Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos ^1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de determinar a composição bioquímica das estruturas visualizadas. Na ausência de membranas internas para ajudar a diferenciar estruturas nucleares, o núcleo tem sido particularmente difícil. Electron espectroscópica imagiologia (ESI) resolve algumas destas limitações, permitindo a detecção e diferenciação simultâneas de ADN, ARN, e Protein baseada em estruturas nucleares ^2-5.

Electron imagens espectroscópicas:

Para mapear distribuições elementares em alta sensibilidade e resolução do microscópio eletrônico, pode-se usar um espectrômetro de imagem que seleciona os elétrons que foram inelasticamente espalhadas através de interações com electrões de interiores de um elemento na amostra ^6. Devido quantidades específicas do elemento de energia são perdidos em consequência de ionização de átomos presentes na amostra, estes electrões pode ser separada e visualizada utilizando um espectrómetro que está ligado ao microscópio electrónico. Assim, a análise do espectro dos electrões que interagiram com o espécime revela informação qualitativa e quantitativa sobre a composição elementar da amostra ^7. Os electrões que não perdem energia ao passar através da amostra encontram-se na "perda do pico a zero" da perda de energia dos electrõesespectro. A abundância destes electrões está relacionada com a massa, densidade e espessura do espécime e é composta de electrões que passam através do espécime, sem colidir com a amostra ou a perda de energia durante a passagem através da amostra. Esta informação pode ser útil para a quantificação absoluta do número de átomos de um elemento específico presente na amostra ^8.

Uma vez que as amostras biológicas consistem principalmente em elementos leves que mal desviar os electrões no feixe incidente do MET, utilizando métodos de coloração de metal pesado sais têm de ser aplicadas, a fim de gerar contraste na amostra. A falta de especificidade da maior parte destes agentes de contraste e a incapacidade para visualizar mais do que uma mancha, onde é possível a especificidade tem limitado o valor de microscopia electrónica convencional no estudo do núcleo. ESI tem vantagens significativas sobre MET convencional, nomeadamente para o estudo das estruturas do núcleo da célula.É possível explorar a natureza rica em fósforo de ADN e de complexos macromoleculares contendo ARN para distinguir os complexos nucleoproteicos de complexos de proteínas e diferentes para resolver os complexos nucleoproteicos com base na sua densidade de ácidos nucleicos. O restante material biológico pode ser trabalhada com base na sua abundância de azoto. Mapeamento apenas estes dois elementos e análise de sua distribuição e abundância relativa dentro de estruturas anatômicas diferentes nos fornece uma série de informações sobre o núcleo. Por exemplo, é fácil de identificar cromatina e os ribossomas no mapa representam abundância de fósforo. O espaço interchromatin, complexos de poros nucleares, e corpos nucleares, por outro lado, pode ser facilmente detectada na imagem do mapa de azoto.

Mini sistema gerador de oxigênio singlete (miniSOG)

Enquanto ESI representa uma técnica poderosa para estudar na estrutura da cromatina situ porque tomarA vantagem dos índices característicos na composição elementar entre fósforo e nitrogênio, a composição elementar não pode normalmente ser usado para discriminar entre diferentes populações de complexos de proteínas. Os anticorpos marcados com partículas de ouro pequenas na gama nanométrica têm sido amplamente utilizados para mapear a localização de moléculas individuais. Uma vez que a partícula de ouro está geralmente ligado a um anticorpo secundário, que aparece dentro de uma circunferência de cerca de 20 nm, em torno do epitopo detectada pelo anticorpo primário. Em amostras de pós-incorporação, anticorpos pode detectar apenas os epítopos expostos à superfície das secções. Embora seja possível para provar a presença de um antigénio e relacioná-la com uma determinada estrutura anatómica da célula, a informação que é obtida é incompleta, uma vez que a maioria dos epitopos são obscurecidos por resina. As técnicas que utilizam protocolos semelhantes aos usados ​​para a microscopia de fluorescência pré-incorporação, permitir o acesso a todo antigéniostoda a profundidade da amostra, mas as etapas permeabilização que são necessários para permitir que o anticorpo para penetrar a célula normalmente requerem a remoção de membranas lipídicas e remover componentes que não podem ser fixados por aldeídos. Além disso, o fixador de aldeído preferido para a preservação ultraestrutura, glutaraldeído, comumente destrói epitopos e, consequentemente, paraformaldeído é normalmente necessária. Esta é menos eficaz a reticulação da proteína-proteína. Outra desvantagem de que os anticorpos são marcados com uma nanopartícula de ouro é que o ouro é um material muito denso de electrões que criam uma forte contraste que podem obscurecer detalhes estruturais interessantes da amostra, o que tem mais fraco contraste.

