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Artigo de método

A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

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DOI:

10.3791/52836

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21 de maio de 2015

 ,  ,  , 
1Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University

Neste artigo

Resumo

Aqui, foi descrito um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA direcionadas a rRNA 16S marcadas com DIG. Este protocolo pode ser aplicado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

Resumo

A presença de bactérias no epitélio da bolsa e no tecido conjuntivo subjacente em biópsias gengivais de pacientes com periodontite foi relatada usando vários métodos, incluindo microscopia eletrônica, imuno-histoquímica ou imunofluorescência usando anticorpos específicos para bactérias e hibridização in situ fluorescente (FISH) usando uma sonda de oligonucleotídeo marcada com fluorescência. No entanto, esses métodos não são amplamente utilizados devido a limitações ou dificuldades técnicas. Aqui, foi introduzido um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA marcadas com DIG. Os tecidos embebidos em parafina são a forma mais comum de tecidos de biópsia disponíveis nos bancos de patologia. As bactérias podem ser detectadas de maneira específica ou universal da espécie. Os sinais bacterianos são detectados como formas discretas (coco, bastonete, fusiforme e forma pilosa) de bactérias ou formas dispersas. A técnica permite obter outras informações histológicas: o epitélio, o tecido conjuntivo, os infiltrados inflamatórios e os vasos sanguíneos são bem distinguidos. Este método pode ser usado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

Introdução

As bactérias desempenham um papel na etiologia de diversas doenças orais, tais como periodontite, pulpite, pericoronite, celulite, osteomielite e. A fim de compreender o papel das bactérias na patogénese da doença e para monitorizar o efeito de tratamentos, localização de bactérias dentro do tecido é importante. A presença de bactérias no interior do tecido gengival a partir de pacientes com periodontite foi demonstrado usando vários métodos, incluindo microscopia electrónica de 1,2, imuno-histoquímica e imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para cada bactéria 3-7, e hibridação in situ fluorescente (FISH) 8 utilizando um fluorescence- sonda oligonucleotídica marcada segmentação 16S rRNA. No entanto, estes métodos não são amplamente utilizados devido a limitações técnicas ou dificuldades. Comparado com os anticorpos, as sondas alvo rRNA 16S são fáceis de produzir e alcançar espécie-especificidade. FISH tem provado ser uma excelente ferramenta para a visualização de bactériaeria em seus ambientes naturais, como biofilme placa. No entanto, a aplicação de FISH para amostras de tecidos é limitado devido a autofluorescência de vários componentes do tecido. Por exemplo, o forte autofluorescência das células vermelhas do sangue, muitas vezes dificulta a aplicação da tecnologia de fluorescência para tecidos inflamados quando elas envolvem sangramento 9.

De forma a localizar as bactérias dentro dos tecidos gengivais inflamadas, por conseguinte, um método de hibridação in situ, utilizando uma digoxigenina (DIG) sonda de DNA marcado com foi desenvolvido e aplicado com sucesso 10,11. Aqui, um protocolo detalhado para a localização de bactérias no interior de tecidos embebidos em parafina, utilizando P. gingivalis sondas eubacterianas espec�icos e universais tem sido descrita. É particularmente focado na padronização do método de modo que resultados semelhantes podem ser reproduzidos em outros laboratórios. Este protocolo permite a localização de bactérias dentro de seu contexto histológica e do results são altamente reprodutível. O protocolo descrito pode ser utilizado para localizar bactérias ou de uma forma específica para a espécie ou universal em diversos tecidos. A sonda universal é especialmente útil para detectar bactérias em doenças polimicrobianas e para estudar o potencial papel da bactéria, em doenças em que o papel de bactérias específicas que não é conhecido.

