Um modelo de tenotomia de Aquiles e lesão por queimadura de ossificação heterotópica permite o estudo confiável da formação óssea ectópica induzida por trauma sem a aplicação de fatores exógenos.
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Artigo de método
Direto Rato Trauma / Burn Modelo de ossificação heterotópica
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Resumo
Resumo
A ossificação heterotópica (HO) é a formação de osso fora do esqueleto que se forma após grandes traumas, queimaduras e procedimentos cirúrgicos ortopédicos. A maioria dos modelos animais usados para estudar HO depende da aplicação de substâncias exógenas, como proteína morfogenética óssea (BMP), construções de células exógenas ou mutações genéticas na sinalização de BMP. Embora esses modelos sejam úteis, eles não reproduzem com precisão os estados inflamatórios que causam a maioria dos casos de OH. Aqui descrevemos um modelo de queimadura / tenotomia em camundongos que produz HO focalizado de forma confiável. Este protocolo envolve a criação de uma queimadura de contato de espessura parcial da área total da superfície corporal de 30% na pele dorsal, bem como a divisão do tendão de Aquiles em seu ponto médio. Confiar apenas na lesão traumática para induzir OH em um local previsível permite o estudo temporal da formação óssea heterotópica endocondral apenas a partir de processos fisiológicos intrínsecos e ambiente. Este método pode ser fundamental para a compreensão das vias inflamatórias e osteogênicas envolvidas na OH induzida por trauma. Além disso, como a OH se desenvolve em um local previsível e curso de tempo neste modelo, ela permite que a pesquisa melhore as estratégias de imagem precoce e as modalidades de tratamento para prevenir a formação de OH.
Introdução
A ossificação heterotópica (HO) é a formação de osso ectópico no qual células osteopotentes são aberrantemente induzidas a formar osso endocondral fora do esqueleto. Embora os detalhes da via de formação de HO ainda sejam amplamente desconhecidos, um paradigma aceito inclui três fatores principais: um incidente inflamatório incitante, um nicho permissivo e células-tronco mesenquimais capazes de formar osso. 1-3 HO é uma comorbidade comum que complica mais de 60% das queimaduras graves, 65% das lesões relacionadas ao combate e 10% dos casos de cirurgia ortopédica invasiva. 4,5 No entanto, muitas vezes é difícil prever onde a OH se formará, pois pode ocorrer em locais de lesão local ou em locais distantes que podem não ser lesionados. Essa variabilidade na localização dificulta a intervenção profilática para evitar a formação óssea reativa de maneira direcionada localmente. Existem também formas congênitas de OH, como a fibrodisplasia ossificante progressiva (FOP), na qual os pacientes são propensos ao desenvolvimento de OH robusta em resposta a pequenos traumas ou insultos inflamatórios. Modelos animais poderosos usando camundongos transgênicos reproduziram esse fenótipo e forneceram informações sobre as vias moleculares que também podem ser importantes na OH induzida por trauma.6-9 A pesquisa translacional sobre a patogênese da OH não congênita usou uma ampla variedade de construtos, desde lesões isoladas até a implantação de materiais e/ou células osteoindutoras exógenas. 10-13
Em nosso trabalho anterior, validamos um modelo simples e confiável de formação de HO em camundongos que não requer a administração de nenhum material exógeno. 14-17 Este modelo criou duas condições-chave para iniciar a OH: trauma local e inflamação global. Isso foi conseguido através do uso de uma tenotomia de Aquiles (trauma local) combinada com uma queimadura distante (inflamação global). Os camundongos receberam os dois tratamentos simultaneamente e desenvolveram uma quantidade robusta de HO que poderia ser analisada por meios histológicos, radiológicos e moleculares. Curiosamente, a queimadura concomitante aumentou significativamente a quantidade de HO que se formou e acelerou seu curso de desenvolvimento. 14-16 OH se desenvolveu em locais previsíveis ao redor do calcâneo, articulação do tornozelo e tíbia/fíbula do membro que recebeu a tenotomia. A confiabilidade do desenvolvimento de HO em um local conhecido permitiu o exame focado de características moleculares e histológicas nos estágios iniciais da ossificação ectópica. 14,17 Até o momento, 100% dos camundongos (mais de 50 animais) com tenotomia e queimadura concomitante desenvolveram OH. Além disso, imagens longitudinais 2D e 3D e análises espectroscópicas foram realizadas para examinar o padrão de crescimento e a composição bioquímica da HO.15,16
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Protocolo
Declaração de ética: Todos os procedimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definido nas orientações fornecidas no Guia para uso e cuidado de Animais de Laboratório: Oitava Edição do Instituto de Laboratório de Pesquisa Animal (ILAR de 2011) e foram aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animal Institucional da Universidade de Michigan (PRO0001553).
