Manchar o tecido correto Every Time nos Blocos Multi-tecidos

Resumo

O objectivo da orientação da etiqueta de amostra (SPOT) é para funcionar como uma ferramenta de orientação para auxiliar na identificação de manipulação de tecidos em blocos de parafina multi-tecido. Estes protocolos demonstrar como ela é construída facilmente de histologia, materiais de baixo custo comuns e serve como um marcador visual confiável em blocos de parafina e secções.

Resumo

Blocos de parafina do tecido multi-proporcionar análise de alto rendimento com o aumento da eficiência, uniformidade experimental, e redução do tempo e custo. Tissue microarrays compõem a maioria dos blocos de parafina multi-tecido, mas cada vez mais, os pesquisadores estão usando blocos não vestiu contendo tecidos maiores a partir de vários indivíduos que podem fornecer muitas das vantagens de microarrays de tecido sem investimento substancial no planejamento e equipamentos. Um componente crítico de qualquer análise multi-tecido é o método de orientação utilizados para identificar todos os tecidos. Embora existam métodos para manter a orientação e a identificação de tecidos em blocos multi-tecido adequado, mais não são adequados para os blocos não formado, pode consumir espaço valioso dentro de uma matriz e / ou são difíceis de produzir em laboratório histologia padrão. A Orientação Tag Specimen (spot) é uma ferramenta de baixo simples, orientação para os custos que é claramente visível em todos os blocos de parafina e cortes de tecidos for identificação espécime confiável em layouts dispostos e não dispostos. O local proporciona vantagens sobre os métodos existentes de orientação para blocos não-vestida, uma vez que não exige qualquer modificação directa ao tecido e permite flexibilidade na disposição dos pedaços de tecido.

Introdução

A capacidade de incorporar amostras de tecido de várias pessoas em um único bloco de parafina permite fácil comparação lado a lado entre os tratamentos e indivíduos, elimina a variabilidade entre os slides, e reduz o custo ea carga de trabalho de corte e coloração espécimes. Estes blocos multi-tecidos são tipicamente produzidos quer como micromatrizes de tecidos (TMA) ou blocos de parafina contendo tecido de vários indivíduos num esquema não-matriz. Manutenção de identidade amostra é crítica para o sucesso de qualquer análise multi-tecido. Os investigadores têm vindo a utilizar TMAs desde o seu desenvolvimento para melhorar a eficiência da análise, reduzir a variação entre os slides, conservar os recursos de tecidos valiosos, e reduzir o tempo eo custo de experimentos ^1. A orientação correcta de TMA pode ser conseguida utilizando uma variedade de métodos, incluindo os espaços em branco, linhas ou colunas entre núcleos dos tecidos, ^2-4 disposição assimétrica dos grupos principais ^{3, 5} (por exemplo, control vs. tratamento), "baliza" núcleos ^6, e núcleos de orientação designados situados fora da matriz TMA ^3. Embora estes métodos funcionam bem para TMAs, mais consomem valioso espaço TMA núcleo e TMAs com lacunas e espaços como identificadores pode tornar-se confuso para enchimento de tecido estão esgotados ao longo do tempo. Além disso, estes métodos não são apropriados para uso em blocos multi-tecido sem um formato de matriz porque dependem de anomalias no padrão bem ordenada de núcleos de microarray uniformes como identificadores. A maioria dos blocos não vestiu multi-tecido deve acomodar tecidos não uniformes e, por definição, não exibir a grade de matriz estruturada que faz com que essas aberrações destacam-se como pontos de referência.