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Protocolo

1. Preparação Probe

  1. A amplificação por PCR da sonda
    1. Para o P. sonda gingivalis -específica, amplificar um fragmento de DNA 343-bp do P. gingivalis 16S rRNA por PCR utilizando o DNA genómico de P. gingivalis e os seguintes iniciadores: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'e 5' AGIR CGT ATC CGT TAT GCC TC-3 '10. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 1 min 20 seg seguido de uma extensão de 5 min a 72 ° C 10,11.
    2. Amplificar a sonda eubacterial usando um 70-bp fragmento de DNA (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG
      TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 ') sintetizado como um oligonucleótido e os seguintes iniciadores: 5'-CTG CAG GTR GGY CMT-3' e 5'-AGG TTG GCG CTC TTG-3 '11. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 40 ciclosa 9 4 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg e 72 ° C durante 1 min 20 s, seguido de uma extensão de 5 min a 72 ° C 11,12.
    3. Precipitar os produtos de PCR (≥500 ul) pela adição de acetato de sódio 3M (pH 5,2) e etanol a 100% (a uma 10: 1: 2 ratio) e incubação a -20 ° C durante 2 horas.
    4. Centrífuga-se a mistura a 14000 xg durante 15 min, ressuspender o sedimento em 100 ul de tampão TE, e medir a concentração de DNA por densidade óptica a 260 nm.
  2. DIG-rotulagem utilizando rotulagem e detecção de DNA kit DIG
    1. Misturar 3 ug da sonda com água para um volume final de 15 ul.
    2. Desnaturar o ADN, a 95 ° C durante 10 min e relaxar rapidamente em gelo.
    3. Adicionar 2 mL de 10x mistura hexanucleotide, 2 ul de mistura de dNTP a rotulagem, e 1 ul da enzima Klenow para 15 ul do ADN desnaturado.
    4. Misturar e incubar a 37 ° C durante 24 h a 48 h e parar de reacção por aquecimento a 65 ° C.
  3. Verifique a sensibilidade da sonda marcada com DIG usando um kit de marcação e detecção de ADN DIG
    1. Carregar manualmente 1 ml de diluições em série da sonda de controlo positivo fornecido com o kit e 1 ng de sonda marcada com DIG na membrana de nylon e seco durante 5 min à TA.
    2. Resumidamente mergulhar a membrana no tampão 2 x SSC (NaCl 0,3 M, citrato de sódio 30 mM, pH 7,0) e incuba-se a membrana a 80 ° C durante 1 h para imobilizar o ADN.
    3. Resumidamente mergulhar a membrana no tampão de ácido maleico (MAB, 0,1 M de ácido maleico, 0,15 M de NaCl, pH 7,5) e incuba-se com fosfatase alcalina anti-DIG (AP) anticorpo conjugado a diluída (1: 5000) em 6 ml de solução de bloqueio, previsto no kit à TA durante 30 min.
    4. Lava-se a membrana com MABT (MAB contendo 1% de Tween 20) e aplicam-se 40 ul da solução de NBT / BCIP misturado com tampão de detecção de 2 ml (0,1 M de Tris-HCl, 0,1 M de NaCl, 0,05 M de MgCl2, pH 9,5) para o membrana durante 1 min. Se a sensibilidade da sonda marcada énão satisfatória, repita os passos a partir de 1.1.3 para 1.3.4.
    5. Medir a concentração de DNA da sonda marcada (DO260) e ajustar a concentração de 100 ng mL -1.
  4. Verifique a especificidade da sonda marcada com DIG
    1. Desnaturar amostras de ADN genómico (25 ng de 3 ul -1 por cada amostra) a partir de várias espécies bacterianas, incluindo a bactéria alvo da sonda específica, a 95 ° C durante 10 min e relaxar rapidamente em gelo.
    2. Carregar manualmente o ADN desnaturado na membrana de nylon e seco durante 20 min à TA.
    3. Resumidamente mergulhar a membrana no tampão 2 x SSC e incubar a membrana a 80 ° C durante 2 horas para imobilizar o ADN.
    4. Bloquear a membrana com uma solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h.
    5. Dilui-se a sonda a 1 ng mL -1 em tampão de hibridação, desnaturar as sondas diluído, e aplicam-se sobre a membrana.
    6. Incubar a membrana a 45 ° C durante 1 h.
    7. Lava-se a membrana trêsvezes com tampão 2 x SSC.
    8. Resumidamente mergulhar a membrana no MAB.
    9. Incubar com anticorpo anti-DIG-AP conjugado diluído (1: 2000) em 6 ml de solução de bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h.
    10. Lava-se a membrana com MABT e aplicar 40 ul da solução de NBT / BCIP misturado com tampão de detecção de 2 ml.
    11. Quando a sonda não conseguir a especificidade esperada, aumentar a temperatura até que a especificidade de hibridação é observado.

