Artigo de método

Silenciamento de

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DOI:

10.3791/52849

⸱

12 de agosto de 2015

 ,  , 
1Institute of Biomembranes and Bioenergetics, National Research Council

Neste artigo

Resumo

O silenciamento de genes por siRNA representa uma estratégia experimental conveniente para analisar funções biológicas dependentes de BRCA2 com implicações imediatas para entender melhor a biologia do câncer. Um método para silenciar eficientemente o BRCA2, juntamente com o procedimento experimental para detectar e quantificar alterações na expressão da proteína BRCA2 por immunoblotting em linhagens celulares humanas, é apresentado.

Resumo

O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados ​​celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas "grandes" como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.

Introdução

O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro 3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de desenvolvimento de cancro, BRCA2 que suprimem ou reduzem a função BRCA2 pode tornar as células de cancro mais vulnerável a agentes quimioterapêuticos que provocam danos no DNA 5-7. Cânceres esporádicos apresentam uma baixa taxa de mutações BRCA2 (<3%) que os níveis reduzidos de proteína BRCA2 foram detectados em alguns tipos de câncer, o que sugere que a proteína BRCA2podem ser perdidos durante a tumorigênese em cânceres esporádicos através de mecanismos não-mutacional-dependentes 7,8. Assim, é importante compreender as funções BRCA2 no contexto da biologia do cancro, bem como em outras configurações biológicos.

Uma poderosa ferramenta utilizada para identificar novos funções de um gene em células de mamífero é silenciar a sua expressão. Como um exemplo, o silenciamento BRCA2 expressão numa variedade de células epiteliais normais levou recentemente à identificação de uma nova função de BRCA2 como regulador de resistência anoikis, um passo importante durante a aquisição de célula de cancro invasivo e metastático capacidade 9. Gene silenciamento pode ser alcançado através da introdução nas células ou de interferência (Si) ou ARN pequeno gancho de cabelo curto (sh) moléculas de RNA alvo do gene específico. A alta potência de siRNA e sua facilidade de uso tornam a ferramenta preferencial para silenciar experiências destinadas a ganhar novos insights sobre processos biológicos críticos umnd para identificar novos alvos terapêuticos. No entanto, knockdown eficiente da expressão do gene pode não ser facilmente possível para todos os genes e pode ser altamente variável dependendo do tipo de célula. Porque a diminuição dos níveis de proteína intracelular é o fenótipo mais relevante sob investigação, que é fundamental para quantificar o silenciamento do gene por análise de imunotransf erência do produto do gene. Com este respeito, a proteína BRCA2 apresenta um desafio adicional: sendo uma proteína grande (cerca de 390 kDa), dificuldades técnicas existem para análise bioquímica convencional, incluindo a imunotransferência.

Nós relatamos aqui um protocolo otimizado para silenciamento eficiente do BRCA2 em linhas de células epiteliais humanas e para a detecção rápida e bem sucedida de proteína BRCA2 knockdown por immunoblotting análise.

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Protocolo

1. Prepare soluções siRNA

  1. Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul.
  2. Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
    NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes.

2. Sementeira de linhas celulares epiteliais humanas

  1. Remover o meio de crescimento de linhas celulares epiteliais humanas que crescem como monocamadas celulares em placas de cultura de tecidos numa incubadora humidificada a 37 ° C, 5% de CO 2.
  2. Lavam-se as células na placa uma vez com PBS temperatura ambiente (10 ml de PBS para uma placa de 100 mm).
  3. Para retirar as células a partir da placa,adicionar 2 ml de tripsina a 0,25% / solução de 0,53 mM de EDTA e incubar 3-5 minutos, dependendo do tipo de célula.
  4. Antes de recolher as células destacadas, neutralizar a tripsina por adição de 2 ml de meio de crescimento completo contendo 10% de soro fetal bovino.
  5. Transferir as células para um tubo de 15 ml.
  6. Centrifugar as células a 320-330 x g durante 3 min a 4 ° C num rotor de balde oscilante.
  7. Ressuspender as peletes de células em 5 ml de meio livre de antibióticos.
  8. Contar as células ao microscópio numa câmara de Burker, quer utilizando um sistema automatizado de contagem de acordo com as instruções do fabricante.
  9. Semente as células em placas de 6 poços para ser cerca de 80% confluente após 24 horas (0,5-1 x 10 6 células em 2 ml de meio para cada poço). O número de células óptimas a serem semeadas podem variar dependendo das linhas de células específicas e a taxa de crescimento.
    NOTA: Não adicionar antibióticos a médio neste momento porque os antibióticos irá interferir negativamente com a eficiência de transfection. É muito importante que as células estão na cultura de passagens baixas (<10) para atingir uma elevada eficiência de transfecção siRNA BRCA2.

