Disparo Reactive Gliose<em&gt; In Vivo</em&gt; Por um Stab Lesão Encéfalo anterior

Resumo

Este artigo descreve um protocolo detalhado para produzir uma lesão por facada no prosencéfalo em camundongos adultos. A lesão por arma branca induz gliose reativa grave e formação de cicatriz glial que pode ser posteriormente examinada por métodos imuno-histoquímicos padrão.

Resumo

Após a lesão do SNC, os astrócitos passam por uma ampla gama de alterações bioquímicas, morfológicas e moleculares coletivamente chamadas de astrogliose reativa. Os astrócitos reativos exercem efeitos inflamatórios e protetores que inibem e promovem, respectivamente, o reparo neural. Os mecanismos subjacentes às diversas propriedades funcionais da astrogliose reativa não são bem compreendidos. Alcançar uma maior compreensão desses mecanismos é fundamental para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para tratar o SNC lesado. Aqui, demonstramos um método para desencadear astrogliose reativa no prosencéfalo de camundongos adultos usando uma lesão de facada no prosencéfalo. Este modelo de lesão é simples, confiável e requer apenas um dispositivo estereotáxico e uma lâmina de bisturi para produzir a lesão. O uso de lesões por arma branca como modelo de lesão no prosencéfalo está bem estabelecido e passível de estudos que abordem uma ampla gama de resultados neuropatológicos, como degeneração neuronal, neuroinflamação e interrupções na barreira hematoencefálica (BHE). Assim, o modelo de lesão por facada no prosencéfalo serve como uma ferramenta poderosa que pode ser aplicada a uma ampla gama de estudos sobre a resposta do SNC ao trauma.

Introdução

Um grande desafio para o desenvolvimento de terapias bem-sucedidas para tratar o SNC lesionado é uma compreensão incompleta dos complexos eventos multicelulares desencadeados pelo trauma. Os astrócitos reativos estão ganhando cada vez mais reconhecimento como um alvo promissor para novas terapias¹. Embora historicamente considerados hostis ao reparo neural, os astrócitos reativos são agora reconhecidos como componentes críticos de uma resposta neuroprotetora multicelular complexa que inclui atenuação de processos inflamatórios e limitação de danos secundários e neurodegeneração^2-6. Embora as características neuropatológicas da gliose reativa tenham sido bem definidas há muito tempo, os mecanismos celulares e moleculares que regulam a gliose reativa e a diversidade de consequências a jusante permanecem pouco compreendidos. Compreender os mecanismos que impulsionam a gliose reativa, bem como os eventos celulares e moleculares subsequentes, é um passo importante para o desenvolvimento de estratégias destinadas a promover as propriedades neuroprotetoras da gliose reativa, atenuando os efeitos prejudiciais.

Aqui demonstramos um método para induzir astrogliose reativa grave no prosencéfalo de camundongos adultos usando uma facada. Em contraste com outros modelos de lesão cerebral traumática (TCE), como impacto cortical controlado (CCI) ou lesão por percussão fluida (FPI), que requerem equipamento especializado para produzir uma lesão, a facada do prosencéfalo requer apenas um dispositivo estereotáxico para estabilizar a cabeça e uma lâmina de bisturi nº 11. Assim, o modelo de lesão por facada do prosencéfalo é mais amplamente acessível a uma ampla gama de laboratórios que não têm acesso aos dispositivos especializados necessários para criar uma lesão FPI ou CCI. O método descrito aqui permite que os investigadores desencadeiem de forma confiável e reprodutível uma resposta robusta à gliose para investigar eventos celulares e moleculares subsequentes. Uma vez recuperados da cirurgia, os animais que receberam uma facada no prosencéfalo podem sobreviver por períodos prolongados sem a necessidade de cuidados especializados e podem ser devolvidos à colônia para estudos agudos, intermediários ou crônicos. Embora menos clinicamente traduzível do que os modelos FPI ou CCI de TCE, uma lesão no prosencéfalo produzida por uma lesão por arma branca serve como um modelo experimental simples, mas útil, para investigar os mecanismos biológicos básicos subjacentes à gliose reativa e outros eventos neuropatológicos após trauma no SNC.

