Acompanhamento Temporal de progressão do ciclo celular utilizando citometria de fluxo, sem a necessidade de sincronização

Summary

Este protocolo descreve o uso de bromodesoxiuridina (BrdU) para permitir a absorção de seguimento temporais de células que estavam na fase S de um determinado ponto no tempo. A adição de corantes de ADN e rotulagem anticorpo facilita a análise detalhada do destino das células em fase S em momentos posteriores.

Abstract

Este protocolo descreve um método para permitir o rastreamento de células ao longo do ciclo celular sem exigir que as células sejam sincronizadas. Alcançar a sincronização celular pode ser difícil para muitos sistemas celulares. A prática padrão é bloquear a progressão do ciclo celular em um estágio específico e, em seguida, liberar as células acumuladas, produzindo uma onda de células que progridem ao longo do ciclo em uníssono. No entanto, alguns tipos de células consideram esse bloco tóxico, resultando em ciclos celulares anormais ou até mesmo morte em massa. A captação de bromodeoxiuridina (BrdU) pode ser usada para rastrear o estágio do ciclo celular de células individuais. As células incorporam esse análogo sintético da timidina, enquanto sintetizam novo DNA durante a fase S. Ao fornecer BrdU por um breve período, é possível marcar um pool de células que estavam na fase S enquanto o BrdU estava presente. Essas células podem então ser rastreadas durante o restante do ciclo celular e na próxima rodada de replicação, permitindo que a duração das fases do ciclo celular seja determinada sem a necessidade de induzir um bloqueio do ciclo celular potencialmente tóxico. Também é possível determinar e correlacionar a expressão de proteínas internas e externas durante os estágios subsequentes do ciclo celular. Eles podem ser usados para refinar ainda mais a atribuição do estágio do ciclo celular ou avaliar os efeitos em outras funções celulares, como ativação do ponto de verificação ou morte celular.

Introduction

A avaliação das características do ciclo celular e alterações que ocorrem nas células durante a progressão do ciclo celular é fundamental para a compreensão de diversos aspectos da biologia, particularmente biologia do cancro. Muitos agentes em desenvolvimento para o tratamento de doenças malignas têm efeitos profundos sobre a progressão do ciclo celular ou induzir a morte de células através do ciclo celular dependente de mecanismos. A fim de estudar a dinâmica do ciclo celular ou células numa fase específica do ciclo celular, é usual para sincronizar as células. No entanto os métodos de sincronização pode ter efeitos prejudiciais sobre as células a ser estudada, pot....

Protocol

O protocolo aqui descrito utiliza a linha celular de leucemia linfoblástica aguda NALM6 mas pode ser aplicada a outros tipos de células.

1. Soluções e Reagentes

1. RPMI completo
   1. Adicionar 56 ml de soro fetal de vitelo (FCS) e 5,5 ml de 200 mM de L-glutamina a um frasco de 500 ml de meio RPMI-1640.
2. BrdU da Solução
   1. Prepare 32,5 mM de BrdU (10 mg / ml) em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina (DPBS).
3. BrdU completo RPMI
   1. Adicionar 6,2 ml de solução de estoque de BrdU para 10 ml de meio RPMI completo.
4. Solução DNase
   1. Prepare 1 mg de ....

Results

Esta metodologia pode ser utilizada para obter uma gama de informações. Alguns aplicativos são descritas aqui.

Avaliação da duração do ciclo celular

Para determinar o tempo necessário para que as células de trânsito através do ciclo celular, as células são colhidas em vários pontos de tempo após o pulso de BrdU. Os intervalos entre as avaliações pode ser adaptado para as células particulares a serem analisadas. Linhas de células hematopoiéticas foram avaliadas a .......

Discussion

A capacidade de analisar o ciclo celular é importante para a compreensão da biologia do cancro e o mecanismo de acção de ambas as drogas e os genes que influenciam a proliferação das células e o crescimento. Embora haja um grande número de ensaios que medem a proliferação celular supostamente, a maioria só fornecem uma medida que indica as células Número presente. Estes incluem ensaios que medem o número de células por visualização direta e contando, atividade metabólica ou concentração de ATP. A principal vantagem de m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de fluxo APC BrdU	BD Biosciences	552598	contém anticorpo BrdU, 7-AAD e tampão BD Cytofix/Cytoperm (referido como tampão de fixação)
Tampão de permeabilização BD Cytoperm Plus	BD Biosciences	561651	referido como tampão de permeabilização
BD Perm/tampão de lavagem	BD Biosciences	554723	referido como tampão de lavagem
DNase	Sigma	D-4513
BD Falcon 12 x 75  mm Tubos FACS	BD Biosciences	352008
BD Pharmingen Stain Buffer	BD Biosciences	554656
BD LSR FORTESSA citômetro de fluxo	BD Biosciences	FORTESSA
Pipetman	Gilson	P2, P20, P100, P1000
RPMI 1.640 sem L-Gln 500 ml	Lonza	12-167F
DPBS	Lonza	17-512F
Soro Fetal Bovino	FisherBiotec	FBS-7100113
L-Glutamina	Sigma	G7513-100ML
5-Bromo-2′-desoxiuridina	Sigma	B5002-1G
Falcon TC 150  cm2 ventilados Frascos	BD Biosciences	355001
Pipetas 25  ml	Greiner	760180
Pipetas Aersol 200  µ l	Pipetas Interpath	24700
Aersol 1  ml	Interpath	24800
Centrífuga	Spintron	GT-175R
CO2 incubadora	Aglutinante	C 150
AF488 anti-histona H3 Fosfato (Ser10)	Sinalização celular	9708S
Fosfo-Chk2 (Thr68) (C13C1) Sinalização celular mAb de coelho		2197S
Fosfo-Chk1 (Ser345) ( 133D3)	Sinalização de Células	2348S
NALM6	DSMZ	ACC-128