3. Células de transfecção com siRNA

  1. Vinte e quatro horas após o plaqueamento das células, prosseguir com a primeira rodada de transfecção.
    1. Dilui-se 6 ul de 10 siRNA reagente de transfecção à base de lípidos específicos, em 130 ul de meio de soro reduzido.
    2. Dilui-se 3 ul de siRNA 10 uM (30 pmol) em 130 ul de meio de soro reduzido.
    3. Combinar o siARN diluiu-se com o reagente de transfecção diluído e incubar durante 5-10 min à temperatura ambiente.
    4. Durante a incubação, remover o meio das células e adicionar 2 ml de meio fresco pré-aquecido a 37 ° C (sem antibióticos).
    5. Adicionar 250 ul de complexos de siRNA-reagentes de transfecção para as células (este valor é para um único poço de uma placa de 6 poços).
    6. Incubam-se as células numa incubadora humidificada a 3776; C com 5% de CO 2.
  2. Após 24 horas, prosseguir com a segunda rodada de transfecção por passos 3.1.1-3.1.5 repetindo com a seguinte modificação para a etapa 3.1.2: diluir 5 ul de 10 mM siRNA (50 pmol) em 130 mL de meio de soro reduzido.
    1. Incubam-se as células durante 1-2 dias a 37 ° C antes da análise.
      NOTA: Duas rodadas de transfecções e uso de uma relação de reagente alta siRNA / transfecção na segunda rodada são essenciais para obter alta eficiência do BRCA2 silenciamento.

4. Lisar as células para análise de imunotransferência

  1. Preparar tampão de lise fresco com PBS (pH 7,4) contendo 1% do não iónico, não-detergente desnaturante octilfenoxipolietoxietanol, pirofosfato de sódio a 5 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 10 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 2 mM, 10 ug / ml de leupeptina, 10 ug / ml de aprotinina. Mantê-lo em gelo.
  2. Remover o meio das células e wash-los uma vez com PBS frio (2 ml / poço) na placa. Para evitar qualquer transição PBS, removê-la completamente a partir da placa.
  3. Adicionar 200 ul de tampão de lise a cada poço.
    NOTA: Se as células têm de ser usado também para outros ensaios, trypsinize as células tal como descrito no passo 2,1-2,6 e ressuspender as células em tampão / meio apropriado de acordo com a aplicação a ser utilizada.
  4. Rodar suavemente a placa para distribuir uniformemente o tampão de lise e incubar durante 15 min a 4 ° C num rotor.
  5. Recolhe-se o lisado celular num tubo de microcentrífuga em gelo usando um raspador de células.
  6. Centrifugar a 17.900 xg durante 25 min a 4 ° C e recolher o sobrenadante num novo tubo.
  7. Medir a concentração de proteína usando um ensaio de proteína disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.

Análise immunoblotting 5. BRCA2

  1. Preparar o tampão de corrida, diluindo 50 ml de 20x de Tris-Acetato de SDS execução bpode ser prejudicado (Tricina 50 mM, 50 mM Tris Base, 0,1% de SDS, pH 8,24) com 950 ml de água destilada.
  2. Preparar a amostra como se segue: adicionar 15? G de lisado celular total, 5 uL de tampão de amostra 4x contendo sulfato de dodecilo de lítio, a pH 8,4, 2 mL de amostra de 10x agente redutor (DTT 0,5 M) e tampão de lise para um volume final de 20 ul.
    NOTA: Este protocolo permite a detecção de BRCA2 em linhas de células normais, também quando se utiliza uma menor quantidade de proteínas totais (inferior a 5 ug).
  3. Desnaturar amostras a 55 ° C durante 10 min.
    NOTA: É fundamental usar 55 ° C. Desde que a proteína BRCA2 é termossensível 11, as temperaturas de desnaturação mais elevadas resultam em perda consistente dos intacto de comprimento completo (390 kDa) da proteína BRCA2.
  4. Defina-se a câmara de electroforese de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Coloque as amostras e 10 ul de alto peso molecular pré-corados padrão de proteína em um gel precasted (Tris-Acetato de 3-8%) e executado em 120 V para aba 2 horas 12. Parar a corrida eletroforética antes do 55 kDa marcador azul deixa o gel precasted.
  6. Preparar o tampão de transferência com 50 ml de tampão de transferência 20x, 100 ml de metanol a 100% e 850 ml de água.
  7. Activar a membrana de PVDF (tamanho do poro de 0,45 um) por imersão em 100% de metanol durante 5 minutos, enxaguar com água destilada e equilibrar em tampão de transferência, pelo menos, durante 5 min. Soak as esponjas do aparelho de transferência com tampão de transferência a 4 ° C até à sua utilização.
  8. Quando a corrida eletroforética é longo, montar o sanduíche na pilha de transferência na seguinte ordem (bottom-up): três esponjas saturadas em tampão de transferência, uma folha de papel 3MM grau saturado em tampão de transferência, o gel, membrana PVDF ativado, um 3MM folha de papel grau saturado em tampão de transferência, três esponjas saturado em tampão de transferência 13,14. Colocar a pilha no aparelho e as proteínas de transferência em 350 mA durante 4 horas a 4 ° C ou a 180 mA durante a noite a 4 ° C.
    NOTA: Ser BRCA2 uma proteína muito grande, é crucial para estender o tempo de transferência de 1 hora (tal como sugerido pelo fabricante, e a maioria dos protocolos de transferência) a 4 horas ou durante a noite para assegurar a transferência completa de proteínas de alto peso molecular. Além disso, devido ao longo tempo de transferência, que é essencial para realizar o blotting numa sala fria a 4 ° C para minimizar o sobreaquecimento e facilitar a desmontagem sanduíche. Sistemas de transferência semi-secas não são bons para a transferência de grandes proteínas.
  9. Após a transferência, lavar a membrana com TBS, bloqueá-lo durante 1 hora à temperatura ambiente em TBS-Tween 0,25% (TBS-T) contendo 5% de leite seco sem gordura e a sonda durante a noite a 4 ° C com 30 ul de anti-anticorpo policlonal de coelho BRCA2 ( 200 ug / ml), diluído em 9 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro [1: 300 (v / v)] de diluição.
  10. Lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T, em seguida, o filtro incubar durante 1 hora com 1 ml de peroxidase de rábano conjugado com anti-anticorpo secundário de coelho diluído em 10 ml de TBS-T + 5% de leite em pó magro. Em seguida, lava-se a membrana três vezes (10 minutos cada) com TBS-T.
  11. Realizar imunodetecção por ECL para revelar proteína BRCA2 usando quimioluminescência aumentada (ECL) de Reagente de Detecção de Western Blotting, seguindo as instruções do fabricante. Visualize bandas imunoquimioluminométricos sobre filmes de alta resolução ECL.
  12. Realizar imunodetecção com um anticorpo para um gene de manutenção, como β-tubulina (55 kDa), no mesmo filtro como controlo de carga, utilizando um anticorpo monoclonal para β-tubulina diluído a 1: 1000 (10 ul de anticorpo anti-tubulina em 10 ml de TBS-T + 5% de leite seco não gordo) durante 1 h à TA. Lavar e incubar o anticorpo secundário como descrito para BRCA2 (5,10-5,11), excepto na utilização de peroxidase de rábano conjugado com anti-ratinho em vez do anticorpo secundário anti-coelho.
  13. Adquirir uma imagem digital dos filmes impressionados com bandas imunoquimioluminométricos e analisar a intensidade da banda por imagem dedicada software de análise (por exemplo,., ImageJ).

