Descrito aqui é um protocolo para isolar e analisar os leucócitos infiltrantes de tecidos na interface materno-fetal (útero, decídua e placenta) de camundongos. Este protocolo mantém a integridade da maioria dos marcadores de superfície celular e produz células viáveis suficientes para aplicações a jusante, incluindo análise de citometria de fluxo.
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Artigo de método
Isolamento de Leucócitos a partir de tecidos de murino na interface materno-fetal
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tolerância imunológica durante a gravidez requer que o sistema imunológico da mãe sofre alterações distintas, a fim de aceitar e nutrir o feto em desenvolvimento. Essa tolerância é iniciada durante o coito, estabelecida durante a fecundação e implantação, e mantida durante toda a gravidez. Mediadores celulares e moleculares activas de tolerância materno-fetal são enriquecidas no local de contacto entre os tecidos fetal e materno, conhecida como a interface materno-fetal, o que inclui a placenta e o útero e tecidos deciduais. Esta interface é composto de células do estroma e os leucócitos que se infiltram, e as suas características fenotípicas e abundância alterar no decorrer da gravidez. Leucócitos de infiltração na interface materno-fetal incluem neutrófilos, macrófagos, células dendríticas, células mastro, células T, células B, células NK, células NKT e que em conjunto, criam o micro-ambiente local que sustenta a gravidez. Um desequilíbrio entre essas células ou qualquer inappropriate alteração nos seus fenótipos é considerado um mecanismo de doença na gravidez. Portanto, o estudo de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial, a fim de elucidar os mecanismos imunológicos que levam a complicações relacionadas com a gravidez. Descreve-se aqui um protocolo que utiliza uma combinação de dissociação mecânica suave seguido por uma desagregação enzimática robusta com um cocktail enzimática proteolítica e colagenolítica para isolar os leucócitos que se infiltram nos tecidos de murino na interface materno-fetal. Este protocolo permite o isolamento de um elevado número de leucócitos viáveis (> 70%) com propriedades antigénicas e funcionais suficientemente conservadas. Os leucócitos isolados podem então ser analisados por várias técnicas, incluindo imunofenotipagem, separação de células, imagiologia, immunoblotting, a expressão do mRNA, cultura de células, e em ensaios funcionais in vitro tais como reacções de leucócitos mistos, proliferação ou ensaios de citotoxicidade.
Introdução
Tolerância imunológica em gestação é um período em que ocorrem alterações distintas dentro do sistema imunológico da mãe. Estas mudanças permitem que a mãe de tolerar o feto, um enxerto alogênico semi-1. O feto expressa complexo principal de histocompatibilidade paterna (MHC) 2, e as células fetais têm sido encontrados na circulação materna 3; Contudo, o feto não seja rejeitada 4,5. Este enigma não é totalmente compreendido.
A hipótese mais recente indica que a tolerância materno-fetal é criado durante o coito e fecundação 6,7 e mantido para manter uma gravidez completa 8-10.
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Protocolo
Antes de trabalhar com as amostras mencionadas no presente protocolo, aprovação ética animal deve ser dada pelo Comitê de Ética em Pesquisa local e os institucionais Review Boards. Ao trabalhar com sangue animal, células ou agentes perigosos, como mencionado neste protocolo, as ações de biossegurança e segurança laboratoriais adequadas devem ser seguidas.
1. Rato Manuseio e Recolha de Tecidos
- Prepara-se uma estação de trabalho estéreis e obter ferramentas estéreis para a recolha de tecido. Essas ferramentas incluem tesouras grandes e pequenas cirúrgicas, fórceps, e pinças de ponta fina. Incluem pequenas placas de Petri marcadas....
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Resultados
A dissecação de tecidos de murino a partir da interface materno-fetal é mostrado na Figura 1; este procedimento inclui a abertura da cavidade peritoneal (Figura 1A, B), cornos uterinos (Figura 1C), incluindo os locais de implantação (Figura 1D), e a recolha dos tecidos uterinos (Figura 1E), placenta (Figura 1F), e tecidos deciduais (Figura 1G) em 16,5 dpc. A Figura 2 mostra a morfologia.......
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Discussão
A coleta de dados consistentes que registra as características fenotípicas e abundância de leucócitos que se infiltram na interface materno-fetal é essencial para a compreensão da patogênese das complicações relacionadas com a gravidez. Foram descritas várias técnicas que facilitam o isolamento de leucócitos de infiltração dos tecidos murinos na interface materno-fetal durante a gravidez 31,38,39,43-46. No entanto, cada técnica é diferente, utiliza enzimas ou combinações de enzimas diferentes, requer tempos d.......
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Divulgações
Os autores revelam que não há conflitos de interesse.
Agradecimentos
NGL foi apoiado pela Iniciativa Universidade Wayne State Perinatal em Saúde Materna, Perinatal e Saúde da Criança. Agradecemos Maureen McGerty e Amy E. Furcron (Wayne State University) para sua leitura crítica do manuscrito.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Magentic Cell Separation | |||
| MS Columns | Militenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Cell Separator | Militenyi Biotec | 130-042-102 | |
| 30 μ m filtros de pré-separação | Militenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Multistand | Militenyi Biotec | 130-042-303 | |
| tubos cônicos de 15 ml | Thermo Fisher | 339650 | |
| MACS Buffer | Militenyi Biotec | Preparação laboratorial | (0,5% de albumina de soro bovino, 2mM EDTA e 1x PBS, pH 7,2) |
| Reagents | |||
| Solução enzimática Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Anti-mouse CD16 / CD32 | BD Biosciences | 533142 | |
| Anticorpos extracelulares anti-camundongo | BD Bioscences / eBiosciences | < strong > Tabela 1 < / strong > | |
| Azida de sódio | Fisher | S227-500 | |
| Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906-100G | |
| CORANTE DE VIABILIDADE VIVO/MORTO Life | Technologies | L23105 | |
| Solução tampão de fixação | BD Biosciences | 558049 | |
| FACS Buffer | BD Biosciences | Preparação laboratorial | 0,1% BSA, 0,05% azida sódica, 1x PBS, pH 7,4 |
| Solução azul de tripano 0,4% | BIO-RAD | 145-0013 | |
| Soro fetal bovino (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| Instrumentos Adicionais | |||
| Incubadora com agitador | Thermo Scientific | MaxQ 4450 | |
| Citômetro de fluxo | BD LSRFortessa | ||
| Centrifuge | Thermo Scientific | Legend LXTR | |
| Sistema | construído em laboratório | ||
| Incubadora | Thermo Scientific | Incubadora 3307 | |
| Banho-maria | 51221035 de precisão | de | |
| células | BIO-RAD | TC20 Contador | |
| Microscópios ópticos e de fluorescência | Zeiss e Olympus | Zeiss LSM780 e Olympus CKX41 |
Referências
- Trowsdale, J., Betz, A. G. Mother's little helpers: mechanisms of maternal-fetal tolerance. Nat Immunol. 7 (3), 241-246 (2006).
- King, A., et al. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast.<....
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Reimpressões e permissões
