Abstract
アルツハイマー病は、高齢化に影響を与える神経変性疾患です。疾患の重要な神経病理学的特徴は、アミロイドβの過剰産生と罹患個体の脳領域におけるアミロイドβ斑の沈着です。年間を通して、科学者は、アミロイドベータ病理を複製しようとする多数のアルツハイマー病のマウスモデルを生成しました。残念ながら、マウスモデルは、選択的に、疾患の特徴を模倣します。神経細胞死、アルツハイマー病患者の脳における顕著な効果は、顕著に、これらのマウスに欠けています。ニューロンに最も毒性であることが証明されているアミロイドβの形 - - 定位脳へしたがって、私たちと他の人が直接アミロイドβの可溶性オリゴマー種を注入する方法を採用しています。このレポートでは、選択脳領域におけるアミロイドベータレベルを増加させるこの手術法を文書化するために雄のC57BL / 6Jマウスを利用しています。ザ注入ターゲットは、コリン作動性回路によって接続されている前脳基底部と一緒に、この脳の構造ため、海馬の歯状回である疾患における変性の領域のいずれかを表します。細胞死における同時増加とブロカの対角バンドの垂直肢におけるコリン作動性ニューロンの損失がある間定位注入を介して歯状回におけるアミロイドβの上昇の結果は、1週間以内に歯状回におけるニューロン損失の増加を明らかに前脳基底部の。これらの効果は、2週間まで観察されます。我々のデータは、現在のアミロイドβ注入モデルは、短期的に特定の領域のニューロン死に対処するための代替的なマウスモデルを提供することを示唆しています。このモデルの利点は、アミロイドベータが、空間的および時間的な方法で上昇させることができるということです。
Introduction
アミロイドβ（Aβ1-42）で構成されているアミロイド斑沈着は、アルツハイマー病（AD）の病理の重要な特徴です。多くの研究は、組換えオリゴマーAβ1-42の高いまたは毒性レベルが神経細胞死、シナプスジストロフィー、損失および機能障害を誘発することが示されています。ならびに学習および記憶の欠損1-4。影響を受けた脳領域は、海馬、皮質、及び前脳基底核と扁桃体の5,6のような皮質下構造を含みます。これまで、ADのAβ1-42病状をシミュレートしようとする多数のトランスジェニックマウスモデルが存在します。歪みに応じてこれらの動物は、ADの病理学的特徴の選択を検討するのに有用であることが判明しています。残念ながら、2トランスジェニックライン、APP23および5XFADを除いて、これらのマウスは完全にニューロン損失、ADの重要な側面を複製することはありません。でもAPP23と5XFAD、神経細胞死のobserで観察された神経細胞の損失でVEDは、微妙な年齢依存し、いくつかの選択領域7,8に単離しました。
野生型マウスの脳へのオリゴマーAβ1-42の直接注入はamyloidopathy 1,9,10の神経細胞死の側面を複製インビボモデルに優れたを提供します。一般的に利用するトランスジェニックマウスモデルとは異なり、オリゴマーAβ1-42注入モデルは、急性空間的、時間的な方法でAβ1-42のレベルを上昇させるのに最適です。このモデルのために、野生型マウスを使用する利点は、トランスジェニックマウスの系統に導入された変異の潜在的な補償または副作用がなくなります。過去の研究では、海馬に、Aβ1-42の毒性レベルを注入すると、1週間以内に1注射部位の近傍で神経細胞死を誘発することが示されています。また、Aβ1-42は、コリン作動性ニューロン11前脳基底部に毒性の観察と一致していること海馬に突出コリン作動性ニューロン（BFCN）集団は、効果的に脳内の孤立した神経回路の検査を可能にする、マウスにおけるβアミロイド注入1,10以下の7〜14日以内に20〜50％に減少します。大部分の制御/車両とオリゴマーAβ1-42溶液のための海馬12の歯状回に同側BFCNプロジェクトので比較は左右の半球1の間で行うことを可能にする脳のいずれかの側に注入することができます。
この報告では、成人の野生型C57BL / 6Jマウスの詳細な外科的および注射の方法論を提供します。このマウス株があるため、研究での広範な使用を選択されています。技術的には、いずれかの脳の領域は、しかし、ここで私たちは技術を説明するために、ターゲットとして、海馬の歯状回を使用し、注入のために標的とすることができます。
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Protocol
注：すべての動物実験では、実験動物の管理と使用のための制度や国のガイドラインに従いました。
