Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

Resumo

Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Resumo

O principal impedimento para entender como um tecido epitelial executa o reparo de feridas é a disponibilidade limitada de modelos nos quais é possível acompanhar e manipular a resposta da ferida ex vivo em um ambiente que imita de perto a lesão do tecido epitelial in vivo. Essa questão foi abordada com a criação de um modelo de reparo de lesão epitelial ex vivo clinicamente relevante baseado na cirurgia de catarata. Neste modelo de cultura, a resposta do epitélio do cristalino à ferida pode ser acompanhada ao vivo no microambiente nativo das células, e os mediadores moleculares do reparo da ferida podem ser facilmente manipulados durante o processo de reparo. Para preparar as culturas, as lentes são removidas do olho e uma pequena incisão é feita na parte anterior do cristalino, da qual a massa interna das células da fibra do cristalino é removida. Este procedimento cria uma ferida circular na cápsula posterior do cristalino, a espessa membrana basal que envolve o cristalino. Esta área da ferida onde as células da fibra foram fixadas está localizada adjacente a uma monocamada contínua de células epiteliais do cristalino que permanece ligada à cápsula do cristalino durante o procedimento cirúrgico. O epitélio ferido, o tipo de célula do qual as células fibrosas são derivadas durante o desenvolvimento, responde à lesão da remoção das células fibrosas movendo-se coletivamente pela área da ferida, liderada por uma população de células de reparo ricas em vimentina cujos progenitores mesenquimais são endógenos ao cristalino¹. Essas propriedades são típicas de uma resposta normal de cicatrização de feridas epiteliais. Neste modelo, como in vivo, o reparo de feridas depende de sinais fornecidos pelo ambiente endógeno que é mantido exclusivamente neste sistema de cultura ex vivo, proporcionando uma oportunidade ideal para a descoberta dos mecanismos que regulam o reparo de um epitélio após a ferida.

Introdução

A, a cirurgia de catarata simulada clinicamente relevante, ex vivo epitelial modelo cicatrização de feridas aqui descrito foi desenvolvido para fornecer uma ferramenta para investigar os mecanismos que regulam a reparação de tecidos epiteliais, em resposta a uma lesão. Os principais recursos que foram destinados para na criação deste modelo incluiu uma condições) que prevêem que de perto replicados a resposta in vivo para ferindo em uma configuração de cultura, 2) facilidade de modular os elementos reguladores de reparação, e 3) capacidade de imagem do processo de reparação, na sua totalidade, em tempo real. O desafio, portanto, era criar um modelo de cultura em que foi possível estudar e manipular, reparação epitelial no microambiente nativo das células. A disponibilidade deste modelo ferida-reparação abre novas possibilidades para identificar os sinais de sinalização endógenas de matriz proteínas, citocinas e quimiocinas, que regulam o processo de reparação. Além disso, o modelo é ideal para examinar como umn epitélio é capaz de mover-se como uma folha colectivo para re-epithelialize área da ferida ^2,3, e para determinar a linhagem de células mesenquimais líder no bordo da ferida que funcionará em colectivo dirigir a migração do epitélio ferido ^4. Este modelo também fornece uma plataforma com a qual identificar terapêuticas que possam promover a cicatrização de feridas eficaz e evitar que a reparação de feridas aberrante ^5.

Há já uma série de modelos ferida de reparação disponíveis, tanto em cultura e in vivo, que forneceram a maioria do que se sabe sobre o processo de reparação ferida hoje. Em modelos animais de lesão, tais como a córnea ^6-12 e ^13-17 da pele, há a oportunidade para estudar a resposta do tecido do ferimento no contexto de todos os mediadores de reparo que podem estar envolvidos no processo, incluindo contribuições do vasculatura e no sistema nervoso. No entanto, existem limitações para manipular a expericondições mentais in vivo, e ainda não é possível realizar estudos de imagem da resposta de reparação in vivo, de forma contínua ao longo do tempo. Em contraste, a maioria dos modelos de cultura in vitro de reparação de feridas, tais como a ferida zero, pode ser facilmente manipulada e seguido ao longo do tempo, mas falta o contexto ambiental de estudar a cicatrização de feridas no tecido in vivo. Enquanto ex vivo em modelos oferecem a vantagem de estudar o processo de reparação da lesão de forma contínua ao longo do tempo no contexto da microambiente das células juntamente com a capacidade para modular os reguladores moleculares de reparação em qualquer ponto de tempo no processo, existem poucos modelos que se encaixam estes parâmetros.