1. mouse Procedimentos Cirúrgicos
NOTA: Use 8-10 semanas de idade C57BL / 6 ratos. Outras idades, origens e linhagens de camundongos também pode ser usado para testar diferentes condições ou composição genética. Para a parte tenotomia do procedimento, manter condições estéreis, utilizando máscara facial, bonnet cabelo, e avental estéril, luvas e instrumentos. Locais cirúrgicos devem ser esterilizada preparada com iodopovidona e drapeados estéril. Evitar a hipotermia usando uma almofada de aquecimento e veterinária para o aquecimento de soluções de ressuscitação 37 ° C antes da adminis-ção.
- Anestesiar o rato usando 2,5% de isoflurano inalado. Use um cone do nariz para deixar o dorso e traseiras-membros de fácil acesso. Ajustar a taxa de administração de isoflurano para manter a taxa respiratória apropriada e coloração das mucosas e para garantir anestesia, verificando o tônus muscular, toe pitada, e reflexo da córnea. Aplicar pomada oftálmica sem graça para os olhos do rato para evitar lesões do olho seco durante o procedimento. Manter a temperatura corporal adequada usando uma almofada de aquecimento veterinária ou circulador de água quente sob o campo cirúrgico.
- Administrar buprenorfina, 0,1 mg / kg, por via subcutânea imediatamente antes da cirurgia para analgesia.
- Intimamente raspar o local da cirurgia na pata traseira esquerda usando cortadores desde o calcanhar até o joelho.
- Estreitamente raspar o dorso do rato, começando ao longo da coluna vertebral e que se estende a área rapada à esquerda da linha média dorsal, limpar uma área de pelo menos 2 cm x 3 cm para acomodar o ferimento de queimadura.
- Prepara-se o local de cirurgia, incluindo a pata traseira ao joelho utilizando 3 alternadas esfrega povidona-iodo.
- Realize uma incisão longitudinal ao longo do aspecto medial do tendão de Aquiles esquerdo. Estender a incisão para que o tendão de Aquiles pode ser facilmente visualizado; aproximadamente 0,5 cm.
- Executar uma tenotomia de Aquiles com dissecção aguda de tendão no ponto médio com uma tesoura de tecido afiadas. Inserir uma lâmina da tesoura de tecido no plano do tecido abaixo do tendão e dissecar ao longo do plano até que a lâmina está no ponto central do tendão. Feche as lâminas da tesoura para cortar o tendão acentuadamente.
NOTA: Certifique-se de inclusão de todos os tendões posteriores incluindo gastrocnêmio, sóleo, e tendões plantar. - Hemostasia, aplicando pressão com gaze estéril (deve haver sangramento mínimo) e fechar a incisão na pele com um ponto vicryl 5-0.
- Realize o dorsal queimadura de espessura parcial com um bloco de alumínio com peso de 35 g com measuremen aproximadosTS 2 cm por 2 cm x 3 cm aquecida a 60 ° C num banho de água aplicada ao dorso rapada do ratinho durante 17 seg.
NOTA: Atingir a profundidade de gravação apropriado colocando o bloco no topo do rato anestesiado, assegurando que toda a superfície do bloco está em contacto com o rato, no entanto, evitar a aplicação de qualquer pressão adicional para o bloco, ou seja, permitir que a gravidade seja a única força que prende o bloco no lugar. Um cabo de plástico fino ligado a um lado do bloco é conveniente para a manipulação, de estabilização, e recuperação a partir do banho de água quente. Isto irá criar uma área de superfície total do corpo queimar cerca de 30% em um 8-10 semanas de idade C57BL / 6 mouse. Este queimadura contato foi escolhido em detrimento de outros métodos (chama ou escaldão queimaduras), devido à uniformidade da profundidade da queimadura sobre a ferida e a reprodutibilidade entre os animais. - Seque o site queimadura com uma gaze e aplicar um curativo Tegaderm.
- Administrar fluidos de ressuscitação aquecidos: solução de Ringer com lactato de 1 mlinjecção intraperitoneal e subcutânea de 0,5 ml. Esta administração única de reanimação é adequada para a recuperação da lesão por queimadura e tenotomia.
NOTA: Não retornar ratos anestesiados para jaulas de habitação com outros ratos, casa individualmente em gaiolas limpas sob monitoramento até que os ratos são totalmente recuperado. A recuperação típica ocorre no prazo de 1-6 horas. Locais queimados geralmente curar dentro de 2-4 semanas e raramente são complicados por infecção da ferida se mantido em ambientes de habitação limpas. - Administrar Buprenorfina 0,1 mg / kg injecção subcutânea a cada 12 horas durante 3 dias após o procedimento. Monitorar o crescimento HO com varreduras μCT de série em intervalos apropriados. Crescimento ósseo ectópica é evidente pela primeira vez em torno de 3 semanas pós-operatório por μCT.