2. Hibridação In Situ

Nota: Para evitar a secagem das amostras e reagentes, execute todas as incubações em câmara úmida forrada com papel-toalha molhada.

  1. De-parafinização e re-hidratação de secções de tecido
    1. Prepare a 4 mm de espessura secções de tecido a partir de blocos embebidos em parafina. Formalina, paraformaldeído, e fixador à base de zinco são compatíveis com este protocolo.
    2. Prepare todos os reagentes que utilizam água tratada com DEPC.
    3. Lâminas de calor num forno seco a 60 ° C durante 30 min e incubar à TA durante 30 min.
    4. Imergir as lâminas em 100% de xileno durante 5 minutos três vezes; use xileno fresco cada vez.
      Nota: Faça isto procedimento de depilação de em um exaustor química.
    5. Imergir as lâminas em etanol a 100% durante 5 min, duas vezes, com etanol fresco de cada vez, e re-hidratar as amostras em série de 90%, 80% e soluções de etanol a 70% durante 5 min cada.
    6. Imergir as lâminas em água tratada com DEPC para 1 min e lavagem das lâminas em PBS tratado com DEPC (pH 7,4) durante 6 min.
  2. Os pré-tratamentos de cortes de tecido
    1. Imergir as lâminas em ácido clorídrico 0,1 N durante 20 minutos e lavagem das lâminas em água tratada com DEPC para 30 seg.
    2. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor espécimes usando uma caneta cera.
      Nota: O tamanho da barreira hidrofóbica depende do tamanho das amostras. Por conseguinte, os volumes de reagentes utilizados nos passos seguintes variam dependendo do tamanho das amostras, mas tem que preencher o HYdrophobic barreira (50 ul para pequenas amostras e 400 ul para grandes amostras).
    3. Tratar as amostras com 50 a 400 ul de proteinase K (1 a 10 ug ml -1 em PBS tratado com DEPC) num forno seco a 37 ° C durante 30 minutos e lavagem das lâminas em tratada com DEPC 1x PBS durante 1 min.
    4. Soak lâminas em paraformaldeído a 4% em PBS tratado com DEPC durante 10 min, em seguida, lavagem das lâminas em PBS tratado com DEPC a 1 min.
    5. Soak lâminas em trietanolamina 0,1 M-HCl (pH 8,0) contendo 0,5% de anidrido acético durante 20 minutos e lavagem das lâminas em água tratada com DEPC para 30 seg.
  3. A hibridação com sonda e lavagem
    1. Imergir as lâminas em tampão SSC 2x para 20 min.
    2. Dilui-se a sonda a 1 ng mL -1 em tampão de hibridação (SSC 4x, 50% [vol / vol] formamida, solução de Denhardt 1x, 10% [peso / vol] de sulfato de dextrano, 0,1% [peso / vol] de sulfato de dodecilo de sódio, 0,4 mg ml -1 de DNA de esperma de salmão). Para controlos negativos, misturar com a sonda marcadauma quantidade em excesso de 10 vezes de sonda não marcada.
    3. Desnaturar as sondas diluído e aplicam 50 a 400 ul para as secções de tecido. Coloque uma lamela sobre a lâmina e selar com unha polonês.
    4. Lâminas de calor na máquina de PCR a 90 ° C durante 10 min e incubar em uma câmara humidificada O / N a 45 ° C ou à temperatura óptima determinada no passo 1.4.11.
    5. Arrefecer as lâminas a 4 ° C durante 30 min, remover lamelas, e mergulhar as lâminas num tampão SSC série como seguintes: 4x SSC durante 10 min, pré-aquecido (45 ° C) 2x SSC durante 20 min, 2 x SSC durante 10 min, e 0,2x SSC durante 10 min.
  4. A detecção com anticorpo anti-DIG-AP conjugado
    1. Lavar as lâminas em MABT por 5 min.
    2. Bloco com 50 a 400 uL de solução com 1% de Tween 20 de bloqueio durante 20 minutos.
    3. Adicionar 50 a 400 ul de anticorpo anti-DIG-AP diluídos em solução (1: 1000) de bloqueio anld incubar a 37 ° C durante 90 min.
    4. Lavar as lâminas em MABT para 10 min.
    5. Imergir as lâminas em tampão de detecção contendo 1% de Tween 20 durante 5 min.
    6. Trata-se com 50 a 400 μ de levamisol 1 mM (em tampão de detecção contendo 1% de Tween 20) durante 5 min, para inactivar a fosfatase alcalina endógena.
    7. Distribuir 50 a 400 ul da solução pré-misturada de NBT / BCIP (diluída em tampão de detecção a 1: 100) para cada amostra e incubar numa câmara humidificada à temperatura ambiente durante 2 a 3 horas até que o sinal desenvolvido é satisfatória.
    8. Lavar as lâminas com água desionizada para parar a visualização e aplicam 50 a 400 pi de 0,05% [peso / vol] verde de metilo como um contador de manchas a 37 ° C durante 10 min.
    9. Lavar as lâminas com água desionizada, desidratar em 100% de etanol, e mergulhar em xileno.
    10. Aplicar 80 ml de solução de montagem em cada slide e cobrir com lamelas.

