Artigo de método

Simultâneo Ex vivo Teste Funcional de Dois retinas por In vivo Sistema Eletrorretinograma

DOI:

10.3791/52855

⸱

6 de maio de 2015

 , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, Washington University in St. Louis

Neste artigo

Resumo

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Ex vivo O ERG pode ser usado para registrar a atividade elétrica das células da retina diretamente de retinas intactas isoladas de animais ou humanos. Demonstramos aqui como os sistemas ERG in vivo comuns podem ser adaptados para gravações de ERG ex vivo, a fim de dissecar a atividade elétrica das células da retina.

Resumo

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Um sinal de eletrorretinograma (ERG) in vivo é composto por vários componentes sobrepostos originados de diferentes tipos de células da retina, bem como ruído de fontes extra-retinianas. Ex vivo O ERG fornece um método eficiente para dissecar a função das células da retina diretamente de uma retina isolada intacta de animais ou olhos de doadores. Além disso, o ERG ex vivo pode ser usado para testar a eficácia e segurança de potenciais agentes terapêuticos no tecido da retina de animais ou humanos. Mostramos aqui como os sistemas ERG in vivo disponíveis comercialmente podem ser usados para realizar gravações de ERG ex vivo a partir de retinas isoladas de camundongos. Combinamos as unidades de estimulação de luz, eletrônicas e de aquecimento de um sistema in vivo padrão com suporte de amostra personalizado, sistema de perfusão controlado por gravidade e blindagem contra ruído eletromagnético para gravar sinais ERG ex vivo de baixo ruído simultaneamente de duas retinas com o software de aquisição incluído no mercado in vivo Sistemas. Além disso, demonstramos como usar esse método em combinação com tratamentos farmacológicos que removem componentes específicos do ERG para dissecar a função de certos tipos de células da retina.

Introdução

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Electrorretinograma (ERG) é uma técnica bem estabelecida que pode ser utilizado para registar a actividade eléctrica da retina desencadeadas pela luz. O sinal é gerado principalmente ERG por mudanças de tensão provocadas por correntes radiais (ao longo do eixo dos fotorreceptores e células bipolares) que flui no espaço extracelular resistiva da retina. O primeiro sinal ERG foi gravado em 1865 por Holmgren a partir da superfície de um olho de peixe 1. Einthoven e Jolly 1908 2 dividido a resposta do ERG ao aparecimento de luz em três ondas diferentes, denominado A, B, e C-ondas, que são agora conhecidos, principalmente, para reflectir a actividade de fotorreceptores, em células bipolares, e epitélio pigmentado células, respectivamente 3-8. ERG pode ser gravado a partir dos olhos de animais anestesiados ou humanos (in vivo), de olho preparação isolada 9, em frente isolado retina intacta (ex vivo) ou através 3,10-15 camadas da retina específicas com microeletrodos (localERG) 4,16. Destes, in vivo ERG é atualmente o método mais utilizado para avaliar a função da retina. É uma técnica não invasiva que pode ser utilizada para fins de diagnóstico ou para seguir a progressão das doenças da retina em animais ou pacientes. No entanto, in vivo registos de ERG produzir um sinal complexo com vários componentes sobrepostos, muitas vezes contaminados por ruído extraocular fisiológico (por exemplo, a respiração e da actividade cardíaca).

ERG local pode ser utilizado para gravar o sinal através de camadas específicas da retina, mas é mais invasiva e tem uma menor relação de sinal-para-ruído (SNR) em relação a outras configurações de gravação ERG. ERG local também é tecnicamente exigente e requer equipamento caro (por exemplo, microscópio e micromanipuladores). Transretinal ERG do intacta, isolado retina (ex vivo ERG) oferece um compromisso entre os métodos in vivo e ERG locais permitindo estável e higgravações h SNR de retinas intactas de animais ou seres humanos 17. Recentemente, este método tem sido utilizado com êxito para estudar a função de fotorreceptores cone e da haste em mamíferos, primatas e humanos retinas 18-20. Além disso, devido à ausência de epitélio pigmentar da retina ex vivo, o componente do sinal de ERG c-onda positiva é removida e um componente lento PIII negativos proeminentes é revelado nas gravações ex vivo. O componente PIII lenta tem sido demonstrado que se originam a partir da actividade de células da glia de Müller na retina 21-23. Assim, método ex vivo ERG também poderia ser usado para estudar as células Müller na retina intacta. Vários estudos também demonstraram que os registos de ERG ex vivo pode ser usada para medir a concentração de agentes farmacológicos em torno da retina 24 e testar a segurança e eficácia de drogas 25-27.