NOTA: A maioria do desenvolvimento HO é completa por nove semanas de pós-operatório. Nós não observamos uma diferença de HO volume ou local com repetidas varreduras μCT bi-semanal, durante 15 semanas, em comparação a um único ponto-final μCT digitalizar em 15 semanas.No final das experiências, todos os ratinhos a eutanásia com CO2 inalação de acordo com as orientações institucionais e verificar a morte com deslocamento cervical depois de 10 min.
2. μCT Aquisição e Análise
- Prenda o rato anestesiado na mesa do scanner na posição prona. Tape os membros posteriores segurança para a cama para evitar respirar movimento artefato. Inclua o ar, a água, e hidroxiapatita contendo fantasma sob o mouse para calibração de imagem.
- Abra o software de análise de osso e definir uma região de interesse (ROI) que engloba ambos os membros posteriores da articulação da anca proximal à ponta da pata traseira distalmente. Obter uma imagem usando os seguintes parâmetros:. 80 kV, 500 mA e 1.300 ms de exposição, 48 mm tamanho voxel 14,15
- Calibre a imagem para unidades Hounsfield (HU) pelo desenho de um ROI em cada uma das três câmaras fantasmas e introduzir a densidade média nos campos apropriados emo software.
- Usando a ferramenta "apanhando" no software, re-orientar a imagem de modo a tíbia do membro posterior esquerdo é paralelo ao longo do eixo Z para permitir a mais clara vista anatômico para a delimitação das estruturas ósseas corticais ortotópicos e HO.
- Começando na altura do joelho, desloque distalmente através das fatias de imagem até HO é encontrado. Usando a ferramenta de spline o manual, faça um ROI em torno do osso ectópico em cada 5 th fatia continua distalmente através da pata ou até HO foi ultrapassado. Use a ferramenta extrapolar para ampliar e costurar as ROIs juntos em um ROI que contém todas as HO.
- Faça um ROI 3D e escolha o menu de análise. Calcule o volume ósseo, definindo os valores de limite inferior e superior que melhor mostram a janela do osso. Use os mesmos valores-limite fixados para todas as digitalizações.
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Resultados
No presente estudo, o protocolo é descrito para o modelo de rato previamente publicado de trauma / queimadura induzida HO 14-17. Isto envolve a criação de concomitante lesão musculoesquelética localizada com uma tenotomia Aquiles e insulto inflamatório global, com uma espessura parcial queimaduras. Isto resulta na formação fiável do osso no local reactivo Tenotomia que pode ser seguido com imagens em série. Até à data, todos os ratinhos (mais de 50) que sofreram ambos Aquiles Tenotomia e lesão por queimadura ...
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Discussão
A ossificação heterotópica representa um importante comprometimento funcional enfrentado por pacientes que sofrem traumas, queimaduras e procedimentos musculoesqueléticos invasivos. A população de maior risco são soldados em conflitos modernos com ferimentos graves causados por explosões causadas por mecanismos como dispositivos explosivos improvisados (IED). 18 Armaduras corporais aprimoradas e unidades médicas posicionadas para a frente permitem uma melhor sobrevida de lesões graves nas extremidades. Após...
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar
Agradecimentos
Agradecemos a Amanda Fair, ao CMI e a Kathy Sweet e ao ORL da UM pela assistência com imagens e análises de μCT. Financiamento: BL Financiado por 1K08GM109105-01 e Prêmio Nacional de Doação da Fundação de Cirurgia Plástica.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Camundongos C57BL / 6 | Jackson Laboratory | 664 | 8-10 semanas de idade |
| Isoflurano – Fluriso | VET one, Boise, ID | V1 501017 | |
| Buprenorfina – Buprenex | Reckitt Benckiser Healthcare | NDC 12496-0757-1 | solução de 0,3 mg/ml |
| Betadine | Owens e Minor, Mechanicsville, VA | 2047PVP202 | |
| 5-0 Suturas Vicryl | Ethicon, Summerville, NJ | J493 | |
| Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm | 3M | 1624W | Corte ao meio para cobrir adequadamente o local da queimadura |
| µ CT - GE eXplore Locus SP | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá | ||
| Microview 2.2 Aplicação Avançada de Análise Óssea | GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, Londres, ON, Canadá |
Referências
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Reimpressões e permissões