1.外科手術器具およびソリューションの準備
- すべてのステンレス鋼の外科手術用器具をオートクレーブ。
- 無菌の分子等級脱イオン蒸留水で200プルーフ無水エタノールを希釈することにより、70％エタノールを調製します。
- ハミルトンシリンジに29 G針を取り付けます。汲み上げ、1分間繰り返しナノ純水を噴射してハミルトン注射器と針の内部を清掃してください。 70％エタノールで、この手順を繰り返します。
- ハミルトンシリンジからプランジャーと針を外します。空気は、層流フードO / Nで部品を乾燥させます。
- 使用前に、30分間紫外線を針及び注射器を照射します。
- 0.9％の体積濃度を最終重量に分子グレードの水に塩化ナトリウムを溶解して生理食塩水を調製します。 Sterili0.2μmの細孔のフィルターを通してそれをフィルタリングすることによってソリューションをぜ。
2.オリゴマーAβ1-42の準備
- FA」など13の出版物に記載されているように単量体化とは、正確に5 mMのDMSO中で組換えヒトAβ1-42を再懸濁します。
- 手術前日に100μMの滅菌（1×）、PBSで5 mMのAβ1-42を希釈します。
- 粉砕してよく、溶液を混ぜます。
- 4℃で12時間、Aβ1-42溶液をインキュベートします。
注：このようなPBS中にDMSOを希釈またはスクランブルなどのコントロール·ソリューションは、/Aβ1-42ペプチドは、Aβ1-42と同じように準備する必要があります逆にします。
3.注入座標を決定
- 正確な前後（AP）、内側-外側（ML）を決定するために、成体マウスの脳アトラスを使用し、背腹（DV）は、関心14の脳領域の座標。
いいえTE：私たちはブレグマから次の座標で対象と海馬の歯状回を選んだ技術説明するために：AP、-2.00ミリメートル。 MLは、1.3ミリメートルを±します。 DV、-2.2 mmです。 AP値の前に負の符号は、ブレグマの2.00ミリメートルの後方であることを示しています。 ML値を先行±符号は、中心から左右の方向を示しています。最後に、DVの前に負の符号は、それが脳の表面から腹側に移動していることを示します。
4.定位フレームの設定
- 外科用フェイスマスク、きれいな白衣、および無菌手術用手袋を着用してください。
- 定位固定装置、70％エタノールでマウスアダプタを拭います。
- カウンターの上に滅菌外科用ドレープを下にして置きます。
- 滅菌外科用ドレープの上にマウス·アダプタとの定位固定装置を配置します。
- 70％エタノールでマウスの加熱パッドを拭きます。定位フレームのベッドの上に加熱パッドを配置します。汎用laboraを使用しますマウスアダプタベッドの上に加熱パッドダウンテープに保守党表示用テープ。
- 製造業者の指示に従って温水再循環ポンプに加熱パッドを取り付けます。
- 温水再循環ポンプの電源を入れ、37℃に温度を設定し、それが温度に達するまで待ちます。
- 製造業者の指示に従って、電動垂直注入軸にそれをねじ込むことにより、定位フレーム上に29 G針で50μlのハミルトンシリンジを貼り付けます。
- ビーズ滅菌器の電源を入れ、メーカーの設定温度に達するまで待ちます。
注：これは、動物間のステンレス鋼器具を滅菌するために使用されます。これは、楽器を殺菌するためのビーズとの接触の20秒かかります。 - ホットプレートの電源を入れ、42℃に設定し、上にきれいな空のケージを置きます。
- ハミルトンシリンジを定位フレームに固定されているが、電動定位のIを使用njectorAβ1-42溶液を描画します。
注意：シリンジに溶液を4つ以上μLを描画し、その後、注入量を設定するために定位注射器を使用しています。製造元の指示に係る注射器を操作してください。
5.動物の準備
- 重量計を用いてマウスの重量を決定します。
- 腹腔内（IP）を注入することにより、100 mgの/ kgのケタミンおよび10mg / kgのキシラジンでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。つま先ピンチ反射の消失によって麻酔深度を監視します。
- マウスが鎮静された後にバリカンを取ると頭蓋骨上の皮膚を露出させるためにその頭を剃ります。
- 定位ベッドの上に加熱パッドの上にマウスを置きます。
- 口を開いて、歯のガードの内側切歯を配置するために、スパチュラを使用します。マウスの顔にノーズピースを固定します。静かに、あまりにもタイトではない、それを取り締まります。