Aqui é descrito um procedimento para gerar altamente reprodutível ex vivo epitelial culturas que reproduzem a resposta de um tecido epitelial a um ferimento fisiológico cura. Usando a lente de embrião de galinha como uma fonte de tecido, um ex vivo mock cirurgia de catarata é realizada. A lente é um tecido ideal para usar para esses estudos, uma vez que é auto-suficiente dentro de uma cápsula de membrana basal espessa, avascular, não inervados, e livre de qualquer estroma associada ^18,19. Na doença humana, a cirurgia da catarata aborda a perda de visão devido a opacificação da lente, e envolve a remoção da massa celular da fibra da lente, o qual compreende a maior parte da lente. Seguindo a visão cirurgia de catarata é restaurada através da inserção de uma lente intra-ocular artificial. O procedimento de cirurgia de catarata, através da remoção das células da fibra, induz uma resposta a uma lesão no epitélio do cristalino adjacente, que responde por re-epitelialização da área posterior da cápsula da lente que tinha sido ocupada pelas células de fibra. Na cirurgia de cataratas, como na maioria das respostas de reparação de ferida, há por vezes ocorre um resultado de fibrose aberrante para a resposta de cicatrização das feridas, associado com o aparecimento dos miofibroblastos, em que a lente é conhecido como posterior Capsule Opacificação ^20-22. Para gerar o modelo de cicatrização de feridas cirurgia de catarata, um procedimento de cirurgia de catarata é imitado em lentes removidas do olho de embrião de pinto para produzir uma lesão fisiológica. Remoção microcirúrgico da fibra lente células resulta em uma área de ferida circular muito consistente rodeado pelas células epiteliais da lente. Esta população de células permanece firmemente ligado à cápsula membrana basal da lente e é ferido pelo procedimento cirúrgico. As células epiteliais migrar para a área desnudo da membrana basal endógena para curar a ferida, liderada por uma população de células mesenquimais rico em vimentina conhecidas no processo de reparação como células líder ^um. Com este modelo, a resposta de um epitélio de lesão pode ser visualizada facilmente seguido e com o tempo no contexto do microambiente das células. As células são facilmente acessíveis a alteração da expressão ou activação de moléculas que se espera que desempenham um papel na reparação de feridas. Um poderoso recurso do thé o modelo é a capacidade de isolar e estudar alterações específicas do migração no âmbito da cicatrização de feridas. A capacidade para preparar um grande número de envelhecidos ex vivo de cura de feridas culturas combinadas para estudos é outra vantagem deste modelo. Assim, este sistema modelo proporciona uma oportunidade única de provocar uma separação mecanismos de reparo de feridas e terapêutica de teste para o seu efeito sobre o processo de cicatrização de feridas. O modelo de cirurgia de catarata ex vivo simulada deverá ter ampla aplicabilidade, fornecendo um recurso crítico para o estudo de mecanismos de reparação do prejuízo.

Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com os Animal Care Institucional e Comitê de Uso orientações Thomas Jefferson University e com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Vision Research.

