A "Patient-Like" Orthotopic Singênico Rato Modelo de carcinoma hepatocelular Metástase

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um dos cânceres mais letais, com prognóstico ruim e baixa expectativa de vida. Quase todas as mortes relacionadas ao câncer são devidas à disseminação metastática da doença do órgão de origem para outros órgãos distantes^2-6. A progressão do CHC é um processo complexo. Portanto, ser capaz de modelar o microambiente tumoral que é naturalmente encontrado no CHC metastático em modelos animais pode ser uma maneira bem-sucedida e útil de revelar mecanismos relevantes em humanos. ⁷Infelizmente, os mecanismos da metástase do câncer ainda não estão claros. Portanto, há necessidade de estabelecer modelos animais que nos permitam elucidar os mecanismos moleculares subjacentes às metástases de cânceres como o CHC^3,5.

Os sistemas de modelo de camundongo são uma abordagem muito útil para delinear mecanismos e avaliar novas estratégias para o tratamento de cânceres humanos metastáticos^5,8. Os vários sistemas de modelos de camundongos que existem atualmente são uma prova dos esforços dos pesquisadores para retratar corretamente a complexidade da doença^5,8,9.

Ogunwobi e colegas usaram recentemente uma abordagem cirúrgica de sobrevivência para demonstrar o estabelecimento de um novo modelo ortotópico de camundongo singênico para o estudo de metástase no CHC³. Seu trabalho estabeleceu um modelo de camundongo "semelhante ao paciente" que recapitula características de HCCs agressivos e metastáticos³. Eles demonstraram ainda que esse sistema de modelo de camundongo pode ser usado para estudar a biologia das células tumorais circulantes e que isso tem potencial para obter novos insights sobre os mecanismos da metástase do câncer³.

O objetivo deste artigo é descrever em detalhes a metodologia usada para estabelecer este modelo de camundongo ortotópico singênico "semelhante ao paciente" de metástase³ de CHC. A metodologia de como implantar células de HCC de camundongo BNL 1ME A.7R.1 diretamente no fígado (o órgão de origem) da cepa de camundongo de laboratório imunocompetente do tipo selvagem, BALB/c³ usando cirurgia de sobrevivência será descrita. Ao contrário de outros modelos de tumor de xenoenxerto de camundongo, onde células tumorais humanas são implantadas em camundongos imunodeficientes, esse sistema é singênico e, portanto, adequado para estudar o papel do sistema imunológico na metástase tumoral^3,5,8. Essa abordagem provavelmente será amplamente utilizada para estudar os mecanismos de metástase em cânceres de órgãos sólidos.

Declaração de ética
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo cuidado e uso Comitê Institucional Animal (IACUC) da Hunter College of The City University of New York.

Nota: Oito ratos BALB / c foram utilizados neste procedimento experimental. Cinco ratinhos BALB / c foram implantados com 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 carcinoma hepatocelular células de rato para produzir os tumores primários. Três ratinhos BALB / c sem implantes foram usadas como controlos. BNL A.7R.1 1ME é uma linha celular de carcinoma hepatocelular murino que foi derivada através de transformação química a partir da linha celular de hepatócitos não tumorigénico murino BNL CL.2. BNL 1ME A.7R.1 foi obtida a partir da American Type Culture Collection (ATCC).