- ポジ頭を保護するために外耳道に二国間の耳のクロスバーをTION。それは頭蓋骨に当たるまでの各クロスバーを移動し、それをロックするネジを回します。
- 頭がそっと頭を下にプッシュする人差し指を使用し固定されていることを確認します。ヘッドが適切に固定されている場合はそれが出て与えることはありませんか押すと移動します。
- 湿ったそれらを保つために、目にアイクリームまたは点眼の低下を適用します。目は、外科的処置を通して湿っていることを確認してください。
- 手術部位を消毒するには、70％エタノール、続いて頭蓋骨を覆う皮膚にベータダイン液を、適用するために滅菌綿棒を使用しています。 2回以上清掃交流ベタジンおよび70％エタノールを実行します。
6.手術と輸液
- 頭皮の正中線2-3ミリの切開を作るためにメスを使用してから、頭蓋骨、ランドマークの矢状縫合、ブレグマとラムダを露出させるために1.0〜1.5センチメートルに切開線を拡張するためにまっすぐ細かいハサミを使用します定位座標が基づいているの。離れて肌を保つために、マイクロクランプを使用してください。
注：ブレグマとラムダ位置はマウスの脳アトラス」定位座標でマウス脳"14で説明されています。 - 、綿棒を取り、滅菌生理食塩水でそれを浸して、頭蓋骨をきれいにするためにそれを使用。その後、頭蓋骨を乾燥させるためにきれいな乾いた綿棒を使用しています。
- ブレグマにドットをマークするために、滅菌細かい点のペンを使用してください。針の先端がちょうどブレグマ上のドットに接触するようにハミルトンシリンジを配置するために、定位マイクロマニピュレーターを使用してください。
- 座標DVを記録します。
- 針の先端は、ラムダ点に接触するように頭蓋骨のAP軸がレベルであるかどうかを確認するには、後方にハミルトンシリンジを移動します。
- DVの位置を記録します。 0.5ミリメートルの範囲内であるDVはブレグマとラムダの座標を確認してください。
注：目標は、ブレグマとラムダの間のDV差を最小にすることです。
- mを使用しますicromanipulatorはブレグマドットに戻るハミルトン注射針の先端を返します。
- 開始APの位置を記録します。
- 出発APから2.00ミリメートルの座標を減算して終了APの位置を計算します。
- 座標最終APにハミルトンシリンジの針の位置を変更するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。
- 現在のML座標記録します。
- 左側を計算し、右MLを終了すると、座標ML開始から1.3ミリメートルを加算または減算することによって調整します。
- 終了ML座標のいずれかにハミルトンシリンジ針を移動させるためにマイクロマニピュレーターを使用してください。
- 両方の終了ML座標上の頭蓋骨の表面に針先をタッチし、DVの座標を記録し、値が0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。
注：目標は、2つの終了ML座標間のDV差を最小にすることです。 - 終了時に頭蓋骨の上に0.5〜1センチメートルまで針を引っ張る座標間。目にドットをマークするために、滅菌細かい点ペンを取ります頭蓋骨のE面。頭蓋骨の反対側にこの手順を繰り返します。
- 両方の終了ML座標上の頭蓋骨の表面に針先をタッチし、DVの座標を記録し、値が0.5ミリメートルの範囲内であることを確認してください。
- 邪魔にならないように明確なハミルトンシリンジをスイング。
- ドリルに0.8ミリメートルのドリルヘッドを取り付けます。 、両手でドリルを取る安定性のためにテーブルの表面上に肘を設定し、わずかに左または右ML座標のいずれかでシャーピードットの上にドリルヘッドを配置します。ドリルをアクティブにし、頭蓋骨に穴を導入するために頭蓋骨の表面にドリル先端を下げます。反対側に、この手順を繰り返します。
注：一部の出血が新たに導入された孔から発生することがあります。そこ出血している場合は、血液を軽くするため、クリーン乾いた綿棒を使用しています。 - 新たに導入されたML穴のいずれかを介して元の位置に戻しハミルトンシリンジを移動します。ちょうど頭蓋骨を過ぎハミルトン針を下げます。この時点で脳を穿刺しないように注意してください。確認するために針がシュール頭蓋骨が人差し指を取り、静かにするために頭蓋骨に対して針を押して通過しました電子針は穴を終了しません。
- 出発DV座標を記録します。
- 終了DVが開始座標DVから2.2ミリメートルを減算することにより座標を計算します。