O surgimento da proteína fluorescente verde (GFP) como uma marca de proteína expressa transformou a utilização de microscopia de fluorescência para responder a perguntas em biologia celular. Marcação de uma proteína com um domínio pequeno fluorescente permite o mapeamento de sua distribuição in vivo 9. Os produtos da reacção de HRP pode também difundir para longe do local de geração de modo que a sua resolução é pior do que o método nanogold ^10. Para contornar esses problemas, o Sistema de Flash / ReAsH foi desenvolvido ^11. É constituída por proteínas de fusão recombinantes que possuem um motivo tetraciste�a. Este motivo permite a ligação deum fluoróforo biarsenic. Quando excitado, o flash ligado ou ReAsH é capaz de gerar o oxigénio singeleto altamente reactivo e portanto photoconvert diaminobenzidina (DAB) num polímero que precipita imediatamente no local das proteínas marcadas. O polímero DAB pode ser coradas com tetróxido de ósmio, que é de electrões denso e, portanto, pode ser utilizada para mapear a distribuição da proteína de fusão recombinante em MET.

Em 2011, Shu et al. ^10, apresentado o sistema miniSOG, que consiste de uma pequena 106 amino ácidos tag de fusão derivada de uma flavoproteína de Arabidopsis que é fluorescente e capaz de criar muitos radicais de oxigénio singleto quando excitado com luz azul de 448 nm. Esses radicais oxigénio singuleto pode ser usado para oxidar foto-diaminobenzidina para formar polímeros sobre e perto da superfície da proteína marcada, que é consideravelmente mais estreita do que os anticorpos marcados por imuno ^11. Enquanto o sistema de flash / ReAsH requer trazendo o flúorcromo eo diaminobenzidina para as células antes de fazer a fotoconversão, o sistema requer apenas miniSOG diaminobenzidina e luz e, além disso é de cerca de duas vezes mais eficaz na polimerização de diaminobenzidina. Aqui, miniSOG é empregada em combinação com ESI, a fim de mapear a ultra-estrutura de reparo do DNA focos.

Reparo do DNA focos (DRF)

DNA reparado rupturas de filamentos duplos representam uma séria ameaça para a célula, uma vez que pode levar a translocações e perda de informação genética. Por sua vez, isto pode levar a senescência, cancro, e morte celular. Muitas proteínas que estão envolvidas na reparação de DNA dupla vertente pausa acumular em focos que montar em torno de um DNA dupla vertente quebrar ^12-14. Embora sua função não é conhecida, eles representam o site no núcleo que contém o DNA quebra de cadeia dupla e é o local de DNA dupla vertente de reparação pausa.

Reparo do DNA foci (DRF) foram caracterizados por microscopia de fluorescência e que servem como biomarcadores para o dano ao DNA ^12,15. Eles são em massa em relação ao tamanho da ruptura de fita dupla e foram consideradas relativamente homogénea até recentes estudos de microscopia de super-resolução revelou alguma evidência de sub-compartimentação de moléculas dentro de cada foco ^16. A fim de compreender como estes locais são organizadas, é necessário visualizar todas as estruturas biológicas subjacentes em relação ao outro. Isso não pode ser alcançado por microscopia de fluorescência, mas é possível através de microscopia eletrônica de ^17,18. Aqui, é descrito um método que combina eletrônica espectroscópica de imagem com o método miniSOG para ilustrar o potencial dessa abordagem combinada para explorar a ultra-estrutura de reparo de DNA de fita dupla ruptura.

1. Geração de Celulares linhas de miniSOG

1. Cresça U2OS (osteossarcoma humano) as células num prato de 35 mm contendo 2 ml de baixo teor de glucose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que é suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO ₂ atmosfera.
2. Transfectar as células quando estas são 80% confluentes por lipofecção com qualidade transfecção purificada (A269 / 280 1,8-2,0 rácio) construções de plasmídeo contendo as sequências para miniSOG e mCherry proteínas marcadas de reparação de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção ^19. Os plasmídeos de expressão miniSOG pode ser encomendado a partir do Tsien-Lab: http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm
3. Ordenar as células que expressam a proteína recombinante com a tag miniSOG mCherry e de fluorescência de células activadas por triagem dois dias após a transfecção. Coletar célulascom intensidade de fluorescência intermediário, a fim de evitar que as células que sobre-expressam são ^20.
4. Cultura das células positivas em uma placa de 10 cm em 10 ml de meio DMEM que é suplementado com 10% de FBS e 0,6 mg / ml de agente de selecção de G418 (geneticina).
5. Depois de colónias visíveis surgiram nas placas, para tela mCherry colónias positivas utilizando um microscópio invertido de fluorescência e desenhar círculos em torno deles (na parte inferior da placa), com um marcador permanente. Use uma lente objetiva de ar de baixa ampliação (por exemplo, 10x) e escolher clones usando técnica estéril riscando cuidadosamente as colônias fora e, lentamente, chupando-os em um estéril 1000 ul ponteira.
6. Expandir as colónias seleccionadas e congelar partes delas para baixo utilizando o meio de crescimento descrito no passo 1.1 suplementado com 10% de sulfóxido de dimetilo. Testar as células para a formação DRF crescente por eles em estéreis 18 x 18 mm ² lamelas e expondo-os a2 Gy de radiação. As células irradiadas expressando estavelmente uma miniSOG mCherry marcado proteína reparação deve mostrar o padrão característico focal típico de LAP quando visualizados com um microscópio de fluorescência utilizando um filtro definido para a imagem latente mCherry.