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Resultados

Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização de apenas uma rod...

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Discussão

Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma 3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui para silenciar e anal...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de mérito FIRB-RBNE08YFN3_005 e RBNE08HWLZ_012, e pelo Ministério da Economia e Finanças italiano ao CNR para o projeto "FaReBio di Qualità".

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
BRCA2 siRNADharmaconL-003462-00SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA
Ctrl siRNADharmacon  D-001810-10-05ON-TARGETplus Reagente
de RNAiMAX de Lipofectamina Não-alvo para Piscina Life Technologies13778075Reagente de Transfecção
OPTI-MEM I Soro Reduzido MédioLife Technologies31985-070Meio para procedimento de transfecção
NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel pré-moldadoLife TechnologiesEA0378Gel para eletroforese de proteínas
NuPAGE LDS Tampão de amostra Life TechnologiesNP0007Reagente para eletroforese de proteínas
NuPAGE Agente redutor de amostras (10x)Life TechnologiesNP0004Reagente para eletroforese de proteínas
NuPAGE AntioxidantLife TechnologiesNP0005Reagente para eletroforese
de proteínas HiMark Pre-stained protein standardLife TechnologiesLC5699Marcador pré-corado para gel eletroforese
XCell SureLoc Mini-Cell  SystemLife TechnologiesEI0002Equipamento para eletroforese/transferência de proteínas
NuPAGE Tris-Acetato SDS Running BufferLife TechnologiesLA0041Reagente para Western blotting
Membrana PVDFReagente MilliporeIPVH00010para Western blotting
NuPAGE Transfer BufferLife TechnologiesNP0006-1Reagente para Western blotting
BRCA2 H-300 anticorpo policlonal de coelhoSanta Cruz Biotechnologysc-8326:300 diluição
Beta-tubulina anticorpo monoclonalSigma AldrichT4026-100ULdiluição 1:1.000
Leite em pó desnatadoSigma Aldrich70166Reagente para Western blotting
Tween-20Sigma AldrichP1379Reagente para Western blotting
SuperSignal West Pico/Femto Substrato QuimioluminescentePierce Thermo Scientific34080/34096Sistema de Quimioluminescência
Células PNT1ASIGMA Aldrich (para ECACC)95012614PNT1A humano, epitélio de próstata normal imortalizado com células SV40
NthySIGMA Aldrich (para ECACC)90011609Nthy-ori 3-1 Linha celular humana, células epiteliais foliculares da tireoide
Proliferação celular Kit I (MTT)Kit 11465007001 Rochepara ensaios de proliferação celular
1

Referências

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Silenciamento de BRCA2Transfec o de siRNAWestern BlottingDetec o de Prote nasPrepara o de Lisado CelularProte nas de Alta Massa MolecularAn lise de Supressor de TumorEfici ncia de Knockdown G nicoOtimiza o de ImmunoblottingPropor o de Transfec o de siRNA

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