- 座標ダウン終了DVに針を下ろします。
- 0.5μL/分の速度で歯状回にAβ1-42の4μLをポンピングする定位噴射ポンプをアクティブにします。
- 注入が完了すると、針が注入部位から溶液の逆流を最小限に抑えるために追加の1分間の場所に留まるう。
- 脳の反対側に針を移動し、ステップ6.13から6.18を繰り返します。
7.動物の取り外しおよび術後ケア
- 耳のバーや顔/鼻ガードを外します。装置からマウスを外します。
- 頭皮を閉じて、縫合糸で傷をシールプルする学生標準パターン鉗子を使用してください。
- 水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。
- で痛みを緩和するジェクトブプレノルフィン（0.1 mgの/ kg）を皮下に投与することができます。
- それが起きるまで、42℃のホットプレートの上に設定し、クリーン空のケージにマウスを維持し、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。
- 皮下注射を介して痛みの軽減のために3日間の12時間毎にブプレノルフィンを投与します。
8.抜糸
- IPによっては100mg / kgのケタミンおよび10mg / kgのxlyazineでケタミン/キシラジンのカクテルで、マウスを麻酔。注：これは、7〜10日、手術後に行われます。
- 縫合糸を除去するために、学生の標準パターン鉗子とストレート細かいハサミを使用してください。
- 水分補給のためのIPを介してマウスに滅菌生理食塩水の1ミリリットルを注入します。
- それが起きるまで、42℃のホットプレートの上にきれいな空のケージセットでマウスを維持し、その後、十分な食料と水をそのハウジングケージに戻します。
9.動物の犠牲と組織処理
- マウスとpを麻酔、4％パラホルムアルデヒド15でそれをerfuse脳を除去し、16を凍結切片のためにそれを処理します。
注：動物の犠牲のタイミングは、実験者に依存します。しかし、私たちの研究のために、私たちは7日及び14日に手術を投稿しました。
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Representative Results
ヒト組換えオリゴマーAβ1-42の調製本発明の方法は、モノマー、ダイマー、トリマー、およびテトラマー（ 図1A）からなる可溶性オリゴマー種をもたらします。これらの低分子量のAβ1-42の種ではなく、原線維およびプラークは、ニューロン1,4,9,17-19に最も毒性であることが、多数の設定で示されています。オリゴマーAβ1-42は、マウスの脳内の神経細胞死を誘導するかどうかを確認するには、Aβ1-42（100μMストック溶液4μl）を9ヶ月齢の野生型C57BLの1半球に海馬のDGに注入しました/ 6Jマウス。 C57BL / 6Jための海馬の重量は、約0.018グラムであると推定され、従って、Aβ1-42の送達は、約100μgの/ gであったれます。 Aβ1-溶解に使用されるDMSOの等量のから成って-同じマウス脳の反対側のDGは、制御/媒体溶液を注入しました42（1×）をPBSで希釈した-比較のために。上述したように、以前にスクランブルか、我々が以前に海馬神経細胞1には影響は認められなかったことから、Aβ1-42ペプチドは比較のためのコントロールとして使用することができる逆。脳への針の導入は局所的な組織の損傷（ 図1B）を作成し、我々はポスト噴射を実行することを選択した最終的なDGの崩壊を引き起こしたように組織が まだ無傷である噴射管に隣接して分析します。 Aβ1-42注射の1週間以内にDGは分子層と注射部位（ 図2A）付近の多形細胞層で上昇したAβ1-42レベルを示しました。 7および14日目に、Aβ1-42のTUNEL陽性染色の増加を誘発し、Aβ1-42（ 図2B）の神経変性効果を確認、DGの厚さが減少します。
