).
5. Adicionar 2,5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Transferir para um tubo de 15 ml e centrifugar os tubos a 400 xg durante 5 min. Descartar o sobrenadante por decantação.
6. Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipetar a solução para cima e para baixo com uma pipeta de 10 ml em plástico (trituração) por pelo menos 20 vezes para homogeneizar o tecido.
7. Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 min. Recolhe-se o sobrenadante e transferir para um tubo de 15 ml.
8. Adicionar 5 ml de DMEM suplementado com 10% de HS e 1% de P / S. Pipeta de novo com uma pipeta de plástico de 10 mL até os fragmentos de tecido passa facilmente através da pipeta.
9. Centrifugar os tubos a 200 xg durante 4 minutos e recolher o sobrenadante num tubo de 15 ml.
10. Put um filtro de células (40 ^ M) para um tubo de 50 ml e transfere-se o sobrenadante contendo as células dissociadas sobre o filtro. Lavar com 1 ml DMEM para a recuperação das células máxima.
11. Centrifugar os tubos a 1000 x g durante 10 minutos e descarta-se o sobrenadante com uma pipeta.
12. Ressuspender o sedimento em 300 ul de meio de cultura e contar as células num hemocitómetro.

4. A diferenciação das células satélites em Spots de Matriz Extracelular Tapetes

1. Dilui-se a suspensão de células para se obter 1,5 x 10 ³ células em 10 ul de meio de cultura.
2. Fixe as tampas das câmaras de slides com fita e marcar os pontos com um marcador preto no lado inferior do vidro objeto.
3. Usando uma micropipeta, coloque uma gota de suspensão de células 10 ul para o ponto gel matriz extracelular. Verificar se ao microscópio a gota da suspensão de células foi colocada correctamente no local. Incubar durante seis horas a 37 ° C.
4. Cuidadosoly adicionar 400 uL de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S a 1% e CEE) e incuba-se durante três dias a 37 ° C.
   Nota: Neste ponto, recentemente isoladas SC são submetidos a um trauma severo (digestão enzimática e trituração dura) e que eles precisam para se recuperar. Não perturbar as células durante os primeiros três dias 37. A seguir, o meio de cultura pode ser alterada dependendo do tipo de experiência.
   Os pontos de gel da matriz extracelular podem ser semeadas com uma densidade celular elevada (1,5-2,5 x 10 ^3/20 l) para o ensaio de diferenciação. O meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) pode ser substituído a cada três dias.
5. Alternativamente, se a expansão ea passagem é desejada seguir os seguintes passos:
   1. Descongelar uma aliquota extracelular matriz de gel (500 mL) a 4 ° C durante pelo menos 1,5 h. Diluir 1:10 em DMEM e siga as recomendações no ponto 1.1.1.
   2. Pré-arrefecer uma pipeta de 10 mL durante 10 min a 4 &# 176; C.
   3. Transferir três frascos T75 sobre uma superfície fria (por exemplo, um pacote de congelador) durante 10 min.
   4. Use a pipeta pré-refrigerados para colocar 1 ml de gel de matriz extracelular em cada frasco. Verifique se a superfície é coberta completamente. Manter os frascos sobre a superfície fria durante pelo menos uma outra de 7 min (Figura 1A).
   5. Remover completamente o gel matriz extracelular restante com uma pipeta de 10 ml, e secar os poços, a 37 ° C durante 1 h.
   6. Após a contagem, ressuspender as SCs isolados de fresco em 10 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / S e 1% de extracto de embrião de galinha) e as sementes em frascos T75 pré-revestidos.
   7. Depois de três dias, alterar a forma (e cada terceiro dia) até 80% de confluência é atingido. Para passaging, lavar os frascos T75 três vezes com PBS. Em seguida adicionar 1 ml de solução de tripsina a 0,25% e incubar durante três minutos a 37 ° C. Ressuspender em 9 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com FBS a 20%, 10% HS, 1% de P / Se 1% de extracto de embrião de galinha) e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Desprezar o sobrenadante. Após a contagem, ressuspender 1 x 10 ⁶ células em 1000 uL de meio de cultura e congelar as células.

Resultados

Usando este protocolo, o músculo masseter (um lado) produz 0,8-1 x 10 ⁶ células, o músculo digástrico (barriga posterior) produz 1,5-2 x 10 ⁵ células, e levator veli rendimentos musculares palatini 1-1,5 x 10 ⁵ células. Rendimentos celulares dependem do tipo muscular, estirpe e idade do animal. Para a comparação entre os três grupos musculares, SCs isolados de fresco foram semeadas à mesma densidade de células (1,5 x 10 ^3/10 ul). Imediatamente após o isolamento, mais de 90% das células recentemente isoladas expressam Pax7 (Figura 6).

Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7, MyoD, MyoG e MyHC immunostaining. Cinco campos arbitrários foram contadas por cultura usando uma objetiva de 20X. No dia 4 Pax 7 e Myo D é expresso em todos os grupos musculares (Figuras 6 e 7 e 8), porém a descendência de SatCs do masseter e os músculos digástrico começar exprescante miogenina mais cedo do que o músculo levantador do véu palatino (Figura 9). No dia 10, a expressão de MyoG é fortemente reduzida em todos os grupos (Figura 9). Alguns dias após a semeadura das manchas do gel matriz extracelular, as células em proliferação começar a fundir e formar miotubos multi-nucleadas, que expressam miosina de cadeia pesada. Pequenas miotubos são claramente visíveis no dia 7 (Figura 10). No dia 10, espasmos dos myotubes pode ser observada (Video 1).

Figura 1:. Manchas extracelulares da matriz de gel em uma lâmina de câmara (A) Para a manipulação fácil, colocar a corrediça câmara de 8 poços para uma placa de Petri 100 milímetros. Pipeta 10 ul gel matriz extracelular em cada câmara e coloque-o sobre uma superfície fria (7 min). (B) Câmara slide após o excesso de matriz extracelular gel é removido.

Figura 2:. Dissecção do músculo masseter (A) Cabeça do animal em uma visão lateral. Orelha (E), a glândula parótida (P) e do nervo facial (VII). (B) tendíneas aponeurosis (Te) da cabeça superficial do músculo masseter (Ms) e do músculo temporal (T). Separa-se a sua inserção a partir de tendão com um fórceps. (C) dissecar cuidadosamente o músculo até sua inserção no ramo da mandíbula. E: orelha, P: glândula parótida, VII: nervo facial, T: músculo temporal, Ms: cabeça superficial do músculo masseter, Te: tendão, Mp: cabeça profunda do músculo masseter.

Figura 3: Dissecção do ventre posterior do músculo digástrico (.A) Cabeça do animal em decúbito dorsal. Localizar a glândula submandibular (SG), músculo masseter (M), nervo facial (VII) e músculo esternocleidomastóideo (SCM). Remover a glândula submandibular. (B) Localize o anterior digástrico muscular (AD) e ventre posterior (DP). Com uma pinça reta, tomar o tendão anterior do ventre posterior, cortá-lo e dissecá-lo cuidadosamente até sua origem na bula timpânica (ty). E: orelha, Sg: glândula submandibular, VII: nervo facial, M: músculo masseter, SMC: esternocleidomastoideu, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, Ty: bula timpânica.

Figura 4:. Dissecção do músculo elevador do véu palatino (A) Vista geral após a dissecação do músculo digástrico (ventre posterior). Músculo stylohyoid (St) e tendão do músculo levantadorvéu palatino pode ser localizada. Nota da traquéia (T) e esôfago (Es) correndo atrás dele. (B) Depois de levantar a traqueia e o esófago da faringe (P) fica exposto. A inserção do músculo levantador do véu palatino no palato mole é agora visível. A seta indica o palato mole dissecados com os músculos palatino levator Veli em ambos os lados. E: orelha, St: músculo stylohyoid, VII: nervo facial, M: músculo masseter, AD: barriga músculo digástrico anterior, PD: músculo digástrico ventre posterior, T: traqueia, Es: esôfago, P: faringe, * levator músculo do véu palatino .

Figura 5: Aparência do tecido muscular (A) antes e (B), após a digestão enzimática com pronase. Note-se que feixes musculares parecem ser solta após a digestão enzimática.

Figura 6: 7 Pax imunocoloração SCs recentemente isoladas, aplicado a gel de matriz extracelular no final do isolamento (cerca de 6 horas após a digestão inicial do tecido).. Cinco campos arbitrárias foram contadas utilizando uma objectiva de 10x com uma média de 210 células por campo. Aproximadamente 90% das células são positivas Pax 7. DAPI: azul, Pax7: vermelho. Barra de escala, 100 mm.

