Isolamento e propagação de células tumorais circulantes de um cancro do modelo do rato

Resumo

As células tumorais circulantes (CTCs) demonstraram desempenhar um papel importante na metástase tumoral. Aqui, um método para o isolamento e propagação de CTCs a partir do sangue total de um modelo de tumor singênico de camundongo de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC) é descrito.

Resumo

A metástase do câncer é a principal causa de mortes associadas ao câncer. Estudos recentes mostraram que as células tumorais circulantes (CTCs) são importantes na metástase do câncer. De fato, o número de CTCs se correlaciona com o tamanho do tumor. Aqui, é fornecida uma descrição detalhada de uma metodologia para isolamento e propagação de CTCs a partir de um modelo singênico de camundongo de carcinoma hepatocelular (CHC) que permite a análise a jusante de mecanismos moleculares potencialmente importantes de metástase tumoral de órgãos sólidos. Este método é eficiente e reprodutível. É uma técnica não invasiva e, portanto, tem potencial para substituir a biópsia invasiva de tecidos de humanos que pode estar associada a complicações. Portanto, o método discutido aqui permite o isolamento e a propagação de CTCs a partir de amostras de sangue total, de modo que possam ser examinadas e caracterizadas. Isso tem potencial para adaptação futura para aplicações clínicas, como diagnóstico e terapia direcionada personalizada.

Introdução

A comunidade de pesquisa do câncer sabe da existência de células tumorais circulantes (CTCs) desde que foi observada pela primeira vez por Thomas Ashworth em 1869¹. Desde então, as CTCs têm se mostrado importantes na metástase tumoral e na progressão da doença^2-5. Hoje, os tumores sólidos são uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. As CTCs são células raras que se originam de tumores primários e viajam pela corrente sanguínea para diferentes órgãos, dos quais apenas uma pequena fração acaba evoluindo para metástase^2-5. Notavelmente, há correlação positiva entre o tamanho do tumor e o número de CTC^3,4.

Uma compreensão da biologia da CTC pode contribuir para a busca de terapia direcionada. Além disso, as CTCs podem ter aplicações diagnósticas. Para alcançar essas aplicações clínicas potenciais, é preciso superar alguns desafios atuais para estudar CTCs. Um desafio está relacionado ao fato de que as CTCs podem estar presentes como células únicas ou como aglomerados e podem até ser capazes de mudar seu fenótipo em resposta ao microambiente sanguíneo². Além disso, a detecção pode ser muito desafiadora, em parte devido à baixa contagem de CTCs (algumas a centenas por mililitro) entre um bilhão de células hematológicas por mililitro no sangue⁶. No entanto, nos últimos anos, a pesquisa sobre as potenciais aplicações clínicas das CTCs de cânceres de órgãos sólidos se intensificou.

Apesar desses esforços, os desafios de estudar e compreender o papel das CTCs persistem devido à raridade das CTCs e à inadequação das ferramentas tecnológicas atualmente disponíveis. Apesar desses desafios, o tremendo potencial para aplicações clínicas continua a ser um incentivo para buscar pesquisas sobre o papel das CTCs na metástase do câncer.

Recentemente, tivemos sucesso em isolar e propagar em CTCs de cultura de células de um modelo ortotópico de camundongo singênico de metástase de carcinoma hepatocelular (CHC)⁵. O objetivo do presente artigo é descrever em detalhes todos os aspectos da metodologia bem-sucedida. A importância desta metodologia reside no fato de que esta abordagem pode ser modificada para isolar e propagar com sucesso em cultura CTCs humanas, aumentando assim a possibilidade de estudos in vitro da biologia da CTC.

Existem múltiplas aplicações clínicas potenciais para o uso de CTCs. As CTCs podem ser úteis para prognóstico, monitoramento de resposta, triagem, monitoramento dinâmico de alterações moleculares tumorais e terapia personalizada⁴. Portanto, uma melhor compreensão da biologia das CTCs tem alto potencial de impacto clínico.

Protocolo

Declaração de Ética: Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional (IACUC) da Hunter College of The City University of New York.

