A detecção in situ de bactérias dentro dos tecidos de parafina-encaixados Usando um marcado com Digoxina DNA Probe Segmentação 16S rRNA

Resumo

Aqui, foi descrito um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA direcionadas a rRNA 16S marcadas com DIG. Este protocolo pode ser aplicado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

Resumo

A presença de bactérias no epitélio da bolsa e no tecido conjuntivo subjacente em biópsias gengivais de pacientes com periodontite foi relatada usando vários métodos, incluindo microscopia eletrônica, imuno-histoquímica ou imunofluorescência usando anticorpos específicos para bactérias e hibridização in situ fluorescente (FISH) usando uma sonda de oligonucleotídeo marcada com fluorescência. No entanto, esses métodos não são amplamente utilizados devido a limitações ou dificuldades técnicas. Aqui, foi introduzido um método para localizar bactérias em tecidos embebidos em parafina usando sondas de DNA marcadas com DIG. Os tecidos embebidos em parafina são a forma mais comum de tecidos de biópsia disponíveis nos bancos de patologia. As bactérias podem ser detectadas de maneira específica ou universal da espécie. Os sinais bacterianos são detectados como formas discretas (coco, bastonete, fusiforme e forma pilosa) de bactérias ou formas dispersas. A técnica permite obter outras informações histológicas: o epitélio, o tecido conjuntivo, os infiltrados inflamatórios e os vasos sanguíneos são bem distinguidos. Este método pode ser usado para estudar o papel das bactérias em várias doenças, como periodontite, câncer e doenças imunológicas inflamatórias.

Introdução

As bactérias desempenham um papel na etiologia de diversas doenças orais, tais como periodontite, pulpite, pericoronite, celulite, osteomielite e. A fim de compreender o papel das bactérias na patogénese da doença e para monitorizar o efeito de tratamentos, localização de bactérias dentro do tecido é importante. A presença de bactérias no interior do tecido gengival a partir de pacientes com periodontite foi demonstrado usando vários métodos, incluindo microscopia electrónica de ^1,2, imuno-histoquímica e imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para cada bactéria ^3-7, e hibridação in situ fluorescente (FISH) ⁸ uti....

Protocolo

1. Preparação Probe

1. A amplificação por PCR da sonda
   1. Para o P. sonda gingivalis -específica, amplificar um fragmento de DNA 343-bp do P. gingivalis 16S rRNA por PCR utilizando o DNA genómico de P. gingivalis e os seguintes iniciadores: 5'TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'e 5' AGIR CGT ATC CGT TAT GCC TC-3 ^'10. Realizar amplificações com as seguintes condições de ciclos: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 1 min 20 seg seguido de uma extensão de 5 min a 72 ° C ^10,11.
   2. Amplificar a sonda eubacterial usando um 70-bp fragmento de DNA (5....

Resultados

A Figura 1 mostra dot blot de sondas marcada com DIG em comparação com a sonda de controlo positivo fornecido com o kit para determinar a sua sensibilidade. A 343 pb P. sonda espec�ico gingivalis é de 25 vezes mais sensível do que a sonda eubacteriana 70 pb. A Figura 2 mostra a hibridização in situ de tecidos gengivais obtidos a partir de pacientes com periodontite crónica para a detecção de P. gingivalis e eubactérias. Os sinais bacterianos, mostra.......

Discussão

Aqui um protocolo para localizar bactérias dentro dos tecidos embebidos em parafina, utilizando uma sonda de DNA marcada com DIG tem sido descrita. A sonda tem como alvo as moléculas de ADN ou ARN do gene 16S do rRNA bacteriano, e as sondas de rRNA 16S-alvo pode ser concebido como uma ou outra espécie específica, ou universal. A hibridação específica da P. gingivalis espec�ico sonda para P. gingivalis, mas não a outras bactérias orais tem sido mostrado previamente ^10. Em contraste, a sonda.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anidrido acético	Sigma	6404
50% solução de sulfato de dextrano	Millipore	S4030
50X Denhardt ' s solução	Sigma	D2532
DEPC	Sigma	P159220
DIG kit de marcação e detecção de DNA	Roche	11 093 657 910
Formamida	Sigma	F9037
ImmEdge™ Caneta	Dako	H-400
Levamisol	Vector	SP-5000
Cloreto de magnésio	Sigma	246964
Ácido maleico	Sigma	M0375
Metil verde	Sigma	M6776
Paraformaldeído	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Solução de DNA de esperma de salmão	Invitrogen	# 15632-011
Cloreto de sódio	Sigma	S9625
Citrato de sódio	Duksan	D1420
Dodecil sulfato de sódio	Amresco	227
Trietanolamina-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Orgânicos de pesquisa	3098T