Figura 7:. Pax 7, MyoD immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. (A - C) e (D - F) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 a partir de culturas do músculo masséter. (L e H + e MyoD ⁺ núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). DAPI: azul, Pax7: vermelho, e MyoD: verde. Escalas bar, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8:. Distribuição de Pax7 ± / ± MyoD em culturas de células mononucleares nas culturas a partir do músculo masseter palatina, digástrico e levator veli (A - C) Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Pax7 e MyoD immunostaining. O número total de células é baseada na do número total de núcleos (DAPI). (D) quantificação de dados de Pax7 ± / ± cel MyoDls. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9:. Immunostaining Miogenina Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra Miogenina. (A - D) fotomicrografias representativas dos dias 4 e 7 culturas do músculo levantador do véu palatino. (E) O número de MyoG ⁺ núcleos por campo microscópico, foi contado e expresso como uma percentagem do número total de núcleos (DAPI). Quantificação (F) Dados de células MyoG +. DAPI: azul, Miogenina: verde. Escalas bar, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figure.

Figura 10:. Myosin Cadeia Pesada immunostaining Dia 4, 7 e 10 culturas foram coradas com anticorpos contra a cadeia pesada de miosina (MyHC). Fotomicrografias representativas dos dias 4, 7 e 10 culturas do músculo digástrico (DIG). No dia 7, as pequenas myotubes estão presentes, enquanto no dia 10 myotubes longas e bem organizados são evidentes. Escalas bar, 200 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1:.. Miotubo contraindo Exemplos de dois campos representativos com myotubes contraindo são mostrados para o dia 10 culturas de músculo digástrico Por favor clique aqui para ver este vídeo.

Discussão

SCs de diferentes músculos da cabeça branquiométrico foram isolados a partir de um de 9 semanas de idade de ratos Wistar e cultivadas directamente em manchas de gel de matriz extracelular sem a expansão e passagem em antes. Após o isolamento, as células foram contadas e semeadas à mesma densidade celular. Para o isolamento paralela de três músculos diferentes, este método leva cerca de 4 horas. Para evitar a contaminação da cultura, um passo crítico é a rápida lavagem em álcool a 70% após a dissecação dos músculos.

Durante SC isolamento é importante para cortar o tecido muscular em pequenos pedaços (cerca de 2 mm), mas evitar o excesso de picagem pois isso irá resultar num rendimento de célula pequena por causa de danos celulares. Além disso, a duração da digestão enzimática deve ser verificado cuidadosamente sob o microscópio para evitar mais danos. O objectivo da digestão é de dissociar as miofibras. Uma vez que mais de 90% das células isoladas expressam Pax7, não é necessária mais purificação (Figuras 6-8).Isto evita passos de purificação adicionais em outros métodos, tais como pré-plaqueamento em placas não revestidas ^14,37,38, fraccionamento em Percoll ^39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética ^41,43. Por trituração é essencial induzir cisalhamento entre os fragmentos de tecido e a abertura da ponta da pipeta como este permite que a libertação mecânica do SC. Se a trituração com uma pipeta 10 ml (dentro de ponta diâmetro: 1 mm), é difícil, de 5 ml (dentro ponta diâmetro: 2 mm) pipeta pode ser utilizada pela primeira vez. Alternativamente, pipetas de Pasteur de vidro pode ser cortado no diâmetro desejado e ser utilizado. Este método é simples, eficiente e permite o isolamento em simultâneo de SC a partir de diferentes amostras do músculo.

As placas de cultura para SCS também pode ser revestida com gelatina ou colagénio, mas os nossos estudos anteriores mostram que o gel de matriz extracelular é muito melhor para a manutenção do potencial miogénica de colagénio ^38. As manchas extracelulares da matriz de geltamanho milímetros (10 ul / S de 2 mm ou 20 ul de E / S 4 mm) permite o estudo da proliferação e diferenciação de SCS com um número limitado de células. Para o ensaio de diferenciação de cerca de 8 a 20 vezes menos células são necessários em comparação com uma placa de 24 poços (Ø 15,6 milímetros), e cerca de 80 a 200 vezes menos comparado até 35 mm pratos Petri (Ø 35 mm) ^14,38.