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Resultados

A Figura 1 mostra dot blot de sondas marcada com DIG em comparação com a sonda de controlo positivo fornecido com o kit para determinar a sua sensibilidade. A 343 pb P. sonda espec�ico gingivalis é de 25 vezes mais sensível do que a sonda eubacteriana 70 pb. A Figura 2 mostra a hibridização in situ de tecidos gengivais obtidos a partir de pacientes com periodontite crónica para a detecção de P. gingivalis e eubactérias. Os sinais bacterianos, mostra...

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Discussão

Aqui um protocolo para localizar bactérias dentro dos tecidos embebidos em parafina, utilizando uma sonda de DNA marcada com DIG tem sido descrita. A sonda tem como alvo as moléculas de ADN ou ARN do gene 16S do rRNA bacteriano, e as sondas de rRNA 16S-alvo pode ser concebido como uma ou outra espécie específica, ou universal. A hibridação específica da P. gingivalis espec�ico sonda para P. gingivalis, mas não a outras bactérias orais tem sido mostrado previamente 10. Em contraste, a sonda...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado por uma bolsa (2013R1A1A3005669) da Fundação Nacional da Coreia Investigação e uma subvenção (HI13C0016) do coreano Saúde Tecnologia R & D Projeto, Ministério da Saúde e Bem-Estar.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Anidrido acéticoSigma6404
50% solução de sulfato de dextranoMilliporeS4030
50X Denhardt ' s soluçãoSigmaD2532
DEPCSigmaP159220
DIG kit de marcação e detecção de DNARoche11 093 657 910
FormamidaSigmaF9037
ImmEdge™ CanetaDakoH-400
LevamisolVectorSP-5000
Cloreto de magnésioSigma246964
Ácido maleicoSigmaM0375
Metil verdeSigmaM6776
ParaformaldeídoSigmaP1648
PermountFisherSP15-500
Solução de DNA de esperma de salmãoInvitrogen# 15632-011
Cloreto de sódioSigmaS9625
Citrato de sódioDuksanD1420
Dodecil sulfato de sódioAmresco227
Trietanolamina-HClSigma90279
Tris-HClOrgânicos de pesquisa3098T

Referências

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