1. Pré-cirurgia

1. Certifique-se de que os ratos para todas as cirurgias de sobrevivência são saudáveis. Para assegurar que os ratos são saudáveis, inspeccionar sinais de desidratação por tenting da pele. Não utilize ratos com qualquer evidência de doença ou distress nestas experiências.
2. Pesar ratos para garantir que eles não estão abaixo do peso. Assegure-se que o peso é, pelo menos, 16-20 gramas.
3. Prepare 5 × ¹⁰ 6 BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para a implantação per mouse:
   1. Aspirar media de 10 ml de 60% - 70% de cultura de células confluentes prato de células HCC A.7R.1 rato BNL 1ME. Lavar duas vezes com 5 ml de PBS. Adicionar 2 ml de tripsina para o prato e incubar a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO ₂ durante 5 min.
   2. Subsequentemente, pipeta de 10 uL de células tripsinizadas em um hemocitómetro manual para contagem de células sob um microscópio com uma ampliação de 10X. Contar o número total de células encontradas nas quatro grandes quadrados de canto e multiplicar pelo factor de diluição pelo número total de células. Em seguida, divida pelo número de quadrados contados e multiplicar por 10 ^{6 para a} concentração de células (células por ml).
   3. Usando o cálculo, coletar 5 milhões de células por rato em estéril1,5 ml tubos de microcentrífuga. Rotular 1,5 ml microtubos.
4. Ressuspender as 5 x 10 ⁶ células BNL 1ME A.7R.1 rato HCC em 100 ul de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Mantenha estas células em gelo até a implantação em cirurgia.
5. Executar as atividades necessárias para a preparação de ratos para a cirurgia, tais como a indução da anestesia e cabelo recorte longe de equipamentos e materiais esterilizados para evitar a contaminação.
6. Induzir a anestesia geral em ratos por inalação de isoflurano utilizando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 concentração L por min (aprox. 2,1%). Nota: O sistema é auto-suficiente, e inclui um vaporizador de precisão, um suprimento de oxigênio e um botijão de carvão que está ligado a um circuito de respiração necessária para o gás / anestésico limpeza.
7. Certifique-se de que a anestesia é adequada para impedir o animal de sofrer dor durante a cirurgia. Execute-toe pitada e observar animais para não-responsiveness para confirmar a anestesia.
8. Naquele tempo, mudar a linha de válvula, vedação à caixa e aberto ao cone do nariz.
9. Assim que o rato é anestesiado, aplicar uma pequena quantidade de uma pomada oftálmica para as córneas como uma medida preventiva a secagem e danos.
10. Subsequentemente, o animal se mover para a área de preparação, com o cone do nariz adequadamente colocado e ligado (para a manutenção da anestesia). Prepare o local da incisão cirúrgica para a cirurgia por depilação a esta área de preparação.
11. Certifique-se de que a área de cirurgia é em um local livre de todas as outras atividades.
12. Certifique-se de que a superfície de trabalho é resistente e adequadamente higienizado, unsoiled e antes da cirurgia livre de desordem. Coloque um pedaço estéril de linho ou bandeja cirúrgica sobre ele.
13. Certifique-se de que o campo operatório está disponível apenas para pessoas que exercem a cirurgia. Certifique-se de que a sala cirúrgica é limpo e varreu com um limpador adequado e aspergidos com um disinfe apropriadoctant.
14. Assegure-se que também é posicionada afastada da portas e janelas, como correntes de ar podem espalhar pó levando à contaminação do sítio.
15. Realizar a cirurgia sobrevivência com instrumentos esterilizados. Ou mergulhar instrumentos num desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante ou autoclave. Use suprimentos básicos que são estéreis pronto para uso.
16. Instrumentos distintos de acordo com a função de ajudar a prevenir a contaminação de áreas estéreis.
17. Raspar aproximadamente 1 polegada em torno do local da incisão (incisão na linha média) para aceder ao fígado do animal. Remover o cabelo a partir do animal para longe do local da cirurgia.
18. Após a depilação, esfregue a área com um desinfetante e sabão (betadine cirúrgica matagal) e lavar o excesso com uma solução desinfetante de distância PBS estéril. Realizar isso várias vezes, com todo o processo de esfoliação com duração de aproximadamente 5 min. Remover e descartado as luvas utilizadas.
19. Depois, mude para roupas protetoras como Surgical vestido, top matagal, e máscara facial. Em seguida, higienizar as mãos com esfoliação solução adequada antes de colocar luvas cirúrgicas. Nota: Este é um passo necessário para evitar derramamento e contaminar o local da cirurgia com potenciais contaminantes.

2. Cirurgia

1. Fornecer uma fonte externa de calor para o calor durante todo o período da anestesia. O animal pode experimentar alguns hipotermia porque anestesia provoca distúrbios da termorregulação; portanto, manter a temperatura do corpo.
2. Coloque o mouse sobre as suas costas durante toda a cirurgia.
3. Corrigir os membros dianteiros, membros posteriores e cauda do mouse na tabela de cirurgia com pedaços de fitas cirúrgicas.
4. Faça uma linha reta incisão imediatamente inferior ao xyphisternum.
5. Usar um afastador cirúrgico auto-retenção estéril para expor o fígado.
6. Com uma seringa com uma agulha de 20G, lentamente e cuidadosamente, injectar 100 ul de PBS contendo 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1células de rato HCC no lobo direito do fígado.
7. Após a remoção da agulha, aplicar um cotonete esterilizado durante pelo menos 1 min para parar qualquer sangramento potencial devido à alta vascularização do fígado.
8. Feche o tecido subcutâneo com uma sutura absorvível seguido de fechamento da pele usando grampos cirúrgicos. Posteriormente, limpar a ferida mais uma vez com betadine matagal. Nota: Isso irá garantir o fechamento da ferida cirúrgica.
9. Subcutaneamente dar 100 ul de solução salina normal.