Protocolo

Adulto (3-4 meses de idade) ratos machos em um C57BL / 6 fundo misto foram utilizados neste protocolo. Os animais foram mantidos em um ciclo claro / escuro de 12 horas de luz, e permitiu o livre acesso a comida e água. Todos os procedimentos realizados neste protocolo foram realizados de acordo com protocolos aprovados pela Comissão de Drexel University Institutional Animal Care e Use.

1. Preparar Área Cirúrgica

1. Desinfetar mesa cirúrgica com etanol 70%, em seguida, cobrir toda a bancada cirúrgica com absorventes higiênicos e providenciar instrumentos cirúrgicos adjacente ao estereotáxica.
2. Configurar equipamento estereotáxico sem braço manipulador. Organizar a almofada de aquecimento na estereotáxico e ajustado para 37 ° C. Evitar o sobreaquecimento do animal, colocando um pequeno pedaço de papel toalha ou almofada cirúrgica entre o animal ea almofada de aquecimento.
3. Com uma tesoura autoclavados, cortar pequenos pedaços de gelfoam autoclavado em uma placa de Petri estéril contendo solução salina 0,9% estéril até ready para uso.
   Nota: Manter ambiente de trabalho estéril, utilizando instrumentos esterilizados e suprimentos cirúrgicos estéreis. Re-esterilizar instrumentos cirúrgicos durante o procedimento ou entre animais por meio de imersão em um esterilizador talão de 10-15 segundos, conforme necessário. Manter luvas limpas durante todo o procedimento, esfregando as mãos com álcool a 70%, conforme necessário, de desinfectar.

2. Prepping mouse para Cirurgia

1. Remover rato de gaiola e pesar (g).
2. Colocar o mouse na câmara de indução isoflurano e definir oxigênio a 2 L / min e vaporizador isoflurano a 5 para induzir um plano cirúrgico de anestesia, cerca de 3-5 min. Monitore a respiração desacelerou e imobilização. Verifique se o mouse está totalmente sedado utilizando o reflexo toe pitada.
3. Quando o mouse está totalmente sedado, coloque no quadro estereotáxico, prenda o nariz no cone do nariz, que está ligado com a tubulação para o isoflurano. Insira barras de ouvido no canal do ouvido e aperte, garantindo a cabeça é estável.
4. Raspar a cabeça de orelha a orelha, e de entre os olhos para atrás das orelhas.
5. Esterilizar a pele com toalhetes alternados de álcool isopropílico e uma solução de betadine iodo, 3 vezes cada um.
6. Aplicar lágrimas artificiais para ambos os olhos para evitar que sequem durante o procedimento cirúrgico.