Embora existam muitas vantagens em usar uma TMA, uma das maiores desvantagens é o tamanho pequeno dos núcleos o que nem sempre é representativa de tecido ^1, em grande parte heterogénea. Blocos multi-tecido não-dispostas fornecer muitas das tele se beneficia de um TMA, mas contêm amostras de tecidos maiores, ou órgãos inteiros a partir de estudos com animais. Tissue microarrays utilizando núcleos individuais têm diferentes concordância com seções inteiras de tecidos com base na proteína de interesse e muitos exigem múltiplos núcleos para maior concordância ^7-11. Devido à complexidade e heterogeneidade de alguns fenótipos de biomarcadores, TMAs usando até mesmo um grande número de núcleos (> 10) podem ainda ser insuficiente e pode exigir que não sejam microarrays para a análise de ^oito métodos. Além disso, TMA construção é demorado, tecnicamente exigente, e exige que o custo inicial eo investimento em ou acesso a um arrayer tecido. Blocos multi-tecido não dispostas pode ser feita em qualquer laboratório de base com significativamente menos tempo e esforço e é uma alternativa válida para os estudos que exigem mais do que matrizes de tecido permitir ou como um meio para reduzir custos e simplificar a análise.

Blocos não-vestida multi-tecido semelhante requerem um ou fiávelientation marcador para monitorar a identificação da amostra, no entanto, o desenvolvimento desses marcadores tem sido limitada. Muita da literatura que descreve a orientação se concentra na orientação do tecido fisiológico correcto para a incorporação de peças de tecidos individuais, tais como o tecido de tatuagem com ¹² de tinta, pré-incorporação de tecidos em meio de ágar-gelatina antes de processamento ^13, e marcação certos tecidos com entalhes ¹⁴ ou ¹⁵ Suturas . Embora funcionais, estes métodos não são ideais como marcadores em blocos multi-tecido, devido às suas limitações. A sutura será seccionada por meio rápido e talvez não sejam visíveis em cada seção. Usando técnicas de ágar-gelatina pode manter o tecido na orientação adequada durante o processamento e incorporação pré-incorporação, mas não fornece uma indicação visual para diferenciar entre múltiplas amostras no bloco de parafina e lâminas. Entalhes ou corante no tecido pode complicar a análise ou ocluir importantes detalhes morfológicos. Alternativamente, a identidade dos tecidosem um bloco não-vestida multi-tecido pode ser mantida através da incorporação de peças de tecido numa disposição assimétrica, mas isto requer três ou mais peças de tecido e pode não permitir a disposição óptima dos tecidos para análise.

A Orientação Tag Specimen (spot) foi desenvolvido como um método fácil e barato para identificar claramente tecidos em blocos multi-tecidos e oferece muitas vantagens sobre os métodos de orientação existentes. O local é um pequeno, colorido, núcleo composto por Hydroxyethyl gel de agarose e processamento de corante marcação de tecidos, e infiltrado com parafina (Figura 2C). O núcleo local é incorporado na extremidade próxima de um único tecido num bloco de parafina de multi-tecido e aparece como um ponto brilhantemente colorido no bloco e em cada secção (Figura 1A - D), indicando claramente a orientação correcta do bloco e secções para a identificação de tecidos fácil.