3. Pós-cirurgia

1. Imediatamente após a cirurgia, transferir o mouse para uma gaiola limpa com um cartão de identificação pós-cirurgia para notificar cuidadores da condição mouse. Fornecer alimentos e água. Nota: Em nossa experiência, um rato que acaba de passar por cirurgia se sairá melhor se alojado sozinho com o alimento úmido e água para o período inicial de 24 horas pós-cirurgia.
2. Manter o animal aquecido com uma lâmpada de calor que gera calor, não ultrapassando 38 ºC. vcif um termômetro para medir a temperatura até que o mouse está totalmente recuperado.
3. Casa do animal em uma gaiola de preferência com roupa de cama de papel para garantir conforto.
4. Após a recuperação inicial, monitorar o animal para sinais de desconforto, sangramento, dor e angústia. Dê buprenorfina (0,05 -0,1 mg / kg) para aliviar a dor. Estreitamente monitorizar a actividade, comportamento e aparência, assim como água e o consumo de alimentos durante cerca de 2 horas. Se ambulatorial, mover o animal de volta para a área de habitação periódica normal dos ratos e continuar a acompanhar em intervalos de 6-12 h para 24 horas pós-cirurgia. Executar uma verificação de peso se o desejar.
5. No entanto, se o animal está tendo problemas de recuperação, tomar medidas de cuidados de suporte apropriados. Se os ratos são incapazes de recuperar, humanamente euthanize camundongos através de _asfixia com CO2 e deslocamento cervical. Siga as orientações institucionais aprovados para a eutanásia.
6. Pós-cirurgia, verifique se há evidência clínica de HCC que normalmente é observable redução tão significativa no escore de condição corporal. Nota: Neste ponto, um tumor primário tem provavelmente desenvolvido no fígado e depósitos metastáticos têm probabilidade desenvolvidas nos pulmões.
7. Neste ponto, sacrificar todos os ratos (experimental e controle) envolvidos no experimento por eutanásia humanitária. Sujeitar os ratinhos para o dióxido de carbono asfixia: libertação muito lenta de dióxido de carbono no interior da câmara ao longo de um período de 5 a 10 minutos. Isto fará com parada respiratória.

Os fígados de ratos Balb / c foram implantados com 5 x 10 6 BNL 1ME A.7R.1 células rato HCC. Evidência clínica de desenvolvimento HCC foi observado 63 dias pós-cirurgia. Consequentemente, os ratos foram humanamente eutanasiados. A necropsia foi realizada nos ratos sacrificados. Os pulmões eo fígado foram ressecados e um exame cuidadoso bruta foi realizada para identificar tumores macroscópicos. Em um rato, um tumor superficial foi observada sobre a superfície do fígado com alguma ligação à parede abdominal (Figura 1A). Em um segundo rato, um fígado anormalmente aparência foi observada. A anormalidade parece muito fortemente como um tumor superficial (Figura 1B). Como esperado, os ratinhos no grupo de controlo sem implantação de células BNL 1ME A.7R.1 HCC desenvolvido nenhum tumor, como evidenciado por um fígado (Figura 1D) e pulmões (Figura 1E) a partir de um ratinho de controlo. Além disso, os pulmões de ratinhos com tumores pareciam ligeiramente anormal, exposiçãoing áreas de necrose hemorrágica (Figura 1C). Com base na experiência anterior, esses pulmões podem abrigar depósitos metastáticos 3.

Figura 1. O exame macroscópico de tumor e metástases. Ratinhos Balb / c foram implantados com 5 X 10 6 células tumorais BNL 1ME A.7R.1 e sacrificados 63 dias mais tarde. Tumores representativos do fígado observados foram fotografados e exibidos aqui. (A e B) ambos mostram tumores hepáticos superficial. (C) é pulmões a partir de células tumorais camundongos implantados. (D) mostra fígado de um rato controle. (E) indica pulmões de um controle mouse. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.