1. Procedimentos Pré-experimento

1. Após a chegada à facilidade animal, inicialmente casa de 3 camundongos BALB / c com uma gaiola com uma cama superior e lascas de madeira filtrada. Certifique-se de que os ratos têm acesso livre à comida, Purina para roedores e água. Roupa de cama e comida devem ser mudadas duas vezes por semana, enquanto as gaiolas devem ser limpas uma vez por semana.
2. Induzir a anestesia geral em ratinhos usando um vaporizador de isoflurano, juntamente com oxigénio a uma taxa de fluxo constante de 1 litro por min. O sistema é auto-suficiente e inclui um vaporizador de precisão.
3. Posição animal numa caixa de plástico que tem o vaporizador de precisão e de gás / sistema anestésico ligado a ele. Inicialmente definir o vaporizador para 2,5 até animal está inconsciente, altura em que o vaporizador para diminuir 2.
4. Naquele tempo, mude olinha de válvulas, selando-a para a caixa e abri-lo para o cone do nariz.
5. Mover o animal para a área de preparação, com o cone do nariz colocado adequadamente e ligado (para a manutenção da anestesia).
6. Prepare 5 × 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 células do rato HCC para implantação por mouse. BNL 1ME A.7R.1 deve crescer num meio (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-Glutamina) incubar numa placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de ar e CO _2.
7. Com uma seringa tendo uma agulha G 20, o implante 100 ul de PBS contendo 5 x 10 ⁶ BNL 1ME A.7R.1 células de carcinoma hepatocelular rato em um lóbulo do fígado de ratinhos BALB / C para produzir os tumores primários. Pós-implantação, a casa dos camundongos BALB / c em uma gaiola com os mesmos requisitos de casas como pré-implantação.
8. No ponto final experimental, evidência clínica de carcinoma hepatocelular é observável uma redução significativa na condição corporalpontuação (geralmente detectada após 4 semanas). Neste ponto, há uma probabilidade de que os tumores primários têm desenvolvido no fígado enquanto os depósitos metastáticos ter se formado nos pulmões. Em seguida, inicia o processo de isolamento e a propagação de células tumorais circulantes.

2. Recolha de Sangue Total para o isolamento de células de tumor circulantes

NOTA: devidamente higienizados área de cirurgia e verifique se ele está livre de desordem. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos ou mergulhar em um desinfectante de acordo com a recomendação do fabricante

1. Sacrifício camundongos por eutanásia humanitária no experimental ponto final (evidência clínica de desenvolvimento do tumor). Eutanásia dos ratos deve envolver CO ₂ asfixia. Observe a murganhos corretamente para confirmar a anestesia é distribuído corretamente. O dióxido de carbono deve ser libertado lentamente no interior da câmara ao longo de um período de 5 - 10 min, causando paragem respiratória. Siga por sangria intracardíaca e cérvicoal luxação. ⁵
2. Usar uma agulha de 25 G ligada a uma seringa de 1 mL para a recolha de sangue total. Heparanize a seringa com 0,01 ml de heparina. Punção da pele com a agulha imediatamente inferior ao xyphisternum a cerca de 45 ° de ângulo. Avance lentamente a agulha para perfurar o coração, e, em seguida, diminuir o ângulo da agulha. Firmemente segurar a agulha e seringa no lugar, e extrair 500 ul - 1.000 l de sangue total do coração.
3. Remover a seringa ea agulha e transferir o sangue para um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio pré-rotulados. Centrifugar todo o sangue recolhido em 1,5 ml de tubo isento de pirogénios a 1167 xg durante 5 min.
   NOTA: A centrifugação separa a amostra de sangue em três camadas: a camada inferior ou de hematócrito que consiste em células vermelhas do sangue, uma fina camada intermédia de buffy coat, e uma camada de plasma superior.
4. Remover o plasma cuidadosamente por pipetagem e recolhendo-o em um tubo de 1,5 ml pyrogen-livre separado para furthexperimentos de er, tais como detecção de livre de células ácidos nucleicos ^7.
5. Para o isolamento de células tumorais circulantes (CTCs), recolher o buffy coat em um tubo de 1,5 ml livre de pirogénio separada em preparação para células vermelhas do sangue (RBC) de lise. Isto é necessário para eliminar os glóbulos vermelhos residuais na camada buffy coat.

3. Receita de glóbulos vermelhos (RBC) Tampão de Lise

1. Adicione uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos.
2. Adicione a 500 ml de cloreto de amónio e 500 ml de Tris. Em seguida, misturam para criar uma solução de 1 L de tampão de lise dos glóbulos vermelhos com uma concentração final de 155 mM de cloreto de amónio e 10 mM de Tris.
3. Tamponar a solução a um pH de 7,5. Armazenar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos em 2-8 ° C, e levar a RT imediatamente antes do uso.

4. RBC Lise de Brasão Buffy

1. Adicionar 1 ml de tampão de lise dos glóbulos vermelhos para o tubo esterilizado de 1,5 mL isenta de pirogénio contendo buffy coat recolhido.
2. Misturar o conteúdo do tubo porinvertendo diversas vezes. Incubar os conteúdos misturados do tubo durante 5 min à temperatura ambiente no banco. Centrifugar os conteúdos foram misturados durante 5 min a 1167 x g.
3. Após a centrifugação, um sedimento esbranquiçado será obtida. Desprezar o sobrenadante avermelhada devagar e com cuidado em lixívia a 10%, sem qualquer interrupção para o sedimento. Se o sedimento não é esbranquiçado, voltar a fazer os passos 3,1-3,5. Aumentando o tempo de incubação em tampão de lise dos glóbulos vermelhos para 10 - 15 minutos também pode ser útil.
4. Com segurança descartar o lixo biológico, uma vez descontaminação de resíduos biológicos em 10% de alvejante está completa após 24 horas.

5. Propagação de Cultura de Células

NOTA: As células de tumor de crescimento rápido são tipicamente células de glóbulos brancos que são abundantes na mistura original de células semeadas para o prato. Depois da mudança de forma repetida, e de passagens subsequentes CTC, todas as células brancas do sangue são removidas e uma população relativamente pura de CTC permanece.