Protocolo

1. Construção do local

1. Adicionar 50 mg de Albumina de Soro Bovino (BSA) a 1 ml de tecido corante de marcação num tubo de 15 ml ou 2 ml tubo de microcentrífuga e vortex durante 1 minuto ou até estar completamente dissolvido.
   Nota: Para este protocolo, utilize bioquímica Grade BSA. Enquanto outros graus e purezas não foram testados, espera-se que o grau ea pureza não teria um impacto significativo sobre o sucesso do local.
2. De calor 9 ml hidroxietil gel de agarose de processamento em um tubo de 15 ml em um micro-ondas a 30% de potência para incrementos de 10 seg até que o gel esteja completamente derretida.
3. Combine o gel processamento derretido e solução de corante-BSA em um único tubo de 15 ml e misture bem com uma pipeta. Vortex a solução.
4. Colocar o tubo cónico num frigorífico durante algumas horas ou até que o sólido.
5. Use um, magro, espátula de metal longo ou sonda para liberar suavemente a camada de gel colorido do tubo cônico.
6. Use uma lâmina de bisturi ou navalha para cut do gel ligar transversalmente em cinco milímetros de espessura. Retire as extremidades arredondadas e as trate como lixo (Figura 2A).
7. Coloque as seções de plug gel planas em cassetes de histologia e segure em etanol a 70% durante 1 hora. Alterar a solução de etanol a 70% a cada 2-4 horas durante pelo menos três mudanças ao longo de um período de 24 horas.
8. Processar manualmente as secções de gel através de uma série de etanol (1 hora cada: etanol a 70%, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações 3x), em seguida, solução clara na limpeza 3x durante 1 hora cada um (por exemplo, hidrocarbonetos alifáticos ( xilenos substituto)) foram utilizados no presente protocolo, xilenos também são aceitáveis), e infiltrar-se com parafina fundida (3x durante 1 h cada), manualmente ou em processadora de tecido.
   Nota: antes da desidratação completa em etanol a 100%, o corante pode vazar a partir da camada de gel que pode afectar outros tecidos e os reagentes líquidos num processador automatizado de tecidos. Como tal, a reidratação manual é altamente recomendado, no entanto processamento automatizado é equaliado eficaz.
9. Várias seções gel processado Incorporar usando parafina padrão incorporação de metodologia (Figura 2B). Permitir blocos para esfriar e endurecer e, em seguida, voltar à temperatura ambiente.
10. Utilize uma agulha de punção dérmica tamanho desejado para remover núcleos local das secções embutidas em gel até que o bloco se esgota (Figura 2C). Um único bloco pode fornecer até 20 x 2 milímetros ² núcleos. Armazenar os núcleos em local fresco. Use dérmica perfurador neste protocolo ver Figuras, um 1,5 mm (Figuras 1D e 2D) ou 2 mm (Figuras 1B, 1C e 2C).

2. Usando pontos para Blocos Orient Non-dispostas

1. Criar um diagrama de orientação do tecido para indicar os locais e as identidades de todos os pedaços de tecido individuais a serem incorporados em conjunto desejados, e a localização do local.
   NOTA: O diagrama orientação tecido é um mapa ilustrado que inclui o physical locais de todos os pedaços de tecido rotulados com identificadores ea localização do local. Ele pode ser criado eletronicamente ou pode ser desenhado à mão. O diagrama deve ser criado usando qualquer método que melhor se adequa ao técnico e pesquisador de utilizar o produto final. O mapa servirá como guia para o pesquisador tão amostras podem ser facilmente identificados durante a análise microscópica. O mapa utilizado neste protocolo foi desenhada à mão. Descreve um bloco de tecido e vidro lâmina de microscópio com cada peça de tecido eo ponto desenhado e rotuladas na mesma posição que o bloco de tecido real e slide.
2. Processar os pedaços de tecido, normalmente, garantir que se mantêm devidamente identificados durante todas as etapas de processamento e extrapolação. Para este protocolo, processar os tecidos durante 1 hora cada em: 70% de etanol, etanol a 80%, etanol a 95%, etanol a 100% (alterações x3), hidrocarbonetos alifáticos (xilenos) de substituição (alterações x3), e fundido a infiltração de tecido em parafina 60 ° C (mudanças x3).
   NOTA: Atecidos ll devem ser processados ​​de acordo com procedimentos de laboratório de histologia padrão. Isso pode ser variável devido a procedimento laboratorial individual, a dimensão eo tipo de tecido, mas isso não afetará a capacidade de usar o local como uma ferramenta de orientação.
3. Disponha pedaços de tecido sobre a estação de incorporação nos locais corretas atribuídas de acordo com o diagrama de orientação tecido. Use o diagrama orientação tecido como uma referência para orientar o técnico sobre como organizar as peças local e tecidos em cada bloco.
   NOTA: Neste protocolo o técnico incorporação de colocar a orientação do mapa desenhado à mão ao lado da estação de incorporação e organizados os pedaços de tecido na estação de incorporação em exatamente o mesmo arranjo como desenhado no diagrama. Isto assegura que todos os pedaços de tecido permanecem correctamente identificáveis ​​no produto final. Isto é absolutamente essencial para o sucesso do uso de blocos multi-tecido.
4. Certifique-se o núcleo local é mais alto do que todos os pedaços de tecido para ser incorporado no bloco.
5. Incorporar os pedaços de tecido e, em seguida, a mancha na final (transversal) nos locais apropriados de acordo com o diagrama de orientação tecido usando a metodologia de incorporação padrão. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até a parafina tem solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min).
6. Seção de parafina e mancha seções com o local utilizando metodologia padrão.
   1. Permitir que as secções a flutuar num banho de água a 40 ° C e aderida a uma lâmina de vidro carregadas positivamente (lâminas não carregadas não foram testados). Secam-se as lâminas em um forno de secagem a 60 ° C durante pelo menos 20 min.
   2. Colocar as lâminas em um corante automático e transformados por meio dos seguintes reagentes: xilenos (xilenos 1-5 min, xilenos 2 e 3-2 minutos, cada), etanol a 100% (2 min), etanol a 95% (1 min), 80 % de etanol (30 seg), etanol a 70% (30 seg), em água corrente (2 min), Hematoxilina (1,5 min), água corrente (3 minutos), o álcool do ácido (1 min), água da torneira corrente (2 min ), blreagente sional (1 min), água corrente (2 min), etanol a 80% (30 seg), eosina (1 min), água corrente (10 seg), etanol a 80% (1 min), etanol a 100% (3 mudanças, 2 min cada), xilenos (3 mudanças, 30 s cada).
   3. Cobrir as lâminas com lamelas de vidro, montado com meio de montagem.
      NOTA: Neste protocolo, o histotechnician seccionados os blocos de parafina em um micrótomo em 5 mm seções. Para este protocolo foi utilizado um corante automática, no entanto resultados iguais pode ser obtido através de coloração manual.