BFのコリン作動性ニューロンは、DGに突出するのでDGにおけるニューロン損失はBF変性をトリガーする場合は海馬の我々は次の決定しました。この研究のために逆行性トレーサーフルオロゴールド（2％懸濁液）はDGへのAβ1-42と一緒に同時注入しました。射出フルオロゴールド以下の7日は、コリン作動性ニューロンを介してラベルの逆行性輸送を示唆しているBF（ 図2C）で検出されました。これは神経細胞の端末はDGでAβ1-42にさらされたことを示しているためそのため、BFにおける定量化のために、我々はフルオロゴールド陽性ニューロンを選択しました。 DGAβ1-42注入後の両方の1と2週間目に、対角バンドの核-コリン作動性ニューロンは、DGに突出BFの小領域- Aβ1-42 -injectedサイトへの同側は、TUNEL染色の増加を示しましたとコリン作動性ニューロン（ 図2D）に減少しています。 BFで観察されたニューロンの損失は、破壊をリンク過去の研究を確認し、BF-海馬経路1,10へのAβ1-42の影響。なお、制御/車両溶液をDGに注入した対角バンドの核の側に1週間の時点まで2週間の時点の比較からTUNEL染色の更なる増加があったことに留意することも重要であり、コリン作動性ニューロン（ 図2D、テーブル）に減少します。これらの結果は、針に起因する物理的な外傷がに寄与することを示唆し、GCLの厚さと2噴射後の時点とを比較車両注入側のDGでのTUNEL陽性標識（ 図2B、テーブル）の増加の有意な減少を反映して時間の経過とともに変性。でも針のこの望ましくない副作用で、Aβ1-42の神経変性作用は、まだコントロール/ビヒクル溶液（ 図2D）のものよりも著しく大きいです。総合すると、現在の輸液モデルeffectivelyは短期Aβ1-42の刺激を研究するには、この魅力的なモデルを作る7日以内に、マウスの脳内のAβ1-42の毒性作用を再現します。
図1.オリゴマーAβ1-42調製およびマウス脳注入管の可視化。（A）2μMオリゴマーAβ1-42は 10〜20％トリシンゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上に移しました。膜は、Aβ1-42抗体6E10（：1,000 1）を用いてブロットしました。 （B）Aβ1-42（100μM溶液4μL）またはコントロール/車両は9カ月齢のC57BL / 6Jマウスの、それぞれ、海馬の左右のDGに注入しました。マウスは、7日間生存しました。脳を直列部当たり20ミクロンで切断しました。海馬切片をDAPI染色しました。ハッシュマークが描写します噴射管。矢印は折りたたまDGを示します。スケールバーは200μmで表す。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2.オリゴマーAβ1-42 DGとBFにおける神経細胞死を誘導する。コントロール/車両またはAβ1-42（100μM溶液4μl）を9のそれぞれ海馬の左右のDGに注入しました月齢のC57BL / 6Jマウス。マウスは、いずれかの7または14日間生存しました。脳を直列部当たり20ミクロンで切断しました。 （A）7日は、Aβ1-42（2,000 NU4抗体、1）について染色した注射海馬のセクションを投稿してください。 ML、分子層; GCL、神経節細胞層。 PCL、多形細胞層。スケールバーは50μmで表します。 （B ）（C）車両またはAβ1-42は、フルオロゴールド（2％溶液）と同時注射しました。フルオロゴールド標識はBF 7日注射後に決定しました。 BFを含むスライドを、無作為に選択しました。フルオロゴールド標識は、関心領域を決定しました。関心領域を同定した後、隣接する脳切片は、目的のマーカーを染色するために使用しました。挿入図は、（D）の画像が選択された領域です。スケールバーは200μmで表します。 （：100、ヤギポリクローナル1）またはTUNEL（D）7または14日は、チャットのために染色噴射BFセクションを投稿してください。 *** P <0.001 1週間に比べて。 * P <0.05の車両に比べて。定量化は、地域全体で行われました興味のあります。内側中隔と角帯の境界は前交連の位置に基づいて描かれています。スケールバーは100μmで表します。 （N = 5マウス）。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
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Discussion
成功したAβ1-42注入を達成するために、実験者または外科医は、必要があります：1）無菌技術を使用します。 2）正しく、正確な座標を持つ対象の脳領域を特定します。 3）適切にAPとML軸に水平に脳と定位フレームにマウスを確保することができます。 4）精度のマイクロマニピュレーターを操作する能力を有します。 5）適切な術後ケアを確保します。これらの重要なステップに従っている場合、マウスは観察されない感染症の手術に耐える必要があります。