1. Configuração e Preparação de Lentes de Cultura Ex Vivo de Feridas

1. Coloque três pratos de 100 mm de petri em um estéril, capela de fluxo laminar. Encha duas das placas de Petri até meio com tampão Tris / dextrose (tampão TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na ₂ PO _4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de Tris base, pH a 7,4 com HCl) à TA , deixando a terceira vazio. Meios de cultura de pré-aquecer (Media suplementado com 199, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina / estreptomicina) a ³⁷ ° C.
   Nota: O padrão de cura de feridas é o meio de cultura isento de soro, como ocorre in vivo; no entanto, as culturas de reparação da ferida podem ser cultivadas com sucesso em condições de meios definidos, que incluem soro ou outros factores.
2. Remover fértil d embrionárioay 15 clara de ovo pintainho leghorn da incubadora (realizada em 37,7 ° C com agitação suave)
3. Coloque o ovo selecionado na capela de fluxo laminar e limpo fora do shell com etanol a 70% a partir de um frasco de lavagem. Realizar todos os procedimentos a seguir em condições de assepsia na câmara de fluxo laminar, usando soluções e instrumentos estéreis.
4. Craque conteúdo dos ovos e colocar no vazio 100 milímetros placa de Petri. Decapitar embrião usando uma pinça e tesouras padrão finas. Coloque a cabeça de embrião de pinto em uma placa de Petri contendo tampão de TD e descartar adequadamente o restante do embrião. Opcionalmente manter as cabeças de embrião de pinto em tampão de TD por um curto período de tempo, não mais do que 15 min.
5. Coloque a cabeça de embrião de galinha em uma tampa de placa de Petri. Utilizando uma pinça de alta precisão, remova a lente junto com seu humor vítreo do olho ligados na seguinte sequência. Comprima a parte posterior do olho com a pinça para criar uma pequena abertura na parte posterior do olho.
6. Em seguida, segure o humor vítreo with fórceps e puxar suavemente no vítreo com um movimento de rolamento, o vítreo com a lente vai ser ligado desalojado do olho. Lugar da lente / vítreo na placa de Petri contendo tampão restante TD. Permitir que as lentes permaneçam em tampão TD durante o período de 30 min.
7. Mover a lente para uma nova tampa de placa de petri sob um microscópio de dissecação. Deste ponto em diante executar todas as etapas sob um microscópio de dissecação. Com uma pinça de alta precisão cuidadosamente afastar qualquer corpo ciliar (células pigmentadas) que foram desalojados com a lente usando a ponta da pinça, tomando cuidado para não danificar o tecido da lente.
   Nota: A remoção do corpo ciliar assegura que os tipos de células que não são endógenos às lentes não estão incluídos na cultura da reparação da ferida.
8. Separa-se a lente do humor vítreo com uma pinça de alta precisão por beliscar fora do corpo vítreo de sua associação com a cápsula posterior do cristalino.
9. Usando alta precisão forceps transferir a lente em uma pequena gotade tampão de TD (cerca de 200 ul) num prato de cultura de tecidos 35 milímetros.

2. realização de cirurgia de catarata Mock

1. Orientar a lente na gota de tampão de TD no prato de 35 mm com o aspecto anterior da lente voltada para cima.
   Nota: A anterior da lente pode ser facilmente identificados pela presença de um anel denso no tecido que regista a fronteira entre a região anterior e equatorial do epitélio da lente. Em contraste, há uma ausência de marcas sobre a parte posterior da cápsula da lente para que as células das fibras da lente estão ligados.
2. Usando duas pinças de alta precisão fazer uma pequena incisão (aproximadamente 850μm) no centro da cápsula anterior da lente, a espessura da membrana basal que circunda a lente de tecido, e a sua associada epitélio anterior do cristalino, por agarrar o tecido com uma pinça em cada mão e puxando suavemente em direções opostas.
3. Remover a massa celular da fibra, que constitui a maior parte do tecido da lente, dislodging-lo de suas ligações com o epitélio da lente e circundante cápsula do cristalino por hydro-eluição (uma abordagem usada em cirurgia de catarata clássico, modelado na Figura 1A).
4. Encher uma seringa de 1 mL com uma ponta de agulha de 27,5 L com 300 ul de tampão de TD. Inserir a ponta da agulha dentro da incisão feita na cápsula anterior do cristalino, e cerca de metade para a lente.
5. Pressione levemente a seringa injetar o tampão TD na massa celular fibra lente. Injectar entre 50 e 200 ul TD, e nunca mais de 300 ul. Observe a massa celular fibra soltando-se do epitélio e lente cápsula.
6. Utilizando uma pinça de alta precisão, retire a massa celular fibra soltos da lente através do local da incisão anterior.
   Nota: Este procedimento deixa a cápsula posterior do cristalino membrana basal ao qual as células de fibra tinha sido anexado desnudada de células, e um epitélio da lente ferido apenas adjacente a este site.

3. Preparing o Lens Ferido para Ex Cultura Vivo

1. Nivelar o saco capsular da lente, que resulta da cirurgia da catarata descrito acima no prato de cultura, o lado das células para cima, fazendo cinco cortes na face anterior do saco capsular.
2. Corte perpendicular ao local da incisão original através do equador do cristalino. Achate as resultantes cinco "retalhos" da cápsula do cristalino com epitélio anexado no lado da cultura cápsula prato para baixo, celular voltado para cima. Note-se a lente ex vivo feridos agora deve assumir uma forma em estrela ou flowerlike (ver Figura 1B).
3. Para fixar a cápsula para o prato, pressione suavemente para baixo com a pinça em cada ponto da estrela. Isso fará com que um pequeno recuo para as cinco dicas mais fora do explante e resultar em anexo sustentado para o prato.
   Nota: É possível danificar a cápsula durante este processo e por isso é importante para assegurar que a cápsula se o prato mais próximo possível das pontas das flaPS quanto possível, bem como para tornar a menor quantidade de pontos de fixação quanto possível (em geral duas, máximo de três por retalho).
4. Remover o tampão de TD no prato de 35 mm e substituí-la com 1,5 ml de meio de pré-aquecido. Cobrir o prato de 35mm com a sua tampa e lugar na incubadora (37 ° C, 5% CO _2).