2. Cultura celular

1. Cultura células U2OS expressam de forma estável o miniSOG e mCherry proteínas marcadas reparação sob as condições descritas na etapa 1.1. Crescer as células a 80% de confluência num prato de 35 mm de diâmetro com fundo de vidro contendo 2 ml de DMEM. Certifique-se de que a cola que liga a lâmina de cobertura para a plástica e que o plástico usado é resistente a soluções aquosas e alcoólicas e resistente à resina utilizada!
2. Antes de realizar o ensaio, o contorno de uma pequena área de aproximadamente 1 mm ² que contém células que expressam as proteínas ectópicas por raspagem com uma caneta de diamante estéril, utilizando um microscópio de fluorescência para identificar a região de interesse. Como alternativa, use um prato de vidro de fundo tchapéu contém uma lamela com um sistema de rede de pré-gravadas embutido na lamela.
   NOTA: Se estiver usando microscopia correlativo de alta qualidade combinando ESI e fluorescência imagens microscópicas ^21, certifique-se de que a espessura da lamela é compatível com os objectivos de imersão em óleo. Deve ter a espessura n ° s 1.5 (0,16-0,18 mm). Escolha de uma área perto do centro do prato para a região a ser examinada na MET, a fim de evitar problemas com a polimerização da resina, que pode ocorrer perto das bordas (ver ponto de 4,10-4,13).

3. DNA danos Indução

1. Irradiam-se as células com radiação gama, usar uma droga radiomimético, ou induzir o dano por micro irradiação laser em um microscópio confocal (por exemplo, tal como descrito em ^18,22 ou ^23).
2. Neste exemplo, irradiam-se as células com 2 e 6 Gy de irradiação gama de uma fonte de césio-137 ou radiação de laser microirradiate utilizando a Sol 405 nmID de laser de estado de um microscópio confocal após a sensibilização das células durante 20 minutos com 0,5 ug / ml de Hoechst.