3. Procedimento Cirúrgico

1. Monitore a profundidade da anestesia por beliscar a ponta ou cauda. O rato está localizado no plano cirúrgico apropriado quando não houver nenhuma resposta, e a respiração é lenta e uniforme.
2. Faça uma incisão na pele parasagittal de apenas atrás dos olhos para quase entre as orelhas em um único movimento, firme, usando uma lâmina de bisturi n ° 11. Mova pele de lado e clip lado direito com pinça hemostática.
3. Limpar crânio de membrana sobreposta usando o lado maçante do No. 11 bisturi e algodão derrubou aplicadores. Opcionalmente, limpe o crânio com algodão aplicador derrubado mergulhados em solução salina a 0,9%. Deixar secar completamente.
4. Nósção uma pequena régua, marcar a borda anterior da craniotomia a 1 mm caudal para a sutura coronária, e a borda esquerda da craniotomia em 1 mm lateral à sutura sagital (Figura 1), com um marcador permanente. Em seguida, marque a direita e fronteiras caudal da craniotomia a 4 mm das suturas sagital e coronal, respectivamente (Figura 1).
5. Usando uma broca de 0,5 mm, começar a fazer a craniotomia por perfuração lentamente seguindo o contorno marcador permanente. Tenha cuidado para não romper o crânio completamente. Pressione suavemente a parte isolada de osso parietal com No. 5 fórceps, áreas de fraqueza dará lugar à pressão. Quando o osso diluído é suficientemente fraca ao longo do perímetro, a peça óssea está pronta para remoção.
   NOTA: Se a dificuldade experiências investigador remoção do osso em uma única peça, isso sugere que o osso não estava suficientemente diluído durante a perfuração. Considere a perfuração do crânio ainda mais em animais subsequentes para Facilitate fácil remoção da peça óssea.
6. Usando uma seringa de 10 ml, equipado com uma agulha G 23, aplicam-se uma pequena quantidade de 0,9% de solução salina para absorver o osso isolado e área perfurada.
7. Prenda o braço manipulador ao equipamento estereotáxico. Anexar uma nova lâmina de bisturi n ° 11 para o titular da sonda com o lado afiado da lâmina virada para rostralmente.
   Nota: Embora os tecidos rostral e caudal experimentar as arestas vivas e sem corte da lâmina, respectivamente, a danos mecânicos induzida pela lesão penetrante é comparável em toda a extensão da lesão. Observamos há diferenças consideráveis ​​das principais características da gliose reativa incluindo upregulation de expressão ou a proliferação GFAP, entre as seções rostral e caudal.
8. Mantendo o braço manipulador fora do caminho, levante cuidadosamente o osso isolado usando 5/45 fórceps anguladas. Insira a ponta da pinça para o lado do osso isolada e elevador, usando alavanca para retirar o pedaço de osso deixado para trás em um full movimento.
   NOTA: Tenha cuidado para não apunhalar o cérebro ou perturbar a dura por baixo do crânio.
9. Pegue um pequeno pedaço da espuma gel absorvível embebida e coloque sobre o cérebro descoberto para evitar que ela seque e absorva todo o sangue que possa estar presente.
10. Uma vez que a espuma de gel está no lugar, balançar o braço manipulador no lugar e ajustar lâmina para o centro da craniotomia sobre a espuma gel. Remover a espuma de gel e reduzir a lâmina até que a ponta toca a dura-máter sem a perfuração da dura-máter. Mark dorsal / ventral coordenadas utilizando a escala vernier no braço vertical da estereotáxico.
11. Usando o braço manipulador, abaixe lentamente a lâmina precisamente três milímetros no cérebro. Isto é conseguido usando as marcas de escala vernier do braço manipulador. Permitir lâmina para ficar no lugar de 5-10 seg. Mova o braço estereotáxico com acessório lâmina rostral para caudal três vezes, permitindo que a lâmina para alcançar os limites rostral e caudal da craniotomia antes de passar para o opposite fim.
    NOTA: A dura-máter não é removido antes de inserir a lâmina. Em contraste com a dura-máter de rato, que é ~ 80 um de espessura ^7, a dura-máter do rato é consideravelmente mais finas (apenas algumas camadas celulares de espessura) e não produz uma resistência apreciável para a lâmina de bisturi durante a inserção. Usar uma nova lâmina de bisturi para cada rato para assegurar que cada animal recebe uma lesão consistente.
12. Lentamente levantar o braço estereotáxico, retirando a lâmina do cérebro. Após a remoção da lâmina, coloque imediatamente um outro pedaço de gelfoam na superfície do cérebro para absorver qualquer excesso de sangue ou fluido.
13. Enquanto isso, retirar o braço estereotáxico e dispor da lâmina de bisturi n ° 11. Uma vez que o sangramento parou, remova o gelfoam.
14. Fechar a ferida por sutura da pele com sutura não absorvível, tal como ethilon ou prolene. As suturas devem ser removidos 9-10 dias após a cirurgia.
15. Devolver o mouse para sua gaiola, e permitir que o mouse para se recuperar lentamente em um heating pad eo monitor para detectar quaisquer sinais de angústia. A recuperação da anestesia induzida por isoflurano tipicamente ocorre dentro de 2-5 minutos após a remoção do isofluorano. Não deixe o animal sem supervisão até que ele recuperou recumbancy esternal.
16. Administrar 0,5-1 ml de solução de Ringer lactato subcutaneamente para garantir a hidratação.