Comercial múltipla em sistemas in vivo estão disponíveis eusado em muitos laboratórios que não têm necessariamente extensa experiência eletrofisiologia. Em contraste, ex vivo dispositivos não estavam disponíveis até recentemente 17 e, como resultado muito poucos laboratórios estão actualmente a tirar partido desta poderosa técnica. Seria benéfico para fazer gravações ex vivo ERG disponível para mais laboratórios, a fim de aumentar o nosso conhecimento sobre a fisiologia da retina e patologia, e para desenvolver novas terapias para doenças ofuscante. Nós demonstramos aqui um dispositivo simples e acessíveis ex vivo ERG 17 e mostram como ele pode ser utilizado em combinação com vários sistemas in vivo ERG disponíveis comercialmente para gravar e sinalização mediada rod- de cone (a- e b-ondas) e a função de células de Müller (retardar PIII) de íntegras do tipo selvagem do rato retinas.

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Protocolo

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Todos os protocolos experimentais foram de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Comitê de Estudos de Animais institucional na Universidade de Washington.

1. Preparação de perfusão e Porta-amostra

  1. Preparar a solução de perfusão para a retina fresco no dia da experiência. Use água destilada e deionizada. Use um dos três seguintes soluções.
    1. Prepara-bicarbonato contendo 'solução (1 L): 1 garrafa de Ames Ames meios e 1,9 g de NaHCO 3,
    2. Preparar a solução de Locke (em mM): 112,5 de NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 de CaCl2, 10,0 de HEPES, 20,0 NaHCO3, 3,0 Na succinato, 0,5 Na glutamato, 0,02 de EDTA e 10,0 de glucose, 0,1% de vitaminas MEM e amino ácidos
    3. Preparar solução de Ringer tamponada com HEPES (em mM): 133,3 de NaCl, 3,3 KCl, 2,0 MgCl2, 1,0 de CaCl2, 10,0 de glucose, 0,01 de EDTA, 12,0 HEPES, pHajustado para 7,5 com ~ 5,8 mL de NaOH 1 M, adicionar 0,72 g / L de meio de cultura de Leibovitz L-15. Use 20 - 50 pM de DL-AP4 e 50 - 100? M BaCl2 para isolar a resposta de fotorreceptores com qualquer meio de perfusão.
  2. Preparar a solução de eléctrodos de 28 (em mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl2 2,4, CaCl2 1,2, HEPES 3, 0,01 de EDTA e ajustar o pH a 7,4-7,5 com NaOH. Eléctrodo solução pode ser armazenada à temperatura ambiente durante vários meses.
  3. Preparar e testar o suporte da amostra.
    1. Cole papel de filtro preto / cinza em cima das cúpulas da parte inferior do suporte da amostra (ver Figura 1A). Espalhe de dois componentes de cola epóxi 5 min cuidadosamente em torno dos bordos das partes superiores planas das cúpulas. Se necessário, faça-o sob dissecção microscópio.
    2. Aguarde até que a cola estiver quase seco (cerca de 4 min) e pressione o filtro de papel nas cúpulas usando um item de plano. Papel de filtro de cola, pelo menos, um dia antes da experiência. Opapel de filtro pode ser utilizada várias vezes, mas deve ser substituído após um mês de gravações. Use etanol a 70% para limpar cuidadosamente cúpulas de qualquer resíduo de cola antes de instalar o papel de substituição.
    3. Preencha os canais de eletrodos com uma solução de eletrodo tentando evitar as bolhas de ar e parafuso eletrodos de pelotização fechados com um adaptador de rosca para os canais de eletrodo (ver figuras 1A e B). Ligar as peças superior e inferior do suporte da amostra com quatro parafusos e encher as linhas de perfusão com solução de eléctrodo.
    4. Medir a resistência e tensão entre os condutores de cada par de eléctrodos usando um multímetro (Figura 1B). A resistência deve ser inferior a 100 Ωk ea tensão abaixo de 10 mV se os canais estão sem bolhas e os eletrodos estão em boas condições.
  4. Pour 400-700 ml de meio de perfusão no frasco de vidro. Separadas mais 300 ml para ser utilizada na dissecção das retinas e srasgou-o em uma geladeira. Definir a tubagem de perfusão no bloco permutador de calor e colocar o bloco de pré-aquecido sobre a placa de aquecimento (ver Figura 1D).
  5. Coloque o frasco com uma tampa que tem ligações para o CO 2 / O 2 gás (se Ames ou Locke é usado) e para a tubagem de perfusão (ver Figura 1D). Pré-aqueça o frasco com a mídia para 37 ° C e coloque-o sobre a placa de aquecimento ou na parte superior da unidade de estímulo de luz no banho-maria regulado para 37-39 o C 17.
    1. Primeiro as linhas de perfusão, preenchendo-as com meios de perfusão para iniciar o fluxo orientado a gravidade.
      1. No sistema LKC, colocar a garrafa no topo da unidade estimulador 17 para proporcionar um escoamento gravitacional significativa que é, então, ajustado por reguladores de caudal sem ser influenciado pelo nível de redução da solução de perfusão na garrafa durante a experiência.
      2. No sistema Ocuscience, coloque o perfusion garrafa no interior da gaiola de Faraday, de modo a minimizar o ruído e colocar linhas de saída longo de perfusão de suporte da amostra (ver passo 2.8) bem abaixo do nível do suporte da amostra (e do frasco de perfusão) para aumentar a movimentação gravitacional da solução. Proteger essas linhas de saída e ligue a blindagem à terra do amplificador para impedir o acoplamento do ruído eletromagnético ao sinal ERG.
  6. Ajustar a perfusão de 3-5 ml / min usando reguladores de caudal. Conecte-se 5% de CO2 / 95% de O 2 de gás de um cilindro com regulador apropriado e ajustar a taxa de fluxo para garantir borbulhamento constante da mídia na garrafa através de uma pedra de ar.