Preparação 4. Amostra

1. Fixar as células com 1 ml de paraformaldeído a 4% em tampão de cacodilato CUIDADO de sódio 0,1 M ou 0,1 M em tampão de fosfato de pH 7,4 durante 30 min à temperatura ambiente no escuro.
   CUIDADO: paraformaldeído e cacodilato de sódio são tóxicas! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas.
2. Lavar as células duas vezes com 4 ml de 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou tampão de fosfato de pH 7,4.
3. Tratar as células fixadas com 2 ml de 50 mM de glicina, 5 mM de aminotriazolo e 10 mM de cianeto de potássio CUIDADO em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4) (verificar o pH!) Durante 30 min, a fim de bloquear que não reagiu grupos aldeído e para suprimir as espécies de oxigénio reactivas geradas por grupos heme, o que pode aumentar o fundo.
   CUIDADO: cianeto de potássio é extremamente tóxico! Wluvas de ouvido, trabalhar sob um capuz e eliminar as substâncias tóxicas adequadamente. A reacção é muito sensível ao pH por isso, é importante que o pH verificado e precisas.
4. Grave a área que foi selecionada na etapa 2.2 em 2D ou 3D em um microscópio de fluorescência invertido, se microscopia correlativo é desejado.
5. Prepara-se uma solução de cloridrato de CUIDADO ml 1 mg / diaminobenzidina, colocando um 10 mg de cloridrato de diaminobenzidina comprimido para um tubo de microcentrifugação de 2 ml. Adicionar 980 ul de _H2O destilada e 20 pi de ácido clorídrico concentrado (11,65 M) e misturar até que a solução é castanho claro e translúcidos. Dilui-se esta solução em 0,1 M de fosfato ou tampão de cacodilato de sódio 0,1 M a uma concentração final de 1 mg / ml, enquanto ajustando o pH com hidróxido de sódio a um pH entre 7,0 e 7,6 (pH 7,4 é recomendada).
   CUIDADO: diaminobenzidina é tóxico! Usar luvas e descartar adequadamente as substâncias tóxicas.
6. Para fotooxidação, rmoran Jr. o tampão com 2 ml de uma solução de cloridrato de 1 ml mg / diaminobenzidina em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M ou tampão fosfato. Proteger da luz esta solução e arrefecer-se em gelo a 4 ^{° C,} a fim de aumentar a solubilidade do oxigénio. Saturar a solução com oxigénio fazendo borbulhar oxigénio através da solução (usar uma mangueira que é inserida na solução e ligada a uma garrafa de oxigénio). Verifique novamente o pH e ajustar, se necessário.
   NOTA: É crucial para a reacção de foto-oxidação que o pH é entre pH 7,0 e pH 7,6.
7. Monte o prato com as células fixas com cuidado sobre um microscópio invertido de fluorescência equipado com uma lente objetiva de 40x de imersão em óleo e movê-lo para a área de interesse. Excitar a tag miniSOG com luz azul, usando filtros de cubos para GFP ou PCP. MiniSOG tem um máximo de excitação a 448 nm com um ombro a 473 nm ^{de 10.}
8. Continue com a iluminação, mesmo após a miniSOG fluorescência ha verdeé completamente desaparecido e até que o produto de foto-oxidação marrom do diaminobenzidina polimerizado surge no canal de luz transmitida. Quando o produto de oxidação é visível na maioria das células, desligar a iluminação de fluorescência para parar o foto-oxidação.
   NOTA: A foto-oxidação pode levar vários minutos, dependendo da lente objetiva, comprimentos de onda de transmissão de filtro e eficiência, e da fonte de iluminação.
9. Sufixo as células com 1 ml de glutaraldeído a 2% em cacodilato de sódio 0,1 M pH 7,4 tampão de fosfato ou tampão de pH 7,4 durante 30 min.
10. Fixar as membranas das células com 0,1% -0,5% de tetróxido de ósmio durante 20 minutos em 0,1 M de cacodilato de sódio tampão pH 7,4 ou em tampão fosfato 0,1 M pH 7,4.
    NOTA: Recomenda-se usar a menor concentração possível de tetróxido de ósmio necessário para estabilizar as membranas. Uma vez que os precipitados DAB polimerizado ter uma elevada densidade de azoto, o qual pode ser detectado directamente por ESI, um fortecoloração ósmio não é necessário identificar a proteína miniSOG-marcado e pode ser prejudicial para a ESI. Tetróxido de ósmio é muito tóxico! Trabalhar em um exaustor e descartar o lixo tóxico adequadamente.
11. Desidratar, as células através de uma série de etanol, utilizando 30%, 50%, 70%, 90%, 98% passos de etanol (100% a cada 5 min). Subsequentemente, incubar as células numa proporção de 1: 1 mistura de etanol a 100% e resina acrílica (LR branco) e colocar o prato num agitador durante 4 h, para facilitar a infiltração das células antes da incubação das células durante, pelo menos, mais 4 h em 100 resina acrílica% (LR Branco).
12. De modo a polimerizar a resina, retira a tampa de um tubo de microcentrifugação de 2 ml rotulados com uma lâmina de barbear e o revestimento da jante com acelerador de resina acrílica. Certifique-se de que o acelerador só cobre a borda e não flui para dentro do tubo. Subsequentemente, cuidadosamente encher o tubo, aproximadamente, dois terços com resina LR branco, utilizando uma pipeta de Pasteur. Tome cuidado para que a resina não entrar em contato with o acelerador no aro!
13. Remover a resina de que as células infiltradas no prato e colocar o prato de cabeça para baixo no tubo de microcentrífuga que está na posição vertical de modo a que a largura do tubo preenche quase completamente a janela de observação de vidro revestido do prato.
14. Aguardar 1 a 2 minutos para o acelerador para selar o tubo e a lamela, em seguida, inverter o tubo de modo que a resina no tubo de cobre agora as células.
15. Colocar a cápsula com o tubo num forno a 60 ° C e curar durante 12 horas.
16. Quando o bloco é curado, remover o prato com o tubo de microcentrífuga cheio de resina ligada a partir do forno e separar o tubo de microcentrífuga do prato. Facilitar a separação por ciclos de congelamento e descongelamento em nitrogênio líquido e água quente.
17. Descarte o prato fundo de vidro e corte cuidadosamente abrir o tubo de microcentrífuga com uma lâmina de barbear, a fim de eliminar o bloqueio.
18. Rotular o bloco com um marcador permanente.
19. Use uma lâmina de barbear para trim do bloco de modo que nada a não ser a região de 1 ^mm2 que contém a área previamente marcado com a caneta de diamante ou de tungsténio (ou contém a área com as células de interesse) permanece.
20. Monte o bloco em um ultramicrótomo, cortar o bloco com uma faca de aparar e cortar seções ultra-finas de cerca de 50 nm usando uma faca de diamante.
21. Pegue as seções sobre-elevada da transmissão 300 redes de malha. Estas redes têm muito pequenas barras de grade e, assim, cobrir menos células na área de interesse.
22. Brasão as seções sobre as grades com cerca de 0,2-0,4 nm de carbono, usando um aplicador de carbono para ajudar a estabilizá-los sob o feixe de elétrons do TEM.

