O silenciamento de genes por siRNA representa uma estratégia experimental conveniente para analisar funções biológicas dependentes de BRCA2 com implicações imediatas para entender melhor a biologia do câncer. Um método para silenciar eficientemente o BRCA2, juntamente com o procedimento experimental para detectar e quantificar alterações na expressão da proteína BRCA2 por immunoblotting em linhagens celulares humanas, é apresentado.
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Neste artigo
Resumo
Resumo
O silenciamento do BRCA2 proteína supressora de tumor e sua detecção por análises bioquímicas convencionais representam um grande desafio técnico, devido ao grande tamanho da proteína BRCA2 humano (cerca de 390 kDa). Relatamos modificações de transfecção e immunoblotting protocolos padrão de siRNA para silenciar BRCA2 e detectar a proteína humana endógena BRCA2, respectivamente, em linhas de células epiteliais humanas. Passos-chave incluem um elevado siRNA à relação de reagente de transfecção e duas rodadas subseqüentes de transfecção siRNA dentro do mesmo experimento. Usando estas e outras modificações introduzidas no protocolo padrão que consistentemente conseguir mais do que 70% silenciamento do gene BRCA2 humano, tal como avaliado por análise de imunotransf erência com anticorpos anti-BRCA2. Além disso, a desnaturação dos lisados celulares a 55 ° C em vez da convencional de 70-100 ° C e outras optimizações técnicas do procedimento de imunotransferência permitir a detecção de proteína intacta, mesmo BRCA2 when quantidades muito pequenas de material de partida estão disponíveis ou quando os níveis de expressão de proteína BRCA2 são muito baixos. Silenciamento eficaz de BRCA2 em células humanas oferece uma estratégia terapêutica valiosa para interromper a função BRCA2 em células intactas com BRCA2, incluindo as células tumorais, para examinar novas vias moleculares e as funções celulares que podem ser afectadas por mutações em tumores BRCA2 patogénicos. Adaptação deste protocolo para silenciamento e análise de outras proteínas "grandes" como BRCA2 eficiente deve ser facilmente alcançável.
Introdução
O gene BRCA2 (cancro da mama susceptibilidade gene-2) codifica para uma proteína supressora de tumor que desempenha um papel crucial na reparação de DNA quebras de cadeia dupla através da regulação da função da enzima recombinase Rad51 1. BRCA2 também tem sido implicado na modulação da transcrição e o controlo do ciclo celular em dois. Mutações da linha germinativa no gene BRCA2 induzir uma autossómica dominante susceptibilidade para cancro da mama e do cancro do ovário em mulheres e cancro da próstata em homens, assim como a predisposição para outros tipos de cancro 3,4. No entanto, apesar do aumento do risco de des....
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Protocolo
1. Prepare soluções siRNA
- Ressuspender 5 nmol de embaralhada (Ctrl) e 5 nmol de BRCA2 siRNA peletes secos em 100 ul de água isenta de RNase (concentração final de siRNA: 50 uM). Este é o banco de siRNA e deve ser armazenado a -20 ° C em alíquotas de 10 ul.
- Tomar uma aliquota de 10 ul de estoque de siRNA e adicionar 40 ul de água isenta de RNase para obter a solução de trabalho a 10 ^ M de siARN. Esta diluição deve ser armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
NOTA: A solução de trabalho siRNA não devem ser submetidos a congelamento / descongelamento mais de 3 vezes.
2. Sementeira de linhas celular....
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Resultados
Antes de prosseguir com um ensaio biológico / bioquímicas para examinar o efeito de silenciamento BRCA2 em funções celulares, o primeiro passo é para confirmar a especificidade do silenciamento usando um siRNA mexidos (não-alvo siARN) lado a lado com BRCA2 siRNA (Figura 1A ). É importante a realização de um segundo turno de transfecção com o siRNA um elevado rácio de siRNA / transfecção para obter uma elevada eficiência de silenciamento BRCA2. Com efeito, a realização de apenas uma rod.......
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Discussão
Porque mutações germinativas do gene BRCA2 chumbo ao aumento do risco de diversos tipos de câncer, incluindo o câncer feminino e masculino de mama, câncer de ovário, câncer de próstata, câncer de pâncreas e melanoma 3,4, uma série de estudos têm sido realizados para compreender a função biológica da proteína BRCA2. A maioria destes estudos são baseados em genética, principalmente devido a dificuldades técnicas na análise de uma proteína gigante como BRCA2. O método descrito aqui para silenciar e anal.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas de mérito FIRB-RBNE08YFN3_005 e RBNE08HWLZ_012, e pelo Ministério da Economia e Finanças italiano ao CNR para o projeto "FaReBio di Qualità".
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| BRCA2 siRNA | Dharmacon | L-003462-00 | SMARTpool: ON-TARGETplus BRCA2 siRNA |
| Ctrl siRNA | Dharmacon | D-001810-10-05 | ON-TARGETplus Reagente |
| de RNAiMAX de Lipofectamina Não-alvo para Piscina | Life Technologies | 13778075 | Reagente de Transfecção |
| OPTI-MEM I Soro Reduzido Médio | Life Technologies | 31985-070 | Meio para procedimento de transfecção |
| NuPAGE Tris-Acetato 3-8% 1,5 mm Gel pré-moldado | Life Technologies | EA0378 | Gel para eletroforese de proteínas |
| NuPAGE LDS Tampão de amostra | Life Technologies | NP0007 | Reagente para eletroforese de proteínas |
| NuPAGE Agente redutor de amostras (10x) | Life Technologies | NP0004 | Reagente para eletroforese de proteínas |
| NuPAGE Antioxidant | Life Technologies | NP0005 | Reagente para eletroforese |
| de proteínas HiMark Pre-stained protein standard | Life Technologies | LC5699 | Marcador pré-corado para gel eletroforese |
| XCell SureLoc Mini-Cell System | Life Technologies | EI0002 | Equipamento para eletroforese/transferência de proteínas |
| NuPAGE Tris-Acetato SDS Running Buffer | Life Technologies | LA0041 | Reagente para Western blotting |
| Membrana PVDF | Reagente Millipore | IPVH00010 | para Western blotting |
| NuPAGE Transfer Buffer | Life Technologies | NP0006-1 | Reagente para Western blotting |
| BRCA2 H-300 anticorpo policlonal de coelho | Santa Cruz Biotechnology | sc-8326 | :300 diluição |
| Beta-tubulina anticorpo monoclonal | Sigma Aldrich | T4026-100UL | diluição 1:1.000 |
| Leite em pó desnatado | Sigma Aldrich | 70166 | Reagente para Western blotting |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | Reagente para Western blotting |
| SuperSignal West Pico/Femto Substrato Quimioluminescente | Pierce Thermo Scientific | 34080/34096 | Sistema de Quimioluminescência |
| Células PNT1A | SIGMA Aldrich (para ECACC) | 95012614 | PNT1A humano, epitélio de próstata normal imortalizado com células SV40 |
| Nthy | SIGMA Aldrich (para ECACC) | 90011609 | Nthy-ori 3-1 Linha celular humana, células epiteliais foliculares da tireoide |
| Proliferação celular Kit I (MTT) | Kit 11465007001 Roche | para ensaios de proliferação celular |
Referências
- Thorslund, T., West, S. C. BRCA2: a universal recombinase regulator. Oncogene. 26, 7720-7730 (2007).
- Yoshida, K., Miki, Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage. Cancer Sci. 95<....
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Reimpressões e permissões