Preparação 2. Amostra

  1. Montar instrumentos de dissecção limpas e nítidas incluindo microtesoura reta de lâmina, um ou dois 45 o pinças, lâmina de barbear e um pedaço retangular de papel de filtro.
  2. Despeje cerca de 200 ml de perfu friosion solução numa placa de Petri grande, de modo que toda a parte inferior do suporte de amostra (incluindo as cúpulas) pode ser imersa na solução. Este passo torna-se importante ao montar as retinas sobre as cúpulas (veja o passo 2.6). Embora algumas soluções foram desenvolvidas para ser saturada com carbogéneo (5% de CO2 / 95% de O 2), isto não é essencial para os fins de dissecação e não foi feito nas experiências descritas aqui.
  3. Para uma experiência típica, manter os animais em 12/12 horas escuro ciclo de luz / escuridão e-adaptá-los para 6-12 horas antes das gravações. Eutanásia do animal por inalação de CO2 seguido por deslocamento cervical sob luz vermelha ofuscante e fazer todas as seguintes operações sob luz vermelha ou IR dim (usar por exemplo, filtro vermelho na frente da fonte de luz do microscópio).
    1. Puxe os olhos para fora usando uma pinça e colocá-los na mídia. Coloque um olho de cada vez em um pequeno pedaço de papel (por exemplo, alguns papel de filtro regular) e fazer comoiluminado é aproximadamente o nível de ora serrata, mantendo o olho com uma pinça (isto é feito fora da solução aqui).
  4. O corte ao longo da ora serrata (ou mais perto do equador do olho) com microtesouras e remover a córnea e da lente. Coloque o copo olho na mídia frio na grande placa de Petri e repita o mesmo procedimento com o outro olho.
  5. Corte de uma pequena incisão da parte superior da taça dos olhos no sentido do nervo óptico, mantendo a tesoura entre a retina e esclera, a fim de manter a retina como intacta quanto possível. Aderência da esclerótica de ambos os lados da incisão usando duas pinças e puxar as pinças longe um do outro para separar a retina.
    1. Cortar o nervo óptico e tentar isolar a retina com uma quantidade mínima de contacto físico com a superfície distai. RPE, na sua maioria separar automaticamente a partir da retina durante o processo de dissecção. É mais importante para evitar a perturbação mecânica da retina do que para realizar odissecção rapidamente, em geral, as retinas podem ser incubadas pelo menos 30 minutos na solução, sem efeitos significativos sobre as propriedades de resposta.
  6. Monte as retinas sobre as cúpulas de suporte para amostra (Figura 1C). Mergulhe a parte inferior do suporte da amostra na placa de Petri com as retinas dissecadas. Deslize da retina, fotorreceptores lado (a superfície convexa da retina isolado) para cima, por cima da cúpula e levantar o suporte da amostra, de modo que a retina atribui no papel de filtro. Repetir o procedimento para o outro retina.
  7. Secar a placa suporte com cuidado para evitar interferência elétrica entre as retinas, bem como o ruído eo sinal de manobra. O suporte de amostras tem anéis de vedação em torno das cúpulas parte do fundo para impedir que a solução derrame entre a parte inferior e superior das peças do suporte, bem como para ajudar o isolamento eléctrico dos fotorreceptores e células ganglionares lados das retinas individuais. Fixe a parte superior do suporte com os quatro parafusos (ver Figura 1B) e encher os canais de perfusão com solução de perfusão utilizando uma seringa e uma agulha.
  8. Transferir o porta-espécime ao lado do bloco do permutador de calor e conectar as linhas de entrada e saída de perfusão para o suporte da amostra (Figura 1D). Ligar os eléctrodos ao amplificador ERG (top eletrodos ligar para o chão / menos pino no amplificador) e anexar a unidade estimulador / controle sobre o suporte da amostra usando um adaptador ou deslizar a almofada de aquecimento na unidade estimulador dependendo de qual in vivo ERG sistema é utilizado.