5. Microscopia Eletrônica

1. Carregar as grades em uma TEM que esteja equipado com um filtro de energia. Depois de ajustar o microscópio e o filtro de energia de acordo com as instruções do fabricante, inspeccionar as células sobre as secções no modo de ampliação baixa (de transmissão normal) e compararlos para dados de fluorescência quando apropriado (obtido na etapa 4.4).
2. Uma vez que um núcleo com características interessantes (DNA danos trilha ou reparo de DNA focos) é encontrado, mude para o modo de filtragem de energia e gravar um mapa espessura.
   NOTA: Este procedimento inclui a gravação de um-zero perda e uma imagem não filtrada. Espessuras de até 0,3 livre percurso médio (30% dos elétrons do feixe incidente fica espalhada por amostra) são finas o suficiente para gerar bons mapas elementares.
3. Mapas relação ficha do fósforo e nitrogênio elementos usando o software que controla o filtro de energia do microscópio usado. Grave as imagens mapa fósforo pós ponta a 175 eV perda de energia com a largura da fenda de 20 eV e pré-edge imagens em 120 eV perda de energia, também com uma largura da fenda de 20 eV. Para os mapas de nitrogênio, ficha imagens pós ponta em 447 eV com a largura da fenda de 35 eV e pré-edge imagens em 358 eV, também com uma largura da fenda de 35 eV.
   Observação: Uma vez que o teor dos elementos clonados (fosforus e nitrogênio) é relativamente baixa (aprox. 1%), escolha "Proporção da imagem" (mapa elementar qualitativa) sobre o "método 3 janela" (quantificar mapa elementar), a fim de gerar imagens com uma melhor relação sinal-ruído.

6. Processamento de Imagem

1. Abra os mapas de relação elementares em um software de processamento de imagem que pode lidar com o formato de arquivo das imagens adquiridas (por exemplo, Micrografia Digital). Copie o nitrogênio mapa para o canal vermelho eo mapa de fósforo para o canal verde de uma imagem RGB, em seguida, sobrepor e alinhar os mapas.
2. Exportar a imagem composta como um arquivo de imagem formato de arquivo (TIFF). Abra a imagem em um software de processamento de imagem que podem usar camadas (por exemplo, Photoshop).
3. Ajustar a gama dinâmica de cada canal por rescaling a valores mínimos e máximos na imagem para um conjunto de dados de 8 bits (0 a 255).
4. Subtrair o teor de fósforo a partir do nitrogênio mapa (usando oJanela "camadas"), a fim de gerar um mapa qualitativo, que mostra a distribuição da proteína.
5. Converter os mapas do ácido nucleico (fósforo) e a proteínas (azoto) criado na etapa anterior em "cores indexadas" e criar uma tabela de pesquisa amarelo no espaço de cores CMYK para o mapa que mostra a distribuição do ácido nucleico e uma tabela de pesquisa ciano para mostrar o mapa não-nucleoproteína. As cores são escolhidas para gerar o máximo contraste entre os dois mapas elementares.
6. Crie uma nova imagem e importar os mapas que mostram as distribuições de fósforo e proteínas como diferentes camadas. Use o modo de transparência "screen", a fim de ver as duas camadas sobrepostas umas sobre as outras.
7. Abra a imagem perda de zero adquirido na etapa 5.2. Esta imagem representa uma imagem da área gravada que se parece com uma imagem TEM convencional, mas contém apenas os elétrons que passaram através do espécime sem colidir com o modelo. Exportaçãoesta imagem como uma imagem TIFF.
8. Abra a imagem zero perda exportado em um editor de fotos e copiá-lo para a camada superior da imagem que mostra o mapa elementar. Alinhe a imagem usando o modo de transparência "tela".
9. Opcionalmente, o limiar de imagem perda de zero para o segmento de sinal que se origina a partir do miniSOG. Adicionar a imagem resultante como uma camada separada, tal como descrito acima.

ESI

Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor diferente, uma vez que os ribossomas pré-montados já contêm quantidades elevadas de proteína, que é rico em azoto, em adição ao ARN, que é rico em fósforo. A cromatina periférica reside como uma fina camada na fronteira do núcleo e poros nucleares podem ser vistos como estruturas ricos em nitrogênio, que interrompem a cromatina periférica. Muitas vezes, a lâmina pode ser visto como uma camada azul muito fina fora da cromatina periférica. No citoplasma, muitas pequenas partículas ricas em fósforo podeser visto. Estes podem ser identificados como ribossomas com base no seu tamanho, abundância e localização fora do núcleo. O espaço interchromatin pode ser visto como uma área rica em proteína localizada entre a cromatina. Este contém corpos e áreas ricas em pequenos sinais de amarelo, tal como partículas de ribonucleoproteína e aglomerados de grânulos de ribonucleoproteína (Figura 2) nucleares. Estas últimas são denominadas interchromatin aglomerados de grânulos e são caracteristicamente enriquecido em proteínas necessárias para o pre-mRNA splicing. Figura 1B, C e D ilustram a aparência de outras estruturas conhecidas, tais como cromossomas mitóticos, centrossomas, mitocôndrias e centrómeros. Na Figura 2, os passos utilizados para gerar imagens coloridas compostos a partir das matérias mapas relação elementares encontram-se resumidos. Mesclando o mapa de fósforo (verde) eo mapa de nitrogênio (vermelho) no espaço de cores RGB (linha superior) permite uma melhor avaliação dos montantes desses elementos presentes na amostra. However, subtraindo o sinal de fósforo para esgotar a contribuição de estruturas que contêm ácidos nucleicos a partir do nitrogênio mapa para produzir o mapa proteína (ciano) e fundindo-a com o mapa de fósforo (amarelo) em CYMK espaço de cor fornece uma representação visual mais distinta da nucleoproteína e não-nucleoproteína (linha inferior). Isso permite que os dados a serem mais facilmente interpretados por indivíduos não estão familiarizados com a tecnologia.

