Injecções intramusculares Ao longo das placas Motor End: uma abordagem minimamente invasiva para Shuttle Tracers Diretamente em Neurônios Motores

Resumo

A eficácia da captação intramuscular e do transporte retrógrado de moléculas para os neurônios motores correspondentes depende da localização dos locais de injeção em relação às placas terminais motoras (MEPs). Aqui, descrevemos como localizar MEPs nos músculos esqueléticos para otimizar o transporte retrógrado de traçadores para os neurônios motores.

Resumo

Doenças que afetam a integridade da medula espinhal neurônios motores estão entre as doenças neurológicas mais debilitantes. Durante as últimas décadas, o desenvolvimento de vários modelos animais destas doenças neuromusculares forneceu a comunidade científica com cenários terapêuticos diferentes destinadas a retardar ou inverter a progressão destas condições. Tirando partido da maquinaria retrógrada de neurónios, uma destas abordagens tem sido a alvejar os músculos esqueléticos, a fim de genes terapêuticos de transporte em correspondentes neurónios motores da medula espinal. Embora uma vez promissora, o sucesso da abordagem de entrega de tal gene tem sido dificultada pelo número sub-ótimo de neurônios motores transduzidas até agora tem mostrado a ceder. Placas motoras (MPE) são regiões altamente especializados na musculatura esquelética que estão em contato direto sináptica para a medula espinhal α neurônios motores. A este respeito, é importante notar que, até agora, os esforços para retrogradamentegenes transferência para os neurônios motores foram feitas sem referência à localização da região de MEP nos músculos alvo. Aqui, descrevemos um protocolo simples 1) para revelar a localização exata dos deputados na superfície dos músculos esqueléticos e 2) usar esta informação para guiar a entrega intramuscular e transporte retrógrado ideal subsequente de traçadores retrógrados em neurônios motores. Esperamos utilizar os resultados desses experimentos de rastreamentos em novos estudos sobre investigando transporte retrógrado de genes terapêuticos para os neurônios motores da coluna vertebral cabo através da segmentação dos deputados.

Introdução

A perda de controle do movimento voluntário que resulta de condições neurológicas, como a doença do neurônio motor e spinal-, bem como atrofia muscular de Duchenne é uma condição debilitante que tem um impacto elevado e duradouro na vida todos os dias dos indivíduos afetados. Durante a última década, os esforços de pesquisa com o objetivo de parar ou pelo menos retardar os efeitos deletérios dessas doenças neuromusculares tem sido uma prioridade para muitos médicos e cientistas de todo o mundo. A este respeito, a recente geração de modelos animais que imitam estas doenças neuromusculares foi essencial na obtenção de conhecimentos fundamentais sobre os mecanismos fisi....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais descritos aqui cumprido o Cuidado e Comitê de Ética da UNSW Austrália Animal e foram realizados de acordo com o Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho da Austrália regulamentos para a experimentação animal. Todos os procedimentos deste protocolo deve ser realizado de acordo com a exigência do Comitê Animal Care and Ethics relevante.

1. Acetylcholinesterase histoquímico Coloração

1. Preparar a mistura de reacção acetilcolinesterase
   1. Adicionar 290 mg de iodeto de acetiltiocolina a 200 ml de tampão 0,1 M de fosfato (PB). Misturar com um agitador magnético a 900 rpm.
   2. Adic....

Resultados

Coloração histoquímica da acetilcolinesterase revela a localização das placas terminais do motor no sentido da largura dos músculos. A Figura 1 ilustra os resultados de coloração tais realizada em um membro anterior de rato inteiro. Sugere-se para optimizar a concentração da solução de sulfureto de amónio (por ex., 5-7% em vez de 10%), bem como o momento em que o espécimen é imerso na solução se a coloração de fundo não específica sobre as fibras musculares é demasiado excessivo. A Figu.......

Discussão

Segmentação intramuscular e subsequente transferência de transgenes retrógrada terapêuticas para os correspondentes neurónios motores α para o tratamento experimental da condição neuromuscular não é uma nova estratégia. Por exemplo, este método de entrega tem sido usado para retardar a degenerescência neuromuscular em diferentes fases da progressão de ALS em ratinhos e ratos SOD1 ^1,9-12, bem como em ratinhos com SMA ^13. Embora promissora, a eficácia destes cenários de terapia de gene tem sido limit.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fluoro-Gold	Fluorochrome, LLC	Nil	Diluído a 5%
Drummond PCR Micropipets 1-10 µ l	Drummond Scientific	5-000-1001-X10	acompanhado de êmbolos
Acetiltiocolina Iodeto Sigma	Life Science	A5751-25G
Sulfato de Cobre(II) Anidro	Sigma-Aldrich	61230-500G-F
Composto Tissue-Tek O.C.T Sakura	Finetek	25608-930
Glycine	Ajax Finechem	1083-500G
Dextran, Tetrametilrodamina e biotina	Life Technologies	D-3312	Diliuted em água destilada
Isothesia	Provet	ISOF00	1000 mg/g Isoflurano vapor de inalação
Autoclip 9 mm Wound Clips Texas	Scientific Instruments, LLC	205016
Lethabarb Enthanasia Injection	Virbac (Austrália) Pty Ltd.
Solução de formaldeído	Ajax Finechem	A809-2.5L PL
SuperFrost Plus lâminas de vidro	Menzel-Glaser	J1800AMNZ
Sulfeto de amônio	Sigma-Aldrich	A1952	diluído a 10%
Marcain Spinal 0,5% (cloridrato de bupivacaína)	Astrazenca		diluído a 0,25%

LETHA450