3. Gravações

  1. Configurar as definições do amplificador e de estímulo usando o software do sistema in vivo. Defina a freqüência de aquisição a um valor entre 1 e 10 kHz e filtragem passa-baixo a 300 Hz. Não usar a filtragem passa-alta. Use 60 Hz (ou 50 Hz na Europa) entalhe filtro, se necessário.
  2. Ficha de linha de base sem estimulação luminosa e sagacidadeh estimulação dim (eg., luz verde de -35 dB ou 0,3 mCd sm-2) para testar a boa conexão elétrica entre os eletrodos e amostra retina. Espera 10-20 min antes de iniciar a recolha de dados de modo a que a temperatura e a função da retina alcançar um estado estável.
    1. Escolha parâmetros de estímulo de acordo com qualquer experiência específica e comece a coleta de dados. Por exemplo, usar a luz verde de -40 até 0 dB ou de 0,1 até 1000 mCd sm -2 para uma família de resposta escotópica. Use cerca de 2 a 3 unidades de log mais brilhante flashes em gravações fotópicas onde hastes têm de ser suprimida pela luz de fundo (3-30 Cdm -2) ou um flash sonda (sm cerca de 1,3 -2 Cd = 1 dB, veja a Figura 3).
    2. No entanto, lembre-se que os valores exatos de intensidade de luz pode ser um pouco dependente de sua calibração do sistema e as condições experimentais. Como uma regra geral, as intensidades da escala para baixo por 5-10 vezes, em comparação com in vivo gravações ao usar luz verde 17. Uma tampa preta com aberturas acima retinas (incluído no sistema adaptador comercial) pode ser usada para reduzir a dispersão de luz no suporte de amostras e facilitar estimulação homogénea e igual de ambas as retinas pela esfera Ganzfeld da comercial em sistemas in vivo.
      NOTA: Para gravações de retina de adaptação ao escuro, as intensidades de flashes de teste utilizadas numa experiência de branqueamento típico apenas uma fracção insignificante do pigmento, de modo que a falta de regeneração orientada para o EPR não é um problema. Além disso, foi anteriormente demonstrado que a regeneração cone de pigmento podem ainda ter lugar na retina isolada através do ciclo visual célula Müller 20.
  3. Como experiências durar tipicamente de 30 minutos até várias horas, monitorizar a deriva da linha de base, o nível de ruído e estabilidade de resposta durante a experiência como alterações na estes podem indicar problemas técnicos.
    NOTA: Aumento ou diminuição de ruídoamplitudes de resposta d pode indicar bolhas de ar nos canais de perfusão ou eletrodos, muito baixa ou alta temperatura, a solução de vazamento / derramamento ou deslocamento da retina.