Laser células que expressam microirradiated MDC1, 53BP1 e Rad52

Devido à definida pelo utilizador tamanho, forma e localização das faixas danos laser, a região de deposição de DAB nas células de laser microirradiated são muito fáceis de encontrar na MET quando se utiliza o sistema de miniSOG. As fotografias tiradas no modo de transmissão de baixa ampliação (ou seja, TEM brightfield convencional) revelar as faixas danos característicos e pode ser comparado com os dados que foi gravado com um microscópio de fluorescência antes da incorporação.Isto é especialmente útil se microscopia correlativo se destina, pois permite a fácil identificação e realocação de núcleos individuais. (Figura 2-4).

O primeiro exemplo (Figura 3) mostra uma linha de células U2OS que expressam estavelmente MDC1 miniSOG-mCherry. Numa experiência microirradiation laser, o recrutamento do MDC1 contendo as marcas e miniSOG mChrerry foi muito semelhante com versões de GFP esta proteína (dados não apresentados). Que fixa as células de 1 hora após a indução danos ao DNA e preparação da amostra para o TEM, as faixas danos MDC1 foram facilmente identificados nas seções ultra-finas em modo TEM normal, como listras escuras através dos núcleos, o que correspondeu muito bem aos dados de fluorescência ( Figura 3-5). Ao olhar para a distribuição da proteína, um claro aumento em sinal de nitrogênio pode ser observado nos locais danificados por raios laser. Tem de ser salientado aqui que isso é causado principalmente pela diami polimerizado nobenzidine, que é rico em azoto e amplifica o sinal da proteína de reparação miniSOG etiquetado, em vez de unicamente através da acumulação de proteínas de reparação de danos na faixa. Comparando-se a estrutura da cromatina no resto do núcleo com a estrutura nas faixas danos mostra uma diferença clara. A cromatina danificado (que é mostrado nas linhas a tracejado na Figura 3) aparece mais descondensada em contraste com a cromatina não-irradiadas, que ocorre em cadeias espessas no nucleoplasma. Dentro das faixas danos, corpos nucleares (200-300 nm) (destacados por setas na Figura 3 II2, IIb, IIc e IIIa), que são ricos em proteínas MDC1-miniSOG mas livre de ácido nucleico também pode ser observada. Seria muito desafiador para definir esses corpos nucleares como free-estruturas de cromatina sem essa técnica. Ele também sugere um nível adicional de complexidade para sites de danos que não são previstos pela bioquímica conhecida de MDC1.

A partir de experiências com construções de Rad52-GFP, sabe-se que Rad52 irá formar pequenas microcompartements brilhantes 24 ao longo de uma faixa dano induzido por laser. Devido ao limite de resolução de microscópios de luz convencionais, tem sido claro como grande estas estruturas realmente são e como eles se relacionam com o DNA danificado. Olhando para a imagem TEM de núcleos U2OS irradiados com laser que expressam constitutivamente Rad52-miniSOG-mCherry, o tamanho desses corpos foram medidos para a média (150-250 nm). isto éainda mais surpreendente de olhar para estes focos com ESI. Em contraste com os exemplos anteriores, os focos Rad52-miniSOG-mCherry parecem ser organizados de maneira muito diferente ao longo da pista de danos e parecem ser estruturas do corpo semelhante nucleares compactos que são compostos de proteínas e não têm ácidos nucleicos detectáveis ​​no seu interior. Com base na observação da relação / proteína-ácido nucleico nas áreas danificadas obtidos com a nossa abordagem miniSOG e ESI combinados, sugere-se que a reparação do ADN pode tomar lugar na superfície dos focos em vez de no interior.

A imagem inferior na Figura 5 mostra os resultados semelhante à da Figura 3-III. A cromatina na área danificada parece ser mais descondensada em comparação com a cromatina nas áreas não irradiadas (ver área delineada por traços vermelhos).