in vitroでの研究と一致して、私たちと他の人は、Aβ1-42が直接海馬に注入されたことが示されているADの主要な特徴の一つを描いた、神経細胞死1,4,9,10を誘発します。変性1のマーカーの増加によって補完される歯状回の体積に減少によって示されるように変性は、注射部位の近傍で明らかです。また、T彼はコリン作動性標識の低下やBF 1,10におけるTUNEL陽性染色の増加によって示されるように、海馬に突出ニューロンが逆行で死ぬコリン作動します。したがって、このin vivoモデルは、局所的に、Aβ1-42の半急性効果を調査するための優れたモデルとして役立ちます。この注入モデルの主な利点は、その動的な性質である：任意の脳領域を標的とすることができ、異なる老齢の動物を使用することができます。私たちは古いマウスにおいてAβ1-42のレベルを増加させることがより良い高齢者に起こる疾患をシミュレートすると考えているので、9カ月齢の雄マウスを実験で選択されました。また、私たちは同じ年齢のマウスを使用して、一貫性のある実験を維持することを目指しています。しかし、任意の年齢のマウスが注射に使用することができます。過去には、私たちは16月齢のマウス等に実験している9,10 2月齢のマウスを使用しています。唯一の雄マウスは、雌マウスの展示ESTROとして研究に使用されるべきですゲンレベルの変動およびエストロゲンは神経保護効果20を有することが知られています。 Aβ1-42の病理学的効果の多くの研究関心の中心が、その低または生理的Aβ1-42レベルは学習と記憶21,22のための正常な機能に必要とされる証拠もあります。これらの研究で研究者らは、Aβ1-42の濃度を低下させた注入および海馬22,23にそれを注入し、効果的にこのパラダイムの有用性の動的な性質の他の例を明らかにしました。正常定位注入されている他の化合物は、細胞死/生存の動物の行動の範囲の様々な効果を調査するための薬物、ウイルスは、siRNA、抗体、およびペプチド1,22-26を含みます。従って、この注入パラダイムを採用するための多数の用途があります。
記載の注入方法論、V INのための様々なポテンシャルを発揮しながら、IVOは、この手法を用いた研究も固有の制限が付属しています。まず、このモデルは、単離された脳領域におけるAβ1-42の効果を再現しようとします。第二に、注射部位は、脳内への針の導入から破損しています。これは、付加的な細胞死および神経膠症に寄与する。したがって、分析は、注入管から離れて行う必要があります。同じ脳の反対側の適切な車両制御では、これは、周囲の組織に注入された車両およびAβ1-42の溶液の広がりなどの問題になることはありません。 BFのコリン作動性ニューロンは、海馬に突出するので第三に、針（ 図1B）によるDGの崩壊によって明らかなように、海馬の物理的な損傷が誤っていくつかのBFCNsを死滅させることができます。幸いなことに、短期的には神経回路を調べる - 単発注入の1週間以内に - 私たちのデータが増加したことを示唆しているので、問題になりません前脳基底部におけるコリン作動性の死は、Aβ1-42の結果ではなく、針のトラウマから、コントロール注射は、適切な分析を提供します。データは、これらのニューロンは、それらのシナプスのターゲット（ 図2B）を失うようDGの変性はまた、BFのコリン作動性ニューロンの喪失のために必要であることを示唆しています。残念ながら、2週間まで生存している動物のための車両に注入側は、物理的外傷に起因する歯状回の変性や間伐に一部起因すると思われる1週間後の車両を注射した動物の上BFCN死の有意な上昇を示しています針。しかし、この段階でのデータは、Aβ1-42 -injectedサイトにBFの同側でかなり多くの死があることを示唆しています。第四に、繊細な解剖学的境界を識別することは達成が困難であり得ます。例えば、内側中隔および斜めバンドとの間の境界は、前方の位置に基づいて決定されました交連、以前に27を説明した技術。また、同側BFコリン作動性神経突起のため-主に内側中隔と角帯（MS / DB）の垂直肢から-海馬12,28,29の歯状回に我々は、Aβとの半球を注入することを決めました1-42と比較対照として、反対の半球を使用しています。これは、このパラダイムへの関心は、左右のMS / DBを分離する境界の適切な識別となることが考えられます。 MSは正中線領域であるが、DBがより横方向です。この現在の仕事と私たちの最も最近の刊行物1のために我々は快適に左右のDBを区別することができました。私たちの定量化は、チャット（+）ニューロンは、Aβ1-42 -injected側にDBに約25％減少明らかにする。