4. Separação da Zona de Migração Central (CMZ), onde Re-epitelização da área ferida do Posterior Capsule Ocorre, do anexo original Zone (OAZ) de lente células epiteliais, para análise quantitativa.

Nota: As células começam a mover-se para a região de CMZ imediatamente em resposta à lesão. Por um dia em cultura células suficientes estão migrando através do CMZ para análise molecular e bioquímica, após a separação da CMZ eo OAZ por micro-dissecção ^23. Este protocolo envolve a remoção de uma aba (OAZ) de cada vez a partir da área ferida da cápsula.

1. Observar uma demarcatião, claramente visíveis ao microscópio de dissecação, e entre o OAZ CMZ (ver Figura 2A). Usando duas pinças de alta precisão, agarrar com as duas pinças na extremidade da linha OAZ / CMZ, apenas um lado para o outro, em ambos os lados da linha (ver figura 2A, B, seta).
2. Usando uma mão / um fórceps no lado da CMZ continuar a sustentar a cultura feridos, enquanto com a outra mão / pinça, puxe o OAZ ao longo da linha OAZ / CMZ. O CMZ facilmente se separa do OAZ ao longo desta linha. Continue ao longo desta linha em torno de toda a cultura até que as duas regiões são completamente separados.
3. Estude as fracções separadas OAZ e CMZ para a análise molecular, tais como ²⁴ ou bioquímica análise de RNA-Seq como western blot ou co-imunoprecipitação ^23,25.

Resultados

Ex Vivo Modelo criado para estudar o processo de cicatrização da ferida no microambiente das células nativas

Para investigar os mecanismos envolvidos na regulação da cicatrização da ferida de um epitélio em microambiente das células nativas, um modelo de cirurgia de catarata clinicamente relevante ex vivo simulada foi criado. Este modelo é criada a partir de tecido da lente que oferece muitas vantagens, devido às suas propriedades intrínsecas: 1) A lente é um órgão auto-con...

Discussão

Aqui é descrita uma técnica para preparar um modelo de cultura de reparo de feridas que envolve a realização de uma cirurgia de catarata ex vivo em lentes de embriões de galinha após sua remoção do olho. O epitélio do cristalino responde a essa ferida clinicamente relevante com um processo de reparo que imita de perto o que ocorre in vivo e compartilha características com o reparo da ferida em outros tecidos epiteliais^2,4. Embora o protocolo seja direto e simples de seguir, a realização de um...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Uso a 140 mM em tampão TD
Cloreto de potássio (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Uso a 5 mM em tampão TD
Fosfato de sódio (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Uso a 0,7 mM em tampão TD
D-glicose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use a 0,5 mM em tampão TD
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use a 8,25 mM em tampão TD
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	A144-500	Use para pH TD tampão a 7,4
Mídia 199	GIBCO	11150-059
L-glutamina	Corning/CellGro	25-005-CI	Uso a 1% em Media199
Penicilina/estreptomicina	Corning/ CellGro	30-002-CI	Uso a 1% em placas de Petri Media199
100 mm	de	Fisher Scientific
Stericup	Millipore	SCGPU01RE	Use para filtrar e esterilizar
Mídia Pinça Dumont #5 (precisa de 2)	Ferramentas de Ciência Fina	11251-20
Placa de Cultura de Células de 35 mm	Corning	430165
27 G 1 ml Ponta Deslizante com agulha de deslizamento de precisão	BD	309623
Tesoura Fina	Ferramentas de Ciência Fina	14058-11
Fórceps Padrão	Ferramentas de Ciência Fina	91100-12
Outros Itens Necessários: Instrumentos de dissecação geral,  ovos de galinha leghorn brancos férteis, verifique a incubadora de ovos (umidificado, 37.7° C), capa de fluxo laminar, microscópio

Unidade Filtro FB0875711Z de dissecação de estereovisão binocular