Células irradiadas Gamma

Enquanto micro-irradiação laser é uma ferramenta conveniente para quicklproteínas de teste y que contêm um marcador fluorescente para o recrutamento para os locais de lesões de DNA, ele cria grandes quantidades de dano complexo (rupturas de filamentos duplos, rupturas dos filamentos individuais, dano base, e dímeros cyclopyrimidine) 25. A fim de estudar os compartimentos que formam em torno de DNA rupturas de filamentos duplos mais diretamente, examinamos DRFS que formam em torno DSBs individuais, expondo as células a radiação gama.

As células U2OS que expressam estavelmente 53BP1-miniSOG-mCherry foram expostos a 2 Gy de irradiação gama e fixados metade de uma hora após a irradiação. O padrão característico de grandes focos distribuídos por todo o nucleoplasma pode ser observado (Figura 6Ia). Depois de foto-oxidação de diaminobenzidina, manchas escuras emergentes nas posições em que os sinais fluorescentes mCherry foram localizados em micrografias de fluorescência poderia ser visto nas microfotografias electrónicas (Figura 6Ib e C). Estes pontos podem ser correlacionados com MET imagensque foram levados a baixa ampliação (figura 6Id ee). As imagens ESI destes focos, que parecia ter cerca de 1-1,5 m de diâmetro, mostrou uma estrutura interessante. Finos fios de cromatina parecia ser intercaladas com 53BP1 proteína de aproximadamente duas vezes a espessura.

Noutras experiências, as células foram expostas a uma quantidade maior de radiação e fixado em posteriores intervalos de tempo (após 3 h e 6 h, respectivamente), a fim de gerar os focos maiores e facilitar a localização, nas secções ultrafinas (Figura 7). Porque estamos aptos para mapear separadamente nucleoproteína e proteína, ESI revela que a estrutura dos focos aparecem para reorganizar ao longo do tempo. A quantidade relativa de proteína 53BP1 no foco parece aumentar ao mesmo tempo a cromatina assume uma posição mais periférica.

Desde 53BP1 focos também aparecem em células como "focos crípticos" em células G1 em locais de sub-repetição não irradiadosd 26,27 ADN, esses focos também foram fotografadas. Estes focos crípticos parecem abrigar quantidades elevadas de proteínas em relação aos focos radiação induzida e mostram uma estrutura regular interessante da cromatina.

Assim, visualizando componentes de reparação de ADN, utilizando o método de focos miniSOG ajuda a identificar as regiões de danos no DNA e mapear a distribuição da proteína de reparação marcado em relação à cromatina.

Figura 1. Visão geral das estruturas que podem ser observados em uma imagem ESI Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(A) ESI imagem de um rato de fibroblastos embrionárias. Cumes de cromatina (amarelo) estão rodeados por nucleoplasm (ciano) encher o interchromatin space. O núcleo é rodeado por heterocromatina periférica e chromocenters (inferior esquerdo) que são interrompidos por complexos de poros nucleares (ciano). O nucléolo podem ser claramente separados por sua cor. Isto é devido ao facto de que a quantidade de proteínas em relação a ácido nucleico é mais elevada na estrutura nucleolar do que é na cromatina. Do lado de fora do núcleo, mitocôndria e ribossomas (ricos em ácido nucleico) pode ser facilmente identificado.

(B) Imagem de um núcleo e os centrossomas (ver setas), que pode ser visto como partículas ocas ricas em proteínas na parte superior esquerda da imagem.

Secção (C) Cruz através de uma placa metafásica. Os cromossomos metafásicos altamente condensada ter alinhado em um disco que se estende a partir do canto superior esquerdo para o canto inferior esquerdo. Elevadas concentrações de azoto são visíveis na superfície de alguns cromossomas. Estas áreas são as cinetócoros (ver setas).

Figura 2. Criação de um multi-color ESI imagem

(Linha superior) As primeiras duas imagens na linha mostram os mapas de relação de fósforo e nitrogênio. A última imagem na linha superior mostra esses mapas elementares sobrepostos no espaço de cor RGB. Estruturas amarelas representam nucleoproteins, refletindo a presença de ambos fósforo e nitrogênio.

(Linha inferior) A primeira imagem mostra o mapa de fósforo, o que revela essencialmente a distribuição de ácido nucleico na amostra. A imagem do meio mostra a distribuição das empobrecida em ácido nucleico / stru negativo ctures. Foi calculado subtraindo-se o mapa de fósforo a partir do mapa de azoto. A imagem inferior direita mostra uma mesclagem do mapa de ácido nucleico e o mapa de proteínas no espaço de cores subtrativas. Este composto da cor deve ser utilizado para auxiliar na identificação de estruturas individuais e a classificá-las como nucleoproteína ou não nucleoproteína. As informações quantitativas sobre a abundância fósforo e nitrogênio deve ser recolhida visualmente a partir do fósforo e nitrogênio líquido líquido mapas em escala de cinzentos ou a partir de compostos gerados pela utilização de cores aditivas, como na linha superior.

