Estabelecimento de um clinicamente relevantes<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Mock Cataract Surgery Modelo para investigar Epithelial Wound Repair em um microambiente Native

Resumo

Descrito aqui é o estabelecimento de um modelo de cirurgia de catarata simulada ex vivo clinicamente relevante que pode ser usado para investigar mecanismos de resposta à lesão de tecidos epiteliais dentro de seu microambiente nativo.

Resumo

O principal impedimento para entender como um tecido epitelial executa o reparo de feridas é a disponibilidade limitada de modelos nos quais é possível acompanhar e manipular a resposta da ferida ex vivo em um ambiente que imita de perto a lesão do tecido epitelial in vivo. Essa questão foi abordada com a criação de um modelo de reparo de lesão epitelial ex vivo clinicamente relevante baseado na cirurgia de catarata. Neste modelo de cultura, a resposta do epitélio do cristalino à ferida pode ser acompanhada ao vivo no microambiente nativo das células, e os mediadores moleculares do reparo da ferida podem ser facilmente manipulados durante o processo de reparo. Para preparar as culturas, as lentes são removidas do olho e uma pequena incisão é feita na parte anterior do cristalino, da qual a massa interna das células da fibra do cristalino é removida. Este procedimento cria uma ferida circular na cápsula posterior do cristalino, a espessa membrana basal que envolve o cristalino. Esta área da ferida onde as células da fibra foram fixadas está localizada adjacente a uma monocamada contínua de células epiteliais do cristalino que permanece ligada à cápsula do cristalino durante o procedimento cirúrgico. O epitélio ferido, o tipo de célula do qual as células fibrosas são derivadas durante o desenvolvimento, responde à lesão da remoção das células fibrosas movendo-se coletivamente pela área da ferida, liderada por uma população de células de reparo ricas em vimentina cujos progenitores mesenquimais são endógenos ao cristalino¹. Essas propriedades são típicas de uma resposta normal de cicatrização de feridas epiteliais. Neste modelo, como in vivo, o reparo de feridas depende de sinais fornecidos pelo ambiente endógeno que é mantido exclusivamente neste sistema de cultura ex vivo, proporcionando uma oportunidade ideal para a descoberta dos mecanismos que regulam o reparo de um epitélio após a ferida.

Introdução

A, a cirurgia de catarata simulada clinicamente relevante, ex vivo epitelial modelo cicatrização de feridas aqui descrito foi desenvolvido para fornecer uma ferramenta para investigar os mecanismos que regulam a reparação de tecidos epiteliais, em resposta a uma lesão. Os principais recursos que foram destinados para na criação deste modelo incluiu uma condições) que prevêem que de perto replicados a resposta in vivo para ferindo em uma configuração de cultura, 2) facilidade de modular os elementos reguladores de reparação, e 3) capacidade de imagem do processo de reparação, na sua totalidade, em tempo real. O desafio, portanto, era criar um modelo ....

Protocolo

O protocolo a seguir está em conformidade com os Animal Care Institucional e Comitê de Uso orientações Thomas Jefferson University e com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Vision Research.

1. Configuração e Preparação de Lentes de Cultura Ex Vivo de Feridas

1. Coloque três pratos de 100 mm de petri em um estéril, capela de fluxo laminar. Encha duas das placas de Petri até meio com tampão Tris / dextrose (tampão TD; 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 0,7 mM de Na ₂ PO _4, 5 mM de D-glucose, 8,25 mM de Tris base, pH a 7,4 com HCl) à TA , deixando a terceira vazio. Meios de cultura de pré-aquecer (M....

Resultados

Ex Vivo Modelo criado para estudar o processo de cicatrização da ferida no microambiente das células nativas

Para investigar os mecanismos envolvidos na regulação da cicatrização da ferida de um epitélio em microambiente das células nativas, um modelo de cirurgia de catarata clinicamente relevante ex vivo simulada foi criado. Este modelo é criada a partir de tecido da lente que oferece muitas vantagens, devido às suas propriedades intrínsecas: 1) A lente é um órgão auto-con.......

Discussão

Aqui é descrita uma técnica para preparar um modelo de cultura de reparo de feridas que envolve a realização de uma cirurgia de catarata ex vivo em lentes de embriões de galinha após sua remoção do olho. O epitélio do cristalino responde a essa ferida clinicamente relevante com um processo de reparo que imita de perto o que ocorre in vivo e compartilha características com o reparo da ferida em outros tecidos epiteliais^2,4. Embora o protocolo seja direto e simples de seguir, a realização de um.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de sódio (NaCl)	Fisher Scientific	S271-3	Uso a 140 mM em tampão TD
Cloreto de potássio (KCl)	Fisher Scientific	P217-500	Uso a 5 mM em tampão TD
Fosfato de sódio (Na2HPO4)	Sigma	S0876	Uso a 0,7 mM em tampão TD
D-glicose (Dextrose)	Fisher Scientific	D16-500	Use a 0,5 mM em tampão TD
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-1	Use a 8,25 mM em tampão TD
Ácido clorídrico	Fisher Scientific	A144-500	Use para pH TD tampão a 7,4
Mídia 199	GIBCO	11150-059
L-glutamina	Corning/CellGro	25-005-CI	Uso a 1% em Media199
Penicilina/estreptomicina	Corning/ CellGro	30-002-CI	Uso a 1% em placas de Petri Media199
100 mm	de	Fisher Scientific
Stericup	Millipore	SCGPU01RE	Use para filtrar e esterilizar
Mídia Pinça Dumont #5 (precisa de 2)	Ferramentas de Ciência Fina	11251-20
Placa de Cultura de Células de 35 mm	Corning	430165
27 G 1 ml Ponta Deslizante com agulha de deslizamento de precisão	BD	309623
Tesoura Fina	Ferramentas de Ciência Fina	14058-11
Fórceps Padrão	Ferramentas de Ciência Fina	91100-12
Outros Itens Necessários: Instrumentos de dissecação geral,  ovos de galinha leghorn brancos férteis, verifique a incubadora de ovos (umidificado, 37.7° C), capa de fluxo laminar, microscópio

Unidade Filtro FB0875711Z de dissecação de estereovisão binocular