4. Limpeza

  1. Retire o suporte da amostra a partir das linhas de perfusão, abra-o e lave as retinas do papel de filtro. Retirar os eléctrodos e lavá-los com água destilada (não use etanol). Limpar o suporte de amostras (incluindo os canais de perfusão) com etanol e / ou água destilada. Tubo de perfusão Lave cuidadosamente com etanol> 70%.
  2. Lavar o frasco de perfusão com água destilada (não use detergentes). O etanol pode também ser usado para limpar o frasco.

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Resultados

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Foram registrados respostas de flash a partir do tipo selvagem de adaptação ao escuro (WT) C57BL / 6 de rato retinas seguindo os protocolos experimentais descritos acima e ilustrados na Figura 1, usando diferentes soluções para perfusão padrão (Figura 2). As formas de onda de resposta e cinética, bem como sensibilidade dos bastonetes apareceu semelhante em Ames e mídia de Locke (Figura 2A e B). Por outro lado, sob a solução de Ringer tamponada com HEPES...

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Discussão

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Nós demonstramos aqui os passos críticos para a obtenção de alta qualidade ex gravações vivo ERG simultaneamente a partir de duas rato retinas isoladas usando componentes in vivo do sistema ERG juntamente com um adaptador vivo ex ERG. Neste estudo, ambas as retinas perfundidos a partir do animal com a mesma solução (ou Ames, Locke ou riscas) mas também é possível perfundir cada retina com uma solução diferente, por exemplo, para fins de teste de drogas. Os passos mais i...

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Divulgações

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Universidade de Washington em St. Louis tem um acordo de licença com Xenotec, Inc. e pode receber royalties da venda do adaptador ex vivo.

Agradecimentos

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Este trabalho foi financiado pelo NIH subvenções EY019312 e EY021126 (VJK), EY002687 ao Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais na Universidade de Washington, e pela Research para prevenir a cegueira.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
In vivo Sistema ERGOcuScienceHMsERGwww.ocuscience.us/id77.html
In vivo Sistema ERGLKC TechnologiesUTAS-E 3000www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html
Ex adaptador vivoadaptador OcuScienceEx VIVO ERGwww.ocuscience.us/id107.html
Microscópio de dissecaçãoNorth Central InstrumentsLeica M80Pode usar qualquer marca
emissor de IROpto Diode Corp.OD-50Lwww.optodiode.com
Prowler Escopos de Visão NoturnaB.E. Meyers Electro OpticsD4300-IProduto de grau militar.
Filtro vermelhoRosco LaboratoriesRoscolux #27 Medium RedPode ser usado em vez do sistema IR
Luz vermelhaOcuScienceERGX011www.ocuscience.us/catalog/i29.html
MicroscissorsWPI, Inc.500086www.wpiinc.com/
Dumont pinças #WPI, Inc.14101
Lâminas de barbearMicroscopia Eletrônica Ciências72000www.emsdiasum.com
ScaleMetler ToledoAB54-S/FACTa href="http://www.sigmaaldrich.com/">Pode usar qualquer marca
medidor de pH e eletrodoBeckman CoulterpHI 350Pode usar qualquer marca
NaClSigma-AldrichS7653Pode usar qualquer marca
KClSigma-Aldrich60129Pode usar qualquer marca
MgCl2Sigma-Aldrich630201.0 M solução
CaCl2Sigma-Aldrich211141.0 M solução
EDTASigma-Aldrich431788Pode usar qualquer marca
HEPESSigma-AldrichH3375Pode usar qualquer marca
Bicarbonato de SódioSigma-AldrichS6297Pode usar qualquer marca
Ames mediumSigma-AldrichA1420Pode usar qualquer marca
BaCl2Sigma-AldrichB0750Pode usar qualquer marca
DL-AP4Tocris Bioscience101Pode usar qualquer marca
Sal dissódico de ácido succínicoSigma-Aldrich224731Pode usar qualquer marca
Ácido L-glutâmicoSigma-AldrichG2834Pode usar qualquer marca
D-(+)-GlicoseSigma-AldrichG7528Pode usar qualquer
marca Leibovitz meio de cultura L-15Sigma-AldrichL4386Pode usar qualquer marca
de vitaminas MEMSigma-AldrichM6895
Aminoácidos MEMSigma-AldrichM5550
CarbogenAirgasUN31565% CO2
5 <

Referências

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