4. Cuidados pós-cirúrgica

1. Acompanhar de perto os animais no pós-operatório até a recuperação da anestesia, antes de voltar para a colônia.
   1. Para reduzir a dor e desconforto pós-operatório, administrar 0,05-0,1 mg / kg de buprenorfina por injecção ip imediatamente após o procedimento.
   2. Observe os animais por 2-3 dias após a cirurgia para sinais severos de angústia, como movimentos restritos, a falta de preparação, ou perda de peso. Euthanize animais que demonstram algum destes sinais de sofrimento e retire do estudo.
2. Para examinar histopatológico de tecidos lesados, eutanásia animais por stanperfusão intracardíaca dard.
   1. Resumidamente, anestesiar os animais com uma overdose de cetamina / xilazina e, em seguida perfundidos intracardial com 15-20 mL de NaCl a 0,9%, ou até que o fígado é limpa de sangue, seguido por 60 ml de paraformaldeído a 4% no final da experiência.
3. Dissecar cérebros e pós-correção para 2-4 h em paraformaldeído a 4% antes da transferência para solução de sacarose 30%. Secção cérebros num crióstato a 40-60 uM, e processo por procedimentos histológicos ou imuno-histoquímicos convencionais, ou como descritos em Garcia ^8,9.

Resultados

Porque os animais submetidos a esse procedimento não requerem períodos de sobrevivência especializados cuidados pós-operatórios, curtos ou de tempo de longo prazo são facilmente incorporados no estudo, dependendo da necessidade de investigar patologia aguda ou crônica após a lesão. Principais recursos de gliose reativa, como regulação alta de GFAP e hipertrofia de soma, pode ser observado logo em 2-3 dias após a lesão. A fase de pico da proliferação de astrócitos reativos é durante os dias 3-5 após lesão ^10. ...

Discussão

É fundamental que o crânio ou dura subjacente não sejam danificados durante a perfuração. Use uma leve pressão durante a perfuração para garantir o crânio não é perfurada. Além disso, deve ser tomado cuidado ao levantar o pedaço do crânio para garantir a dura não é levantado com o osso.

A lesão forebrain facada descrito aqui modelos de uma lesão penetrante no SNC. Embora menos clinicamente traduzível do que os modelos de TBI como FPI ou ICC, o modelo de lesão forebrain facada serve como uma ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Stereotax	Harvard Apparatus	726049
Micro broca de alta velocidade	Harvard Apparatus	724950
lâmina de bisturi de aço inoxidável, #11	MedVet	JOR581S
5/45 fórceps angular	Fine Science Tools	11251-35
Esponja Gelfoam 12 cm x 7 mm	Fisher	NC9841478
Rb anti-GFAP	DAKO&	nbsp; Diluição Z033429-2	- 1:20.000 (campo claro); 1:1.000 (fluorescência)
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	Diluição - 1: 20.000 (campo claro); 1:500 (fluorescência)
Cabra biotinilada anti-coelho	Vector Laboratories	BA-1000	Diluição - 1:400 (campo claro)
Vector Laboratories		BA-6000	Diluição - 1:400 (campo claro)
Alexafluor 488 anti-coelho de cabra	Life Technologies	A-11008	Diluição - 1:400 (campo claro)
Alexafluor 568 anti-ovelha de burro	Life Technologies	A-21099	Diluição - 1:1.000 (fluorescência)
DAPI Nucleic Acid Stain	Life Technologies	D3571	Diluição - 1:1.000 (fluorescência)
Acetato de violeta cresil	Sigma Aldrich	C5042-10G	Diluição - 1% (campo claro)