Artigo de método
A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.
Os limites para a resolução óptica e o desafio de identificar populações específicas de proteínas em microscopia eletrônica de transmissão têm sido obstáculos na biologia celular. Muitos fenómenos não pode ser explicado por meio de análise in vitro em sistemas simplificados e necessitam de informação estrutural adicional in situ, em particular na gama entre 1 nm e 0,1 um, a fim de ser completamente compreendida. Aqui, imagens espectroscópicas elétron, uma técnica de microscopia eletrônica de transmissão que permite o mapeamento simultâneo da distribuição de proteínas e ácidos nucleicos, e uma tag de expressão, miniSOG, são combinados para estudar a estrutura e organização do DNA de fita dupla focos reparo ruptura.
Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos 1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de de....
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1. Geração de Celulares linhas de miniSOG
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ESI
Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor diferen.......
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ESI pode servir como uma ferramenta excelente para examinar diferentes estados de cromatina e ribonucleoproteínas no núcleo, porque é capaz de mapear especificamente áreas que são ricos em fósforo. É profundamente aumenta a quantidade de detalhe que pode ser obtida por um microscópio electrónico, e não é dependente de métodos de contraste não específicos. Uma desvantagem de ESI é que ele requer secções mais finas do que MET convencional com a mesma voltagem de aceleração. Isso pode ser superado por trabalhar com cortes .......
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Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecemos ao Dr. Roger Tsien por nos fornecer as construções miniSOG. Dr. Xuejun Sun pela ajuda com o TEM. Lisa Lem e Peter Shipple do Cross Cancer Institute pelo fornecimento de oxigênio. Hilmar Strickfaden possui uma bolsa de pós-doutorado da Alberta Cancer Foundation e foi apoiado pelo Bayrische Forschungsallianz. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e da Fundação do Câncer de Alberta.
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| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Pratos de fundo de vidro de 35 mm | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| Pratos de fundo de vidro de 35 mm em grade | MatTek | P35G-2-14-CGRD | não feito para objetivas de imersão |
| LR Branco: resina de acrílico | emsdiasum | 14381 | |
| LR Acelerador branco | emsdiasum | 14385 | |
| 3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mg | comprimidos Sigma | D5905 | |
| Slim Bar Grids 300 Mesh | SPI | 1161123 | |
| Caneta de laboratório de ponta de tungstênio | emsdiasum | 41148 | |
| Tetróxido de ósmio | emsdiasum | 19100 | |
| Carbon Coater 208 carbono | Cressington | ||
| Ultra micrótomo Leica EM UC6 | Leica | ||
| Photoshop CS5 | Adobe | pode até funcionar com versões mais antigas | |
| Digital Micrograph V.2.30 | Gatan | pode até funcionar com versões mais antigas | |
| Hoechst 33342 | Sigma | H-1399 | |
| Effectene | Quiagen | ||
| MiniSOG-Constructs | Tsien-Lab | tsienlab@yahoo.com | |
| MDC1 miniSOG mCherry | |||
| 53BP1 miniSOG mCherry | |||
| Rad52 miniSOG mCherry | |||
| fonte de radiação de césio 137 "MARCA 1" | ( J.L. Pastor & Associado) | ||
| ImageJ/FiJi | open source | http://fiji.sc/Fiji | |
| tubos Eppendorf de 2 ml | Fisherbrand | 05-408-146 | |
| Faca de Diamante ultra 35° | Diatome | ||
| ultratrim | Diatome | ||
| Cacodilato de Sódio trihidratado | emsdiasum | 12300 | Cuidado Tóxico! |
| Glutaraldeído EM Grau 8% | emsdiasum | 16020 | Cuidado Tóxico! |
| Fosfato de sódio dibásico | emsdiasum | 21180 | |
| Fosfato de sódio monobásico | emsdiasum | 21190 | |
| Paraformaldeído | emsdiasum | 19202 | |
| Tetróxido de ósmio solução a 4% | emsdiasum | 19150 | |
| Micoscópio de fluorescência invertida Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Fisherbrand | A142-212 | ||
| Solução de Hidróxido de Sódio 10M | Fluka | 72068 | |
| Oxigênio | Medigas | ||
| 3-Amino-1,2,4-triazol | Sigma | A8056 | |
| Cianeto de potássio | Sigma | 207810 | Cuidado Tóxico! |
| Etanol | emsdiasum | 15058 | Cuidado Tóxico! |
| Lâmina de barbear de aço carbono de borda única | emsdiasum | 71960 | Cuidado afiado! |
| DMEM | Sigma | D 5546 | |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | |
| G418 | Life Technologies | 11811-023 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão 200 kV | JEOL | 2100 | |
| GIF Tridiem 863 Filtro de energia | Gatan |
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