Figura 3. Laser micro irradiação de células que expressam estavelmente MDC1 U2OS-miniSOG-mCherry. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(II) A área, destacada por um quadrado verde em Ic foi ampliado e mostrado no modo de transmissão normal (IIa) e ESI (IIb). IIc mostra uma sobreposição da imagem de ESI com o sinal da faixa de danos. O sinal de dano faixa foi obtido por limiarizar a imagem superior.

(III) Exemplos de a estrutura de laser de microcromatina -irradiated e cromatina fora da área afectada pelo laser.

Figura 4. Laser micro irradiação de células que expressam estavelmente 53BP1-miniSOG-mCherry. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Coluna da esquerda: (A) da fluorescência, (B) convencional TEM e (C), ESI imagem dos mesmos micro núcleo de laser irradiados.

Coluna da direita: (D) convencional TEM, (E) e ESI (F) Overlay da imagem ESI com o sinal miniSOG que foi segmentado por limiar de (D) (veja o passo 6.10)

(A) Sobreposição de uma imagem de fluorescência de uma imagem TEM de baixa ampliação mostrando um laser microirradiated U2OS núcleo com uma pista de danos na parte inferior esquerda com.

(B) Imagem representativa de microscopia confocal de fluorescência do laser irradiado um micro núcleo Hoechst-corados (azul) expressando Rad52-miniSOG-mCherry mostrando o padrão característico de pequenos focos ao longo da pista de danos (sinal vermelho).

(C) convencional MET, (D) ESI, (F) e o sinal de ESI segmentada a partir de (C) Ampliação elevada do núcleo mostrado no canto superior esquerdo.

Imagem (L) ESI de outro núcleo U2OS que expressam estavelmente Rad52-miniSOG-mCherry mostrando uma faixa dano induzido por laser no contexto de todo o núcleo.

Figura 6. células que expressam estavelmente 53BP1 U2OS-miniSOG-mCherry irradiado com 2 Gy e fixado após 30 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

(I) a) imagem de fluorescência mostrando a focos 53BP1 induzida por irradiação gama. b) Transmitida imagem luz após fotopolimerização. c) Overlay da fluorescência com a imagem de luz transmitida. d) imagem baixa ampliação TEM (a listra preta é um bar grelha TEM). e) Overlay da imagem fluorescente a imagem baixa ampliação com TEM.

Foco (II) de danos marcado com um asterisco na luz transmitida imagem gravada em MET normal e no modo de ESI. a) perda de-Zero, b) ESI, c) O fósforo, d) Proteína e) Overlay ESI e sinal segmentada a partir da imagem de perda de zero.

Foco (III) Danos marcado com uma cruz a imagem de fluorescência registado na TEM normal e no modo ESI. a) perda de-Zero, b) ESI, c) O fósforo, d) Proteína e) Overlay ESI e sinal segmentada a partir da imagem de perda de zero.

Figura 7. Alterações na estrutura de focos entre focos após diferentes tempos de irradiação. < / strong> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Células U2OS 53BP1 miniSOG mCherry expostos a 6 Gy de radiação gama fixado após 3h (1A-E, FJ) e 6h (2A-E, FJ), respectivamente. 3 mostra um unirradiated núcleo U2OS 53BP1 miniSOG mCherry mostrando um foco críptico (AE). ESI imagens são apresentadas na ordem ESI (ácido nucleico e proteína), ácido nucleico (por si só), proteína (por si só), ESI (ácido nucleico e proteína) + segmentado sinal miniSOG.

Figura 8. focos de reparação do ADN ainda são visíveis no modo de transmissão convencional, quando pós-fixação com tetróxido de ósmio é omitido. "target =" _ blank arge.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Secção ultrafinos (50 nm) de um núcleo U2OS mostrando dois focos 53BP1 a partir de uma amostra que não foi tratada com tetróxido de ósmio. (A) Em modo TEM convencional, é possível ver locais corados pelo polímero DAB mesmo sem aumento de contraste com o mancha heavy metal. (B) O contraste dos focos pode ser ainda aumentada tomando imagens de perda de zero (filtrando fora todos os elétrons que a origem de eventos de espalhamento plural).

Figura 9. Determinação das definições da janela de energia ideais para mapeamento de fósforo

(A) Elemental rácio mapa gravado para o fósforo com pós borda a 155 eV e pré-edge em 120 eV.

(C) Calculando mapas relação de fósforo a partir de uma janela de pré-aresta constante a 120 eV a perda de energia e uma janela variável pós-140-200eV borda que vão desde a perda de energia, a fim de determinar a melhor combinação que é, em contraste. A diferença de intensidade dos mais brilhantes eo dimmestpixel em uma linha-scan que mede sobre o mesmo fósforo região pobre rico e fósforo mostra mais altos valores de contraste dinâmico (intervalo) quando uma imagem pós-edge de 175 eV perda de energia foi escolhido.

Os autores não têm nada a divulgar.