1. Depoisdescartando o sobrenadante para 10% de lixívia, lavar o sedimento esbranquiçada em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pelo menos uma vez, e ressuspender em meio de cultura completo para a propagação em cultura de células.
2. Depois de lavagem é completado, adicionar 1 ml de meio de cultura BNL 1ME A.7R.1 completo (10% de FBS inactivado pelo calor, 1% de penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina) ao sedimento e ressuspender o sedimento em meio de cultura.
3. Semear o mix novamente suspensas de células em um prato de cultura de células. Incubar a placa de cultura de células a 37 ° C numa incubadora humidificada com ar e 5% de CO _2.
4. Mudar o meio de cultura celular a cada dois a três dias. Após cinco a sete dias, CTCs terão aderido à placa de cultura celular e começou a proliferar. Estas células permanecerá viável além de 25 passagens e após repetidos ciclos de congelamento e descongelamento ^5.

6. Verificação de carcinoma hepatocelular linha de células tumorais circulantes

1. Execute apolymerase reacção em cadeia (PCR) baseado, para amplificar um único segmento de DNA específica do gene globina do rato β-para confirmar que a nova linhas celulares estabelecidas CTC são células de ratinho, como a linha original é implantado BNL 1ME A.7R.1 HCC. Método foi originalmente descrito e validado por Steube et al. ^5,8
2. Realizar imunocoloração para o elemento de resposta específicos de hepatócitos marcador proteína de ligação cAMP como 3-3 (CREB3L3) usando um anticorpo específico. Isso irá confirmar que o romance CTCs estabelecidos são de fato hepatócitos como a linha de células BNL 1ME A.7R.1 original é implantado. ⁵

Resultados

A metodologia aqui descrita CTC mostrou que pode ser isolado. Os ratos foram sacrificados aos experimental humanamente de ponto final. O processo envolveu asfixia dióxido de carbono, sangria intra-cardíaca e deslocamento cervical. Um esquema de fases principais do processo são ilustrados na Figura 2. As amostras de sangue total coletado por sangria intra-cardíaca foram processados ​​utilizando o protocolo descrito acima. Após o que, a centrifugação foi usada para determinar a camada de ...

Discussão

Neste estudo, foi descrito como isolar e propagar CTCs do sangue total de um camundongo singênico com CHC. O objetivo deste trabalho é aprimorar os estudos em andamento sobre os mecanismos de metástase do câncer.

Um fator que contribui para o mau prognóstico de muitos cânceres é a falta de detecção oportuna e consequente disseminação generalizada da malignidade³. As CTCs se originam de cânceres primários e se espalham pela corrente sanguínea para órgãos distantes. Como tal, as CTCs...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sal de Heparina Sódica 1 g	VWR	89508-852
BTX Tubo Micro 1.5 ml Clear NS	VWR	89511-254	1.5 ml  Eppendorf Tubos
Agulha Estéril Disp BD 25 G x 1 in	VWR	BD305125	25 G Agulha
Slp Ponta SRNG 1 ml 200 cada por embalagem	VWR	BD309659	1 ml ponta de seringa
Seringa 1 ml leur lok Pk 100	VWR	BD309628	Seringa de 1 ml
VWR Tecido	VWR	82027-446	Pinça
Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100	VWR	25608-924	Cyromold
Cryo-oct compund 4 oz	VWR	25608-930	Oct compound
VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72	VWR	48311-703	Slides
VWR Vidro de cobertura #2 22 x 50 mm	VWR	48-382-128	Tampa de vidro
VWR Slide Box True North Fm Pu	VWR	89140-278	Caixa deslizante
Super HT PAP Pen	VWR	89427-058	Caneta PAP
Livre de RNASe e DNAse 2 L	VWR	101454-204	Tampão de água sem nuclease
Tris Ultra Pure Grade 500 g	VWR	97061-796	Tris
Buffer Cloreto de amônio ACS Grade 2, 5 Kg	VWR	97062-048	Tampão de cloreto de amónio
Falcon Placa de cultura de tecidos 60 x 15 mm Placa de cultura de tecidos de poliestireno		VWR 353002	Clorox
Alvejante Germicida, Regular	VWR	89501-620	Clorox Bleach
PBS, 1x (solução salina tamponada com fosfato) sem cálcio e magnésio (500 ml)	Thermo Fischer Scientific	21-040-CV	PBS, 1x
DMEM, 1x  com 4,5 g/L de glicose e L-glutamina sem piruvato de sódio	Thermo Fischer Scientific	10-017-CV	DMEM 1x meio para células BNL 1ME A.7R.1
Soro bovino fetal	Thermo Fischer Scientific	35-010-CV	FBS
Solução de estreptomicina de penicilina, 100x	Thermo Fischer Scientific	30-002-Cl	Estreptomicina de penicilina
Sorvall Biofuge pico	Thermo Fischer Scientific	75002411	Centrífuga de 13.000 rpm

de pinça 6