しかし、我々は、（+）MS 1のニューロンをチャットで任意の有意な変化は検出されませんでした。そのため、横LOCののDBや変更のationが、我々は、同じ動物内の車両及びAβ1-42注射を使用することが正当化さ感じた観察しました。また、同じ動物内に2つの異なる実験条件を試験動物の使用を最大化するだけでなく、潜在的な動物対動物のばらつきを低減します。我々の実験設計は、それが考えられる私たちは、左右の半球を比較することができながら、内側中隔は、研究の主な焦点である場合は、この比較手法は、 すなわち 、今後の研究で実現可能ではないかもしれません。このような場合には、各動物は、実験条件として機能する必要があります。したがって、動物の使用は、実験者の裁量です。第五に、電流注入モデルは、行動のような他のリードアウトのために使用することができますか？現在のAβ1-42注入モデルを採用における当社の目的は、 生体内で Aβ1-42の神経病理学的効果を評価し、in vitroでの知見1にそれを比較することでした図1B及び2B）を観察するので、例えば、DGの破壊が意図しない行動異常を生じ得ます。研究では、海馬依存性行動のAβ1-42の影響を調べる必要とする場合したがって、その後、注入対象は、海馬の近くに再配置する必要がある可能性があり直接ではなく、それへとAβ1-42は海馬内に拡散することを可能にします。それによると、動作テストのための電流注入パラダイムを使用することは可能ですが、より多くのテストが必要でするおよび特性、ならびに最終的な実験戦略は、エンドユーザによって決定されます。興味深いことに、脳内に直接Aβ1-42の外部配信を伴う前にげっ歯類の行動研究が行われている。22,30は、総合すると、これらの制限は、このモデルを用いたin vivoでのマウスの研究で設計する際に考慮する必要があります。
既存の単一のマウスモデルは、ADの完全な病理学的効果をキャプチャしていないため、定位Aβ1-42注入技術は、 生体内のAβ1-42マウスモデルにおける代替と実験者が用意されています。よく訓練された個人によって実行したとき、このモデルは、特定の脳領域または回路上のAβ1-42の影響に焦点を当てた短期研究に最適です。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、神経疾患や脳卒中の助成金（CMT）にNS081333の国立研究所によってサポートされていました、アルツハイマー病協会の助成金NIRG-10から171721と国立精神衛生研究所（UHに）MH096702を付与し、高齢化資金によるアルツハイマー病研究に関する国立研究所（YYJとJBに）コロンビア大学パイロットグラントAG008702でセンター。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine HCl (100 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20 mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3 mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2,000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1,000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6 mm; Length 28 mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5x1.5 mm; Length 11.5 cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8 mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 G Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 G Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25x7.25 in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
References
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