Artigo de método

Visualização de miniSOG Proteínas Tagged reparo de DNA em combinação com Electron espectroscópica Imagem (ESI)

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DOI:

10.3791/52893

24 de setembro de 2015

Neste artigo

Resumo

A imagem espectroscópica eletrônica pode gerar imagens e distinguir ácido nucléico de proteína em resolução nanométrica. Ele pode ser combinado com o sistema miniSOG, que é capaz de rotular especificamente proteínas marcadas em amostras de microscopia eletrônica de transmissão. Ilustramos o uso dessas tecnologias usando focos de reparo de quebra de fio duplo como exemplo.

Resumo

Os limites para a resolução óptica e o desafio de identificar populações específicas de proteínas em microscopia eletrônica de transmissão têm sido obstáculos na biologia celular. Muitos fenómenos não pode ser explicado por meio de análise in vitro em sistemas simplificados e necessitam de informação estrutural adicional in situ, em particular na gama entre 1 nm e 0,1 um, a fim de ser completamente compreendida. Aqui, imagens espectroscópicas elétron, uma técnica de microscopia eletrônica de transmissão que permite o mapeamento simultâneo da distribuição de proteínas e ácidos nucleicos, e uma tag de expressão, miniSOG, são combinados para estudar a estrutura e organização do DNA de fita dupla focos reparo ruptura.

Introdução

Apesar dos avanços significativos em microscopia de luz nos últimos anos 1, biólogos celulares continuam a sofrer de uma lacuna na resolução. Isto limita a compreensão das relações estrutura-função em processos celulares fundamentais que envolvem a interacção coordenada entre complexos macromoleculares (por exemplo, na remodelação da cromatina, a reparação do ADN, a transcrição de ARN e ADN de replicação). Embora microscópios de electrões de transmissão (MET) é fornecer a resolução necessária, tem sido um desafio para definir estes processos estruturalmente por causa da incapacidade de marcar as proteínas específicas, enquanto também é capaz de de....

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Protocolo

1. Geração de Celulares linhas de miniSOG

  1. Cresça U2OS (osteossarcoma humano) as células num prato de 35 mm contendo 2 ml de baixo teor de glucose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que é suplementado com soro a 10% de bovino fetal (FBS) a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 atmosfera.
  2. Transfectar as células quando estas são 80% confluentes por lipofecção com qualidade transfecção purificada (A269 / 280 1,8-2,0 rácio) construções de plasmídeo contendo as sequências para miniSOG e mCherry proteínas marcadas de reparação de acordo com o protocolo do fabricante do reagente de transfecção 19. Os plasmídeo....

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Resultados

ESI

Comparando as imagens ESI do núcleo (Figura 1) com as imagens de TEM convencionais (por exemplo, a Figura 7-1) revela um aumento dramático nas estruturas anatómicas que podem ser facilmente distinguidas. As cristas de cromatina aparecem em amarelo e é bastante fácil de identificar os chromocenters em células de ratinho. Nucléolos pode ser facilmente distinguida da cromatina por sua estrutura rodada e cor diferen.......

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Discussão

ESI pode servir como uma ferramenta excelente para examinar diferentes estados de cromatina e ribonucleoproteínas no núcleo, porque é capaz de mapear especificamente áreas que são ricos em fósforo. É profundamente aumenta a quantidade de detalhe que pode ser obtida por um microscópio electrónico, e não é dependente de métodos de contraste não específicos. Uma desvantagem de ESI é que ele requer secções mais finas do que MET convencional com a mesma voltagem de aceleração. Isso pode ser superado por trabalhar com cortes .......

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Roger Tsien por nos fornecer as construções miniSOG. Dr. Xuejun Sun pela ajuda com o TEM. Lisa Lem e Peter Shipple do Cross Cancer Institute pelo fornecimento de oxigênio. Hilmar Strickfaden possui uma bolsa de pós-doutorado da Alberta Cancer Foundation e foi apoiado pelo Bayrische Forschungsallianz. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e da Fundação do Câncer de Alberta.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pratos de fundo de vidro de 35 mmMatTekP35G-1.5-14-C
Pratos de fundo de vidro de 35 mm em gradeMatTekP35G-2-14-CGRD não feito para objetivas de imersão
LR Branco: resina de acrílicoemsdiasum14381
LR Acelerador brancoemsdiasum14385
3,3′-Diaminobenzidina tetracloridrato 10 mgcomprimidos SigmaD5905
Slim Bar Grids 300 MeshSPI1161123
Caneta de laboratório de ponta de tungstênioemsdiasum41148
Tetróxido de ósmioemsdiasum19100
Carbon Coater 208 carbonoCressington
Ultra micrótomo Leica EM UC6Leica
Photoshop CS5Adobepode até funcionar com versões mais antigas
Digital Micrograph V.2.30Gatanpode até funcionar com versões mais antigas
Hoechst 33342SigmaH-1399
EffecteneQuiagen
MiniSOG-ConstructsTsien-Labtsienlab@yahoo.com
MDC1 miniSOG mCherry
53BP1 miniSOG mCherry
Rad52 miniSOG mCherry
fonte de radiação de césio 137 "MARCA 1" ( J.L. Pastor & Associado)
ImageJ/FiJiopen sourcehttp://fiji.sc/Fiji
tubos Eppendorf de 2 mlFisherbrand05-408-146
Faca de Diamante ultra 35°Diatome
ultratrimDiatome
Cacodilato de Sódio trihidratadoemsdiasum12300Cuidado Tóxico!
Glutaraldeído EM Grau 8%emsdiasum16020Cuidado Tóxico!
Fosfato de sódio dibásicoemsdiasum21180
Fosfato de sódio monobásicoemsdiasum21190
Paraformaldeídoemsdiasum19202
Tetróxido de ósmio solução a 4%emsdiasum19150
Micoscópio de fluorescência invertida Axiovert 200MZeiss
FisherbrandA142-212
Solução de Hidróxido de Sódio 10MFluka72068
OxigênioMedigas
3-Amino-1,2,4-triazolSigmaA8056
Cianeto de potássioSigma207810Cuidado Tóxico!
Etanolemsdiasum15058Cuidado Tóxico!
Lâmina de barbear de aço carbono de borda únicaemsdiasum71960Cuidado afiado!
DMEMSigmaD 5546
FBSLife Technologies16000-044
G418Life Technologies11811-023
DMSOSigmaD2650
Microscópio Eletrônico de Transmissão 200 kVJEOL2100
GIF Tridiem 863 Filtro de energiaGatan
Faca de Corte Ácido clorídrico

Referências

  1. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).
  2. Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. Stoichiometric analysis of protein....

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