Desde gel de matriz extracelular é caro, este método também é mais eficiente em termos de custos. Além disso, as lâminas de câmara pode ser substituído por cobertura de plástico desliza para reduzir ainda mais os custos. Para a preparação do gel matriz extracelular acaba de secagem durante a noite das lâminas de câmaras é essencial. À medida que as manchas de gel de matriz extracelulares são transparentes, é necessário marcar os pontos no lado inferior utilizando iluminação traseira. As câmaras de slides são fixados em uma placa de Petri para a manipulação fácil. A expansão adicional de cultura de células não é necessário, o que oferece a possibilidade de estudar o SCs de smalLER músculos ou amostras musculares pequenos. Alternativamente, por exemplo, para PCR ou músculo constrói se são necessários mais células, as SCs de isolados de fresco pode ser primeiro expandida em frascos T75, tal como indicado acima.

SCs isolado utilizando este protocolo, não são adequados para a purificação adicional com a citometria de fluxo imediatamente após o isolamento. A digestão com pronase provoca extensa digestão de antigénios da superfície ^14. De soro de cavalo e soro fetal bovino que são utilizados para a cultura de células tem de primeiro ser adequadamente caracterizados, antes do isolamento, como diferentes números de lote diferencialmente afectada mioblastos proliferação e diferenciação.

Nos últimos anos, há um crescente interesse nos músculos derivados dos arcos branquiais e da mesoderme da cabeça (por exemplo, os músculos extra-oculares) ^24. Tem sido claramente demonstrado que músculos da cabeça e dos membros possuem propriedades altamente diferentes. Músculo masséter de animais velhos parece retain sua capacidade regenerativa, em comparação com os músculos dos membros ^25,26. SCs dos músculos extra-oculares possuem uma robusta capacidade de proliferação e diferenciação comparável ao SCs de músculos da cabeça, e mostrar um potencial maior do que o enxerto muscular de membros SCs ^24.

A composição de distribuição do tipo de fibra e miosina varia entre os grupos musculares e também entre as espécies. Músculos originários a partir do primeiro arco branquial em humanos contêm fibras tanto lentas e rápidas (IIA e IIX subtipos), myosins neonatais e myosins típicos para o desenvolvimento de músculo cardíaco. Em roedores estes músculos contêm cerca de 95% IIA fibras rápidas miosina e IIb) ^44-46. Estudos sobre os músculos aviário mostram que a SCS a partir de diferentes tipos de fibras musculares variar em capacidade de diferenciação. SCs de fibras rápidas única diferenciar em fibras musculares rápidas, enquanto SCs de fibras lentas podem se diferenciar em ambos os tipos de fibras ^47. Além disso, a percentagem de CT no músculo rápidofibras é menor do que na fibras musculares lentas ^48,49. Isto indica que a distribuição do tipo de fibra deve ser tida em conta para os estudos sobre os músculos na área craniofacial. Similar aos músculos fenda palatina, o LVP em roedores contém quase exclusivamente fibras rápidas ^50. Por essa razão, SCs da LVP são adequados para estudos pré-clínicos no campo da fenda palatina.

Este protocolo oferece novas possibilidades para estudar SCs derivadas de músculos da cabeça branquiométrico ou outros músculos menores ou amostras de músculos menores. Isto irá facilitar o desenvolvimento de novas terapias para melhorar a regeneração dos músculos da região maxilofacial em condições tais como fenda palatina mas também em outras condições que afectam os músculos menores.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulha Hipodérmica 25  G 0,5  x  25  m	BD Microlance	300400
Tesoura de dissecação	Braun	BC154R
Micro fórceps reta	Braun	BD330R
Lâmina de bisturi cirúrgico Nº.  15	Swann-Morton	0205
Álcool 70%	Denteck	2,010,005
Permanox Slide, 8 Câmaras	Thermo Scientific	177445
Placa de cultura de células de 6 poços	Greiner bio-one	657160
Placas de cultura de células (100 x 20 mm)	Greiner bio-one	664160
Tubo de centrífuga cônico estéril de 15 ml	BD Biosciences	352097
tubo de centrífuga cônico estéril de 50 ml	BD Biosciences	352098
Cell strainer (40 μ m)	Gibco	431750
Pipeta sorológica de 10 ml	Greiner bio-one	607180
20  µ l FT20	Greiner bio-one	774288
Matrigel, Livre de Fenol-Vermelho	BD Biosciences	356237	10 ml
Pronase	Calbiochem	53702	10  KU
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	500 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium, alta glicose, Suplemento GlutaMAX, piruvato	Gibco	10569-010	500 ml
Soro Fetal Bovino	Fisher Scientific	3600511	500 ml
de soro de cavalo	Gibco	26050088	500 ml
de penicilina-estreptomicina (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	100 ml
de extrato de embrião de galinha	MP Biomedicals	2850145	20 ml