3. natural em TMA (Manual TMA Kit)

1. Criar um diagrama de orientação do tecido, como descrito em 2.1 e atribuir o local desejado (s) do local.
2. Encha o molde TMA com parafina derretida em uma estação de incorporação. À medida que o molde é de arrefecimento, incorporar o local (s) no fim das margens do molde TMA nos locais desejados indicados pelo diagrama de orientação tecido. Conforme o necessário, segurar o lugar (s) na posição vertical com uma pinça até o ha parafinas solidificado o suficiente para que o local (s) não vai cair (1-2 min).
3. Monte os núcleos TMA acordo com as instruções do fabricante e no que respeita à localização do ponto (s) nas margens de matriz (Figura 2D), e seguir os protocolos de seccionamento e coloração padrão.
   NOTA: Por favor consulte o passo 2.6 para ver os métodos de seccionamento e coloração utilizados neste protocolo.

Resultados

O local aparece como um círculo, ponto brilhantemente colorido no bloco de parafina (Figura 1A e 2D), em todas as secções de parafina, e mantém-se na lâmina de vidro por meio do procedimento de H & E ou IHC coloração (Figuras 1B - 1D e 2D). Este óbvias auxiliares de sinalização visuais tanto o histotechnician e pesquisador na identificação de cada peça de tecido individuais e simplifica a comunicação como o histotechnician pode usar...

Discussão

Preparação bem sucedida e utilização dos pontos exige a adesão cuidado para algumas etapas técnicas. Fusão do agarose hidroxietil deve ser feito lentamente e em fogo baixo. Derretendo rapidamente no calor elevado pode resultar em alguma repartição do agarose por menos de ótimos resultados. Ao cortar as fichas de corantes de carga em partes para processamento, assegurar que a espessura de cada peça é superior a 4,5 mm e não superior a 7 mm. As extremidades arredondadas são removidas como desperdício uma vez que não são u...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Gel de Processamento de Espécimes Histogel	Thermo Scientific	HG-4000-012	http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html
Marcador de Tecido	Triângulo Biomedical Sciences, Inc.	TMD-5	Qualquer corante de marcação de tecido provavelmente seria suficiente.
Kit Arraymold A 2 mm (60 núcleos)	Arraymold	20015A	Qualquer organizador manual de tecidos funcionaria de forma semelhante.